人精浆对白细胞介素2降解和灭活作用的研究

本文报导了人精浆的免疫抑制作用及其机制的研究.我们发现在含有10%混合的 AB~ 正常人血清(NHS)同时加入 ConA 和不同浓度 HSP 的条件下培养,人外周血淋巴细胞仍存活,但淋巴细胞转化受到抑制。并且,ConA 活化的淋巴细胞表面 IL—2受体增生受抑制。加入外源性 IL—2能部分地抵消低浓度 HSP 的作用;但是,加入外源性 IL—1对 HSP 的免疫抑制作用无影响。SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影结果表明 HSP 可将~(125)Ⅰ标记的 IL—2至少降解成2个小分子片段。这些结果提示:通过影响 IL—2的产生;降解已产生的 IL—2和减少淋巴细胞表面 IL—2受体的表达可能是 HSP 抑制淋巴细胞转化和增殖的原因之一。这一抑制作用防止了针对精子免疫反应的发生。     

人乳腺癌细胞系白细胞介素—2基因转导及成瘤性研究

由于人白细胞介素２（ｈＩＬ－２）在体内能刺激宿主的抗肿瘤免疫反应，我们用逆转录病毒为载体将编码ｈＩＬ－２基因导入人乳腺癌细胞素ＭＤＡ－ＭＢ－４３５，并研究转导铁生物学特征及在动物体内的成瘤性，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交法显示原病毒基因已整合到转导细胞基因组内。ＥＬＩＳＡ法证实１０＾６个转导细胞在２４小时内分泌高达１５ｎｇｈＩＬ－２逆转录ＰＣＲ出现ｍＲＮＡ表达，ｈＩＬ－２基因转导细胞在裸鼠体内失去成瘤性。     

人白细胞介素ⅡcDNA表达载体的构建

为开展人白细胞介素Ⅱ（ＩＬ－２）质粒基因肿瘤疫苗的研究,将经改造的人ＩＬ－２ｃＤＮＡ与真核细胞表达ｐｃＤＮＡ３重组保到表达载体ｐｃＤＮＡ３／ＩＬ－２,该质粒转化大肠杆菌后,小量抽提获得的质凿经酶切分析显示长的６８０ｂｐ的目的ＤＮＡ（ＩＬ－２）已插入到ｐｃＤＮＡ３载体中,说明成功构人白细胞介素ⅡｃＤＮＡ表达载体。     

人白细胞介素12在哺乳动物细胞中的稳定表达及其生物活性的研究

目的采用遗传基因工程方法获得具有生物活性的人白细胞介素12,探索其治疗肿瘤和慢性肝炎的可行性。方法采用已克隆的国人IL-12基因序列,利用内部核糖体切入位点(IRES)完成IL-12P35、P40双亚基共表达载体的构建,通过转染CHODHFR缺陷细胞,双抗夹心ELISA法筛选阳性克隆,MTX加压扩增,PCR检测其基因整合,T淋巴细胞增殖和诱生γ干扰素实验检测其生物活性。结果获得了稳定高效表达人IL-12的工程细胞系,表达产物为70×103左右的糖蛋白。结论本研究得到的基因重组人IL-12具有良好的生物活性,有强的诱导产生γ干扰素的能力和诱导活化T淋巴细胞增殖能力。     

白细胞介素—2与骨髓移植

ＩＬ－２与骨髓移植关系密切。ＩＬ－２激活的骨髓细胞为白血病患者的自体骨髓移植提供了一种净化骨髓的有效方法。在非自体骨髓移植后，应用ＩＬ－２能增强移植物的抗肿瘤活性，协助清除体内残留的肿瘤细胞以降低血液恶性肿瘤的复发率；且对ＧＶＨＤ具有抑制作用。本文对ＩＬ－２增强骨髓移植受体的抗肿瘤效果和抑制ＧＶＨＤ的机理进行了探讨。     

人白细胞介素ⅡcDNA表达载体构建及其在肝癌细胞中的表达

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人白细胞介素6逆转录病毒表达载体的构建

实验以ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｌｌｋｓ质粒为载体，构建了人白细胞介素６次级克隆ｐＢＩＬ－６。用限制性内切ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＶ消化ｐＢＩＬ－６，分离并回收了ＩＬ－６ｃＤＮＡ片段，并在其平未端加入了ＢａｍＨＩ接头。实验将带有ＢａｍＨＩ粘性末端的ＩＬ－６全基因片段插入到了逆转录病毒载体ｐＺＬＰＮｅｏＳＶ（Ｘ）１的ＢａｍＨＩ位点上，构建了重组质粒ｐＺＬＰＩＬ－６。经对重组予ＤＮＡ的琼脂糖凝胶电泳、限制住内切酶分析和核酸杂交鉴定，筛选出了含有ＩＬ－６ｃＤＮＡ片段及插入方向正确的ｐＺＬＰＩＬ－６。     

T-lymphocyte activation in IgA nephropathy: Serum-soluble interleukin 2 receptor level,interleukin 2 production,and interleukin 2 receptor expression by cultured lymphocytes

The present study was undertaken to examine the T-lymphocyte activation in IgA nephropathy. Serum-soluble interleukin 2 receptor (sIL2R) levels were studied in 29 IgA nephritic patients, 17 patients with chronic glomerulonephritis (non-IgA nephropathy), and 30 healthy controls during an infection-free period. No difference in serum sIL2R level was demonstrated among these three groups of subjects. However, the serum sIL2R levels of IgA nephritic patient rose significantly during clinical exacerbation with synpharyngitic macroscopic hematuria and the serum sIL2R levels fell when hematuria subsided. Mitogen-stimulated cellular interleukin 2 receptor (IL2R) expression, sIL2R release, and interleukin 2 (IL2) production were also examined in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) cultured for 24–48 hr in 21 patients with IgA nephropathy, 17 patients with chronic glomerulonephritides, and 17 healthy controls. The total cellular IL2R expression and sIL2R release did not differ among these three groups of subjects. However, the individual T-cell subsets bearing IL2R were distinctly different between IgA nephritic patients and the other two groups of controls. IgA nephritic patients had increased activated CD4+ lymphocytes and reduced activated CD8+ lymphocytes. Furthermore, IL2 production in response to phytohemagglutinin and pokeweed mitogen stimulation was increased in lymphocytes from patients with IgA nephropathy. The IL2 production did not correlate with the quantities of cellular and sIL2R yet the cellular IL2R expression paralleled the sIL2R released by cultured lymphocytes. Our present study suggests that the T lymphocytes from patients with IgA nephropathy have a defect in overproduction of IL2 and increased activated T helper-cell subset upon mitogenic stimulation. Serum measurement of sIL2R could potentially be useful in monitoring the disease activity.     

人PD-L2基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 克隆人PD-L2基因并构建PD-L2胞外区的原核表达载体，在大肠杆菌中进行表达。方法 以RT-PCR方法从活化的人外周血单个核细胞总RNA中克隆PD-L2基因的cDNA，构建PD-L2胞外区的原核表达载体，在大肠杆菌BL21(ED3)中进行表达并鉴定。结果 克隆到PD-L2基因cDNA编码区全长序列，经DNA测序证明其与已报道的序列一致。进而构建了PD-L2胞外区的原核表达载体，并在大肠杆菌表达，免疫印迹分析表明在IPTG诱导后表达PD-L2胞外区蛋白，相对分子质量Mr为22000，与理论值大小相符。结论 成功克隆PD-L2基因，其胞外区蛋白在大肠杆菌中获得表达，为进一步研究PD-L2功能提供了条件。     

人重组IL—8在大肠杆菌中表达及其活性检测

本文报道了利用基因工程技术在大肠杆菌中表达人重组白细胞介素8(rh(?)。将质粒pGEM-hIL-8中的IL-8cDNA片段亚克隆到表达载体pMS31b中,在大肠杆菌中成功地高效表达出人IL-8融合蛋白,表达产物具有体内、体外对小鼠中性粒细胞的趋化活性。表明N端连入一段细菌蛋白并不影响IL-8的趋化活性。     

人成纤维细胞生长因子13基因在酵母细胞中的表达

目的：用酵母细胞表达重组人成纤维细胞生长因子（ｈＦＧＦ１３）蛋白并检测其活性。方法：通过ＲＴ－ＰＣＲ从流产胎儿脑组织中钓取ｈＦＧＦ１３ｃＤＮＡ,将其克隆入ｐＹＥＸ４Ｔ－１载体质粒。在酏母细胞表达ＧＳＴ＿ｈＦＧＦ１３融合蛋白。以细胞增殖实验测定酵母表达蛋白粗提物的活性。结果：ＧＳＴ－ｈＦＧＦ１３融合刷拓酵发母细胞中得到表达;ＧＳＴ－ｈＦＧＦ１３融合蛋白细胞ＮＩＨ３Ｔ３细胞的增殖,而且此活性能够被ＦＧ     

人白细胞介素4在大肠杆菌中的优化表达

目的：通过优化设计利用大肠杆菌表达人白细胞介素４（ＩＬ４） 并提高其表达量。方法：根据原核翻译起始序列的局部二级结构自由能,设计了ＡＵＧ 上下游序列,并在人ＩＬ４ 基因下游插入部分大肠杆菌ＬａｃＺ 序列以提高ｍＲＮＡ 的稳定性。结果：成功地构建了人ＩＬ４ 的高效表达克隆,命名为ｐＬＣＭ１８２ｈＩＬ４ 。ＳＤＳＰＡＧＥ 分析显示所表达的重组ＩＬ４ 蛋白质占细菌总蛋白的３０ ％ 。目的基因下游没有插入ＬａｃＺ序列所构建的表达克隆ｐＣＺＨｈＩＬ４ 在大肠杆菌中的表达量则占细菌总蛋白的２０ ％ 左右。结论：所设计的优化表达方法对人ＩＬ４ 基因的表达是成功的,在细胞因子的工程化表达中,优化设计对基因的表达量至关重要。     

小鼠白细胞介素17A的原核表达及对RAW264.7细胞分泌炎症因子的影响

目的 在大肠杆菌中高效表达与纯化小鼠白细胞介素17A(mIL-17A),并研究其对巨噬细胞分泌炎症因子的影响.方法 以活化的脾细胞为模板,通过RT-PCR法扩增小鼠IL-17a基因的编码序列,构建重组表达质粒pET28a/mIL-17a,并在大肠杆菌(E.coli)中诱导表达,经亲和层析获得纯化的mIL-17A蛋白.以mIL-17A蛋白刺激体外培养的鼠巨噬细胞RAW264.7,72 h后应用realtime PCR法分析IL-6、巨噬细胞炎症蛋白1(Ccl3)、巨噬细胞炎症蛋白2(Cxcl3)、β防御素2(defensinβ2)的mRNA表达量,并用ELISA法检测培养上清中Ccl3、Cxcl3、IFN-γ、IL-4及IL-6的蛋白质表达水平.结果 在E.coli中成功高效表达了有生物活性的IL-17A蛋白,可促进体外培养的RAW264.7细胞IL-6、Cxcl3、defensin β2 mRNA的表达,并能促进Ccl3、Cxcl3、IFN-γ、IL-4以及IL-6蛋白的表达.结论 成功表达并制备了具备生物学活性的mIL-17A,该蛋白具有刺激巨噬细胞表达趋化因子、防御素及细胞因子的能力.     

Enhancement of mammary gland mononuclear cell proliferation by interleukin‐2 in the presence of lactoferrin

The influence of recombinant bovine interleukin‐2 (rBoIL‐2) on mammary gland mononuclear cell proliferation in the presence of lactoferrin and serum albumin was evaluated. Mammary mononuclear cells were isolated from five pregnant Holstein cows during the periparturient period and cultured with 0, 2.5 or 25 ng ml^‐1 of rBoIL‐2. Lactoferrin and serum albumin were evaluated at concentrations ranging from 0 to 2.5 mg ml^‐1. Both 2.5 and 25 ng ml^‐1 of rBoIL‐2 significantly increased mononuclear cell proliferation. Increasing concentrations of lactoferrin resulted in a dose‐dependent reduction of mononuclear cell proliferation in the presence and absence of rBoIL‐2. However, in cells from four of the five cows, rBoIL‐2 treatment (2.5 and 25 ng ml^‐1) resulted in significantly enhanced mononuclear cell proliferation compared to controls (no rBoIL‐2) even in the presence of the highest concentration of lactoferrin. Serum albumin had little influence on mononuclear cell proliferation. Results of this study suggest that lactoferrin inhibits mammary gland mononuclear cell proliferation, and that rBoIL‐2 can overcome lactoferrin‐induced hyporesponsiveness.     

Ku80分子克隆在人肺癌细胞的表达及生物学意义

目的：研究Ku80基因分子克隆在人肺癌细胞的表达及生物学意义。方法：用分子克隆的方法构建重组的正义,反义Ku80基因表达质粒,导入人肺癌细胞后,用Northern-blotting法和Western-blotting法证明Ku80正义,反义基因在mRNA和蛋白水平的表达情况。结果：（1）正义或反义Ku80克隆阳性的LCA细胞在mRNA水平均有正义或反义Ku80的表达印迹。（2）仅在正义Ku80克隆阳性的LCA细胞有正义Ku80蛋白表达印迹而反义Ku80克隆阳性的LCA细胞无Ku80蛋白表达印迹,结论：正义或反义Ku80基因的分子克隆可在人肺癌细胞的mRNA得到表达,正义Ku80克隆阳性的LCA细胞有正义Ku80蛋白表达,反义Ku80基因可封闭肿瘤细胞的正义Ku80蛋白的表达,此结论为将Ku基因作为肿瘤靶向基因治疗提供了实验依据。