乙型肝炎病毒adr亚型全基因组分子克隆的建立

从单一人份HBsAg(adr)携带者血清中分离纯化HBV DNA,将其插在质粒pBR 322DNA的BamHI切点,转化大肠杆菌。经筛选得到了含完整乙型肝炎病毒(HBV)基因组的分子克隆,确定了8种限制性内切酶的切点数和位置,并用已知DNA序列的adw_2亚型HBV DNA基因特异性探针进行了基因定位。     

乙肝HBsAg和结核杆菌HSP70融合表达载体的构建

目的：构建乙肝HBsAg和结核杆菌HSP70融合表达质粒。方法：用PCR方法从结核杆菌H37Rv基因组中扩增出结核杆菌HSP70基因序列,应用T－A克隆技术,克隆到质粒pGEM-T vector,经DNA测序证实基因碱基无误后,亚克隆到真核表达质粒pcDNA3.1( ),构建成pcDNA3.1-HSP70重组质粒,然后,再用PCR方法,从质粒pEcob6中扩增出HBsAg基因,并克隆到质粒pcDNA3.1-HSP70,将HBsAg基因的C端与HSP70基因N端连接,构建HBsAg和HSP70融合表达质粒pcDNA3。1－SHSP70,结果：经酶切鉴定和DNA测序证实重组质粒构建正确,结论：乙肝HBsAg和结核杆菌HSP70融合表达载体构建成功。     

抗心肌肥大多肽GCIP表达载体的构建

目的　化学合成DNA片段后利用基因工程技术 ,克隆入含有T7启动子的原核表达质粒。方法　采用分二段化学合成G蛋白竞争性抑制肽 (G proteincompetedinhibitionofpeptide ,GCIP)基因的方法 ,酶切后先定向克隆到pEGFP N1质粒中 ,再用XhoⅠ和SmaⅠ切下含完整基因的片段 ,插入XhoⅠ和SmaⅠ处理的pIVEX2 3 MCS质粒 ,构建能在EcoliBL2 1(DE3 )pLysE和RTS5 0 0系统中表达的质粒。经转化DH5α大肠杆菌 ,筛选出阳性转化子 ,并用酶切及测序鉴定。结果通过基因工程技术 ,构建了pIVEX2 3MCS GCIP表达质粒 ,经测序鉴定结果与设计的完全相符。结论　成功构建了GCIP的重组表达质粒     

对共转化的pC-3-1细胞中乙型肝炎病毒DNA存在状态及HBsAg表达稳定性的研究

用单拷贝(HBV)DNA重组质粒与 TK 基因共转化小鼠Ltk-细胞获得的 HBsAg表达阳性的 pC-3-1 细胞系中,HBV DNA仍以单拷贝存在,并未形成首尾相连的双拷贝结构。对pC-3及其亚系细胞的研究表明,在传代过程中,一些细胞丢失了HBV DNA,一些细胞虽含HBV DNA但不能表达 HBsAg,提示 HBsAg表达的稳定性不但与 HBV DNA是否丢失有关,而且可能与其完整程度和存在状态有关。通过再次克隆和改变HAT培基组分,可以获得HBsAg的稳定表达。     

TAT-HBsAg融合基因在酿酒酵母中的同源重组与表达

[目的]克隆HBsAg和TAT-HBsAg融合基因,在酿酒酵母中同源重组表达.[方法]以HBV基因组为模板PCR扩增HBsAg和TAT-HBsAg融合基因;从酿酒酵母文库质粒pHSS6-mTn-3xHA/LacZ中筛选出可在酿酒酵母中进行同源重组且具有强启动子的质粒pHL;将质粒pHL与TAT-HBsAg融合基因酶切后连接,转化酵母进行同源重组表达;ELISA鉴定蛋白的表达.[结果]酵母中表达了HBsAg蛋白和TAT-HBsAg融合蛋白.[结论]TAT-HBsAg融合基因可以通过同源重组,在酵母细胞中进行产物表达.     

日本血吸虫(中国大陆株)22.6 ku抗原编码基因的核酸疫苗pCMV/Sj22.6的构建

目的　探索日本血吸虫 (中国大陆株 ) 2 2 .6ku抗原 ( Sj2 2 .6)编码基因用作核酸疫苗的可行性。方法　用新设计的引物以 PCR法对 Sj2 2 .6编码基因进行改造 ,然后亚克隆入真核表达载体 p CMV -β并转化入大肠杆菌 JM 10 9。结果　提取重组质粒经酶切分析 ,筛选出了含有正向插入片段的阳性重组质粒。结论　此阳性重组质粒可用于核酸疫苗等进一步研究     

疏水层析用于纯化重组乙肝表面抗原的研究

目的提高重组乙肝表面抗原(HBsAg)的纯化效率。方法用HBsAg基因重组质粒转化中华地鼠卵巢细胞,经克隆筛选的C28细胞系作为基因工程乙肝疫苗株犤1犦,培养重组CHO-C28工程细胞,收集含HBsAg的细胞原液,经连续离心(15000r/min)除细胞碎片,超滤浓缩后研究不同盐浓度下,疏水介质对于重组HBsAg的吸附及纯化的影响。结果硫酸铵饱和度为4%、6%时,盐浓度太低,HBsAg未能很好地结合到疏水介质上;硫酸铵饱和度为10%时,疏水性太强,HBsAg不宜从介质上洗脱下来。结论8%饱和度的硫酸铵更适合重组HBsAg的纯化。     

异种同源表皮生长因子受体EGFR胞外段在毕赤巴斯德酵母中的表达

目的　实现异种同源表皮生长因子受体 EGFR胞外段在毕赤巴斯德酵母中的分泌性表达。方法　将鼠和人的 EGFR胞外段目的基因 (mer,her)与分泌型毕赤酵母表达载体 p PICZa A重组 ,构建了相应的重组表达质粒 p PICZa A- mer和 p PICZa A- her,用 Sac 将重组质粒线性化后 ,电穿孔转化酵母菌株 GS115 ,利用 Zeocin筛选阳性克隆 ,挑出阳性克隆用甲醇小规模诱导表达后 ,进行 SDS- PAGE分析及 Western- blot检测 ,筛选高表达量的克隆作大规模诱导表达。结果　获得了鼠和人的 EGFR胞外段目的蛋白在毕赤巴斯德酵母中的分泌性表达 ,SDS-PAGE分析及 Western- blot检测得到预期条带 ,相对分子质量约为 95× 10 3。免疫印迹分析表明 ,表达蛋白具有良好的抗原性和特异性。结论　 p PICZa A- mer和 p PICZa A- her重组质粒在甲醇营养型酵母中可经甲醇诱导表达鼠和人的 EGFR胞外段目的蛋白。     

重组大肠埃希菌-厌氧梭菌穿梭质粒pIMP1-eIL-12稳定转化生孢梭菌

目的近些年来,以厌氧芽孢梭菌作为实体瘤基因治疗载体的研究逐渐受到关注。文中用重组人白细胞介素-12(rhIL-12)基因重组大肠埃希菌(E.coli)-厌氧梭菌穿梭质粒pIMP1,并稳定转化生孢梭菌,为增强杀伤肿瘤细胞的研究提供基础。方法用SOE-PCR法将rhIL-12基因连到厌氧梭菌的内源性β1,4-葡聚糖酶(endo-1,4-glucanase,eglA)启动子和信号肽之后,构建融合基因eglAp-rhIL-12,将其插入pIMP1,构建重组质粒pIMP1-eIL-12;重组质粒首先在E.coli DH5α内进行鉴定,然后用电穿孔法转化生孢梭菌;利用红霉素抗性筛选阳性克隆,并提取质粒鉴定阳性克隆。结果酶切和测序结果表明插入到pIMP1内的融合基因eglAp-rhIL-12序列及读框正确;抗生素压力筛选和20多代随机质粒提取酶切鉴定结果表明重组质粒pIMP1-eIL-12已稳定转化生孢梭菌。结论成功获得重组质粒pIMP1-eIL-12及其生孢梭菌稳定转化株,为以后的抗肿瘤研究奠定了基础。     

HPV16E6羧基端编码基因的克隆及真核细胞表达

目的探讨用人乳头瘤病毒16型(HPV16)早期基因E6羧基端基因片段(E6C)研制DNA疫苗的可行性。方法采用PCR方法从质粒pHPVl6中获得E6C端基因片段,将其克隆入含巨细胞病毒(CMV)启动子的真核表达载体,脂质体介导基因转染LA795小鼠肺腺癌细胞并检测E6C的表达。结果成功构建了真核表达质粒pLNCE6C,免疫组化结果显示真核表达质粒pLNCF6C在LA795细胞中获得有效表达。结论选择去除转化功能区的E6C端基因构建真核表达质粒是一有益的尝试,为进行动物DNA免疫试验奠定了基础。     

HBsAg/HCcAg融合表达细胞系的建立

目的 建立融合表达HBV表面抗原与HCV核心蛋白的体外培养细胞系，使之作为细胞杀伤实验的靶细胞。方法 将含HBV S和HCV C融合基因真核表达质粒CSpcDNA3.1用电穿孔法转染p815细胞，G418筛选后，再用有限稀释法进行单细胞克隆筛选。RT－PCR与免疫荧光法分别检测基因转录与蛋白表达。结果 HBV S基因与HCV C基因的RT－PCR检测均为阳性，HBV表面抗原与HCV核心蛋白的免疫荧光检测均为阳性。结论 成功获得融合表达HBV表面抗原与HCV核心蛋白的细胞系。     

人乳头瘤病毒6b型病毒样颗粒免疫活性的研究

目的：了解人乳头瘤病毒（HPV）6b型病毒样颗粒（VLP）的免疫活性及其诱导的保护性抗体对HPV11型VLP和牛乳头瘤病毒1型（BPV1）VLP的交叉免疫反应。方法：将HPV6b、HPV11和BPV1晚期基因L1的开放读码框架（ORFs）分别重组到杆状病毒中,该重组病毒在感染的昆虫细胞（Sf9细胞）中表达,表达的L1蛋白可自行组装成HPV6b、HPV11和BPV1 VLP。取50μg纯化的HPV6bVLP分别在第0天和第21天经肌肉免疫Balb/c鼠。第二次免疫后1周及3个月取血,检测血清抗HPV6b、HPV11和BVP1 VLP和BPV1 VLP IgG滴度;血凝集抑制试验检测HPV6bVLP免疫产生的抗血清是否能阻止HPV11 VLP和BPV1 VLP与鼠红细胞凝集。结果：免疫后1周,应用ELISA方法检测抗HPV6b VLP、HPV11 VLP和BVP1 VLP血清IgG滴度分别为1：6400、1：600和1：600。3个月后,抗HPV6bVLP、HPV11 VLP 和BVP 1VLP血清IgG滴度分别为1：800、1：400和1：100。血凝集抑制试验显示HPV6bVLP产生的抗血清能够阻止高度同源性的HPV6b VLP和HPV11 VLP与鼠红细胞结合。结论：HPV6b VLP具有很强的免疫原性,免疫后产生的抗血清具有阻止HPV6b VLP和HPV11 VLP与细胞结合的能力。HPV6b和11型间确实存在交叉反应的中和表位,HPV6b VLP有可能用于防治HPV6b及HPV11感染的疫苗。     

乙型肝炎患者外周血单个核细胞内检出HBsAg-HBV基因表达的可能

已知乙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)中可有HBVDNA存在,但对HBV基因在PBMC内是否表达及如何表达,至今所知尚少.本文用完整PBMC涂片,PAP染色等方法研究了血清中HBV标志阳性者PRMC内HBsAg-HBV基因表达产物.实验结果表明,27例受试者中13例PBMC内HBsAg阳性.对阳性者中的4例,进一步分析HBsAg在单核细胞、T细胞及非T细胞内的分布,结果有2例HBsAg同时存在于T细胞和非T细胞内,另2例分别仅在非T细胞或单核细胞内检出.本文发现HBsAg仅存在于PBMC的胞浆中,并可分为两种染色类型:弥漫型及局灶型.提示PBMC可受HBV感染,HBV基因也可在PBMC内表达.     

乙型肝炎病毒表面抗原免疫逃逸突变基因在人肝癌细胞的表达

为了进一步研究乙型肝炎病毒的Ｓ基因变异在免疫逃逸中的作用，我们通过酶切消化质粒载体ＰＥｃｏｂ６，得到约９００ｂｐ的ＨＢＶ－ｓ基因片断。将其插入到噬菌粒载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋的ＳｍａＩ位点上。然后通过体外寡核苷酸介导的人工定点突变获得得一系列ｓ基因“免疫逃逸”突变型。     

稳定表达HBsAg的P815细胞株的建立及鉴定

目的:筛选并建立稳定表达亚洲人常见的adr亚型HBsAg的P815细胞株,为乙肝DNA疫苗的效果评价提供体外细胞感染模型.方法:用PCR方法扩增乙肝病毒的S基因片段后装入pcDNA3载体,并通过脂质体转染P815细胞,G418筛选.结果:构建了重组质粒pcDNA3-HBsAg(S),转染细胞及其培养上清中均可检测到HBsAg(S)的存在,PCR扩增也证实HBsAg(S)基因已稳定整合于P815细胞的染色体中.结论:获得了稳定表达HBsAg的P815细胞株,为今后在小鼠体内检测乙肝DNA疫苗激发的CTL反应奠定了基础.     

土贝母皂甙对HBV转染的HepG2 2.2.15细胞分泌HB-sAg和HBeAg的抑制作用

目的观察土贝母皂甙对乙型肝炎病毒(HBV)基因转染的人肝癌细胞系2215细胞的毒性及其分泌的HBsAg和HBeAg的抑制作用.方法以MTT比色法观察药物的细胞毒性,以酶联免疫吸附(ELISA)法检测培养上清中HBsAg和HBeAg的表达.结果不同浓度的土贝母皂甙对HBsAg和HBeAg的分泌均有一定的抑制作用,药物作用到48h时对HBsAg和HBeAg的抑制作用最强(P＜0.01),且对HBeAg的抑制作用强于拉米夫定;在0.01ug/ml浓度下无明显细胞毒性作用.结论体外细胞培养表明,土贝母皂甙对HBV有抑制作用.     

含乙型肝炎表面抗原基因重组腺相关病毒的构建及其基因的表达和功能初步研究

OBJECTIVE: To construct recombinant adeno-associated virus (rAAV) carrying hepatitis B surface antigen (HBsAg) gene and study the function of the expressed HBsAg. METHODS: HBsAg gene (subtype ayw) was amplified from PTHBV-1 by PCR and cloned into the adeno-associated virus vector pSNAV to form the recombinant pSNAV-HBsAg, which was transfected into BHK-21 cells by means of lipofectamine. Using G418 selection, a mixed cell line, BHK-HBsAg, was isolated, which was capable of HBsAg expression and was subsequently infected with HSV-1-HSV1-rc/Delta UL2 that was able to package the rAAV. After purification, rAAV-HBsAg was obtained. The expression of HBsAg in BHK-21 cells and 293 cells infected with rAAV-HBsAg were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and the HBsAg antibodies in the sera of rAAV-HBsAg-immunized BalB/C mice were assayed by radio immunoassay. RESULTS: As detected by ELISA, the expressed HBsAg in mixed cell line mounted to 28.6+/-6.72 ng per 5 x 10(6) cells. The BHK-21 cells and 293 cells infected with rAAV-HBsAg were both capable of HBsAg expression, the amount of which augmented with the increase of multiplicity of infection (MOI). BalB/C mice immunized with rAAV-HBsAg produced anti-HBsAg antibodies. CONCLUSIONS: rAAV-HBsAg can induce humoral immune response against HBsAg and therefore can be a promising candidate hepatitis B vaccine, and in addition, it may serve the purpose of exploring possible immunotherapy for chronic HBV infection.     

反义寡脱氧核苷酸对HBsAg、HBeAg表达的影响

目的 探讨硫代磷酸反义寡脱氧核苷酸对乙型肝炎病毒HBsAg、HBeAg的影响。方法 应用ELISA方法检测培养Hep G22215细胞的HBsAg、HBeAg的表达。设计合成HBV5个硫代反义寡聚核苷酸（S-as ODN）靶序列，观察不同靶序列及联合使用对HBV基因复制和表达的影响。结果 本细胞株表达HBsAg、HBeAg的S／C．D均〉5，不同靶位点的S-as ODN对HBsAg、HBeAg表达都有显著的抑制作用及序列特异性．联合用药后对HBsAg和HBeAg的抑制效果有显著的提高。结论 S-as ODN对Hep G22215的HBsAg、HBeAg具有一定的抑制作用，表现为序列特异性、剂量相关性、联合协同性。     

HBsAg转基因小鼠模型的建立及其用于基因治疗研究初探

目的构建HBsAg转基因小鼠模型,并利用其进行基因治疗研究。方法显微注射外源基因pcDNAHBsAg至FVB小鼠原核,注射胚胎移植到同期发情的假孕受体出生个体,经PCR和Southern检测获得阳性转基因小鼠。通过ELISA方法比较分析转基因小鼠经pcDNAHBsAg质粒基因免疫后抗体产生的情况。结果PCR结合Southern检测到了HBsAg阳性小鼠。基因免疫有抗体产生。结论得到的HBsAg转基因小鼠,基因免疫可诱发转基因小鼠产生抗体。     

乙型肝炎病毒表面抗原单链抗体细胞内免疫抗乙型肝炎病毒基因治疗研究

目的 :研究乙型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg)人源单链可变区抗体 (ScFv)细胞内免疫抗乙型肝炎病毒(HBV)基因治疗的作用。方法 :用噬菌体表面展示技术筛选特异性的HBsAg人源单链可变区抗体 ,聚合酶链反应(PCR)法扩增HBsAg单链抗体基因 ,并构建表达HBsAgScFv基因的重组逆转录病毒载体pLXSN HBsAgScFv,转染PA317细胞 ,将转染细胞分泌的假病毒颗粒感染 2 2 15细胞 ,酶联免疫吸附法 (ELISA)检测其上清HBsAg和HBeAg ,定量检测HBVDNA。结果 :成功筛选出HBsAgScFv ,PCR扩增出 75 0bp的全基因 ,构建HBsAgScFv基因的逆转录病毒载体 ,转染PA317细胞 ,在上清中检测出含HBsAgScFv假病毒颗粒的存在 ,上清感染 2 2 15细胞后第 3、5、7、14天 ,HBsAg、HBeAg逐渐下降 ,到第 14天时HBsAg已变为阴性 ,DNA定量检测无明显变化。结论 :HBsAgScFv能成功地在逆转录病毒载体中表达 ,并有抑制HBsAg、HBeAg表达的作用