核酶研究的新进展

核酶是有很大发展潜力的遗传操作工具 ,人们不但希望利用它的核苷酸序列特异的酶切活性研究特定基因的功能 ,寻找疾病治疗的新靶标 ,也希望能够开发出具治疗作用的核酶剂。随着人类基因组计划草图的完成 ,核酶潜在的应用前景显得更加诱人。问题是如何提高核酶在体内的活性 ,这成了近年来的一个研究热点。本文从核酶的设计、转移、表达等方面介绍了近年来的研究进展。     

PDGF受体β亚单位2个不同切割位点核酶的体外切割效率的比较

目的研究针对大鼠PDGF受体β亚单位基因2个不同切割位点核酶的体外切割活性并加以比较。方法应用计算机对大鼠PDGF受体β亚单位mRNA二级结构进行模拟,设计针对PDGF受体β亚单位mRNA45位CUU和252位CUU的锤头状(Hammerhead)核酶(Ribozyme)基因RZ1和RZ2,定点克隆于自我切割型核酶载体P1．5的5'-cis核酶和3’-cis核酶之间;将大鼠PDGF受体β亚单位cDNA 608 bp的PCR片段克隆于pGEM-T载体T7启动子下游,在T7启动子作用下分别体外转录成RZ1、RZ2和706nt的PDGF受体β亚单位mRNA,比较RZ1和RZ2对706 nt的PDGF受体β亚单位mRNA的切割活性的差异。结果RZ1在体外有较高的切割活性,而RZ2在体外无切割活性。结论提示在应用核酶技术进行基因治疗时,应选择有效的核酶切割位点,以达到有效的治疗目的。     

核酶技术简介

80年代初美国科罗拉多大学博尔分校的 Thomas Cech和耶鲁大学的 Sidney Alyt-man各自独立地发现具有生物催化功能的RNA,即核酶 ribozyme。核酶是一种能序列特异性地剪切 RNA的 RNA分子。很好设计的核酶能与被选择的 m RNA片段特异性地结合 ,这种结合能够通过多种机制特异地阻断 m RNA的表达。因此 ,它对于 RNA结构的研究以及异常基因表达所致疾病的治疗具有重要意义。近年来 ,核酶领域以令人惊讶的速度不断发展 ,大量文献得以积累 ,本文旨在对几年来的进展作一简要的回顾。1　核酶的结构目前研究得较多的有两种核酶 ,锤头核酶 (ham…     

丁型肝炎病毒基因组RNA包埋锤头状核酶的活性研究

目的　探讨用丁型肝炎病毒 (HDV)基因组来包埋HBV靶向性核酶对核酶体内外活性产生的影响。方法　用和HBV靶基因体外转录产物在不同反应条件下温育对HDV 核酶重组体的体外切割活性定量分析 ;与HBV基因组共转染Huh 7细胞以考察核酶在细胞内对HBV基因表达水平的抑制。结果　体外实验发现 ,温度及核酶和底物的二级结构对包埋于HDV序列的核酶体外切割活性均有较大的影响。提高反应温度或消除二级结构都可使HDV包埋核酶的体外活性达到明显效果 ,与相同条件的裸露核酶活性没有太大差异。而细胞实验则表明 ,活性明显优于裸露核酶 ,可以将靶基因的表达抑制到极低水平。结论　HDVRNA序列对所包埋核酶体外活性有一定的抑制作用 ,在细胞内则使核酶的活性得到显著增强     

反式作用丁型肝炎病毒核酶体外切割活性的研究

丁型肝炎病毒 (ＨＤＶ)在复制过程中 ,基因组ＲＮＡ及复制产生的抗基因组ＲＮＡ均具有自我裂解的活性———核酶(Ｒｉｂｏｚｙｍｅ)活性。ＨＤＶ核酶是在所发现的核酶类型中唯一在人体的细胞中具有天然裂解活性的核酶。通过对ＨＤＶ核酶的研究 ,已经确定了 85ｎｔ长度的核酶活性区 ,并且其二、三级结构也有了阐明。本文根据ＡｎｎｅＴ等人提出的ＨＤＶ核酶自我裂解时的假结样 (ｐｓｅｕｄｏｋｎｏｔ ｌｉｋｅ)二级结构 ,将 85ｎｔ的ＨＤＶ核酶从其Ｊ(1/ 2 )连接处分成两段 ,一段作为核酶 ,一段作为底物 ,设计ＨＤＶ核酶的反式作用形式 ;将反…     

Ⅰ型内含子核酶的研究进展

核酶具有特异识别和切割靶 RNA的特点 ,从而可以抑制一些特异基因产物的表达 ,而 型内含子核酶 ,不但具有剪切功能 ,而且可以进行顺式剪接及反式剪接。随着人们对 型内含子核酶的功能结构也有了进一步认识 ,相继用 型内含子核酶对 p5 3突变 m RNA及镰形红细胞贫血等遗传性疾病致病基因 m RNA的修复做了大量的研究 ,并取得了一定的成果     

抗DEN-2基因核酶的克隆及其体外切割活性的研究

目的：探讨核酶抗登革病毒活性。方法：根据DEN－2基因结构的特点，按照锤头状核酶的结构模型和作用模式，设计，合成针对172－174GUC位点的核酶基因；定向插入质粒pGEM-3Zf( )的Sac I和Sal I位点之间；核酶基因克隆和DEN－2靶基因克隆分别进行体外转录，生成核酶的靶RNA，体外进行切割反应。结果：核酶与登革病毒靶序列体外产物电泳 见预期切割条带。结论：该核酶具有切割相应靶RNA的活性，可进一步用于细胞内核酶抗登革病毒的研究。     

抗转化生长因子β1的U1 snRNA嵌合型核酶体外剪切作用

目的： 研究抗转化生长因子β₁ U1snRNA嵌合型锤头状核酶的细胞外切割活性。方法： 通过计算机设计针对TGFβ₁的锤头状核酶，然后把合成的核酶片段克隆入含有U1 snRNA启动子/增强子和终止子的U1 snRNA核酶载体中。通过RT-PCR扩增获得TGFβ₁的部分基因片段，将其克隆入T载体中T7启动子的下游，体外转录获得核酶和靶RNA，转录过程中掺入同位素，通过变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化回收。［³²P］标记的核酶与靶RNA在不同条件下进行切割反应，变性PAGE电泳，放射自显影，分析反应结果。结果： 活性的U1 snRNA嵌合型核酶（U1Rz803）在生理温度下具有良好特异的切割活性； 而点突变型核酶U1Rz803m没有切割活性，因此这些结果显示U1Rz803设计是正确的。结论： 本研究中制备的U1Rz803具有良好的特异催化切割活性。U1 snRNA嵌合型核酶U1Rz803有望在胞内抑制TGFβ₁的表达，为研究转化生长因子（TGF）β₁在造血调控中的作用机制提供有效工具。     

脱氧核酶及其应用进展

脱氧核酶是利用体外分子进化技术合成的一种具有催化功能的单链DNA片段 ,具有高效的催化活性和结构识别能力。迄今为止 ,已发现大量具有催化功能的脱氧核酶。其中具有RNA切割活性的脱氧核酶 ,能催化RNA特定部位的切割反应 ,从mRNA水平对基因灭活 ,从而调控蛋白质的表达 ,可能成为治疗肿瘤、病毒感染性疾病以及其它相关疾病 ,基因功能研究 ,核酸突变分析等的新型工具。     

抗乙型肝炎病毒HDV核酶的研究新进展

乙型肝炎病毒(HBV)是严重威胁人类健康的一种病毒,特别是在我国约有1.2亿人为HBV携事业者,占世界的1/3.对已感染HBV者,常用的化学及免疫疗法通常无效.今年来,研究者试图利用反义技术,通过在基轩表达水平上抑制HBV的复制,来达到治疗HBV感染的目的.核酶是具有RNA裂解活性的RNA分子,能特异地结合并切割靶RNA分子.HDV核酶唯一在人体细胞天然具有裂解活性的核酶类型,研究将HDV核酶作为HBV的反义抑制剂可能有着其独特的优势.本文就HDV核酶靶位点的筛选、病毒载体导入系统、靶向性分子的构建等热点问题的研究新进展予以综述.     

抗乙型肝炎病毒HDV核酶的研究新进展

乙型肝炎病毒(HBV)是严重威胁人类健康的一种病毒，特别是在我国约有1．2亿人为HBV携带者，占世界的1／3。对已感染HBV者，常用的化学及免疫疗法通常无效。今年来，研究者试图利用反义技术，通过在基因表达水平上抑制HBV的复制，来达到治疗HBV感染的目的。核酶是具有RNA裂解活性的RNA分子，能特异地结合并切割靶RNA分子。HDV核酶是唯一在人体细胞天然具有裂解活性的核酶类型，研究将HDV核酶作为HBV的反义抑制剂可能有着其独特的优势。本文就HDV核酶靶位点的筛选、病毒载体导入系统、靶向性分子的构建等热点问题的研究新进展予以综述。     

病毒学研究的新工具:脱氧核酶及其应用

脱氧核酶是利用体外分子进化技术,从随机脱氧核苷酸单链库中获得的一种具有酶活性的DNA分子.通过该技术已筛选出具有核酸酶活性、激酶活性、过氧化物酶活性等多种催化功能的脱氧核酶.本文概述了脱氧核酶的筛选方法、催化特点、设计策略及其作为一种新型的基因阻抑工具在病毒学研究等领域的广泛应用.     

发卡式核酶结构与功能的研究进展

发卡式核酶的一级结构为RNA分子,切割活性所需的最小长度为50个核苷酸,其立体结构由四个螺旋区及数个环状区域组成,核酶结构中有15个核苷酸是必需的,它们的改变对核酶活性和立体结构都会产生显著的影响,本文综述了发卡式核酶结构与功能的研究进展,并讨论了其作用机理和应用原则。     

双位点核酶对2.2.15细胞中HBV基因表达抑制作用

目的:观察针对HBVC区双位点核酶在细胞内阻断C区基因表达的作用。方法:采用亚克隆技术,从pGEM-Rz123(含针对HBVC区双位点核酶)上切下双位点核酶的片段,定向克隆于真核表达载体pBBS212中。利用lipofectamine介导,将重组质粒pBBS212-Rz及pBBS212转染2.2.15细胞中,采用打点杂交技术观察核酶的表达,采用ELISA、免疫荧光、免疫组化、图象分析法、Westernblot分析HBe/HBcAg及HBsAg的表达。结果:转染的2.2.15细胞经潮霉素B和G418筛选2周后,打点杂交证实可表达针对HBVC区双位点核酶。ELISA方法检测发现核酶抑制HBeAg表达48.6%,用免疫荧光、免疫组化、图象分析法、Westernblot分析证实核酶可抑制HBV细胞内表达。结论:该双位点核酶通过针对HBVC区基因的剪切作用,阻断C区基因表达,抑制了HBe/HBcAg的表达。     

病毒学研究的新工具：脱氧核酶及其应用

脱氧核酶是利用体外分子进化技术，从随机脱氧核苷酸单链库中获得的一种、具有酶活性的DNA分子。通过该技术已筛选出具有核酸酶活性、激酶活性、过氧化物酶活性等多种催化功能的脱氧核酶。本文概述了脱氧核酶的筛选方法、催化特点、设计策略及其作为一种新型的基因阻抑工具在病毒学研究等领域的广泛应用。     

人工核酶M1GS结构与功能相互关系的研究

目的：研究核酶M₁GS其二级结构与体外切 割活性之间的关系。方法：以人巨细胞病毒（HCMV）DNA聚合酶基因UL54 为靶基因，构建了人工核酶M₁GS-T₇。通过软件RNA structure对M1GS在3个具有相对 稳定结构的温度（20 ℃、37 ℃、55 ℃）的空间构象进行模拟,然后通过体外切割实验来 检测不同温度下核酶M1GS体外切割活性的变化。为一步研究核酶M₁GS二级结构与体外切 割活性之间的关系，参照温度变化实验结果及RNA二级结构的模拟结果，引入突变位点，构 建了在37 ℃与55 ℃时M₁GS-T₇具有相同二级结构的突变型核酶mM₁GS-T₇，并通 过体外切割实验对两者的活性进行比较。结果：在温度变化实验中，55 ℃核酶的体外切割活性最高。而在突变实验中，37 ℃ mM₁GS-T₇比M₁GS-T₇的活 性略高。结论：具有某种特定二级结构的M₁GS-T₇有相对较高的体外 切割活性，核酶的结构与其功能之间存在一定的对应关系。     

Deoxyribozymes的研究进展

具有 RNA裂解活性的 DNA分子称为脱氧核酶。它是经过体外选择技术经多次筛选获得的。脱氧核酶在切割与其互补的 RNA底物分子时具有极高的特异性和切割效率 ,有望成为新的 RNA灭活工具     

丁型肝炎病毒核酶反式切割HBV mRNA片段的实验研究

目的　探讨反式作用丁型肝炎病毒 (HDV)核酶体外切割乙型肝炎病毒 (HBV)mRNA片段的可行性。方法　将化学合成的核酶cDNA克隆到含有T7启动子的载体PGEM 4Z中。利用体外转录技术转录出核酶及底物 ,研究其体外切割活性。利用E H作图法进行核酶的酶促动力学研究。结果　在体外实验中显示两酶均能成功的将底物切割 ,37℃温浴 90min的切割百分率为 5 0 %和5 1%。利用E H作图法进行的酶促动力学研究中求得Rc1、Rc2的Km值分别为 0 6 1μmol L、0 5 8μmol L,Kcat值分别为 :0 6 4·min 1 、0 6 0·min 1 。结论　反式作用HDV核酶对非HDV底物 HBVmRNA片段的成功切割为寻找新的HBV的反义抑制手段开辟了途径。     

锤头核酶的分子生物学机制

近二十年来 ,锤头核酶作为基因治疗的一种重要 RNA酶类越来越受到人们的广泛关注 ,有关锤头核酶抗病毒作用机理及应用等问题的研究正在逐步深入。本文仅就其分子结构、催化功能及影响核酶作用功效因素等分子生物学机制的研究进展作一综述     

抗HPV16E_6核酶的原核表达与体外活性研究

目的　获得一种特异性抗人乳头瘤病毒(HPV)16型E6基因的核酶,用以在基因调控水平预防、治疗HPV相关性肿瘤。方法　以核酶(ribozyme,Rz)的锤头结构为模型,采用计算机软件针对HPV16E6基因,设计相应的Rz;体外合成其基因后,克隆于原核表达质粒中。将HPV16E6基因片段也克隆于原核表达质粒中,通过体外转录而得到核酶和病毒mRNA,进行体外切割试验以鉴定核酶的活性。结果　抗HPV16E6核酶(简称抗16HRz)被装入pRG523中而构成pRG16HRz,体外转录后能将核酶独立地释放出来。HPV16E6mRNA转录质粒pTZ16E6含有HPV16E6基因片段( 94位～ 296位),体外切割实验证明抗16HRz具备切割活性,在体外能准确、有效地识别和切割HPV16E6mRNA片段,得到82nt和132nt的切割产物。结论　所获得的抗HPV16E6核酶能特异性切割HPV16E6mRNA,可作为对HPV相关性肿瘤进行基因治疗的工具。