应用基因芯片技术检测结核分枝杆菌耐药基因

目的应用基因芯片快速检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因突变和耐异烟肼katG、inhA基因突变,建立一种新的分子药敏试验方法。方法根据结核分枝杆菌rpoB、katG、inhA基因序列设计探针并制作DNA芯片,PCR掺入法荧光标记,结核分枝杆菌基因突变位点的目的片断与DNA芯片杂交,同时以传统药敏试验和DNA测序法为对照。结果 70株结核分枝杆菌临床分离株中,20株药物敏感株芯片杂交结果与标准株完全相同;30株耐RIF临床分离株均检测到rpoB基因突变;50株异烟肼耐药株中有41株检测到katG基因突变,9株检测到inhA基因突变,与测序结果完全一致。结论用DNA芯片可快速、特异地检测出大多数结核分枝杆菌分离株的rpoB、katG、inhA基因突变,可用于临床耐药性的检测,指导临床用药。     

江西1010例PCR-线性杂交酶显色法检测结核分枝杆菌耐药性结果分析

目的 评价PCR-线性杂交酶显色法在江西的应用效能，分析江西地区结核分枝杆菌相关耐药基因rpoB、katG、inhA的变异特征。方法 采集江西省肺结核涂阳患者痰标本或经离培养获得的分离株共1010例，采用PCR-线性杂交酶显色法检测rpoB、katG、inhA基因突变情况，同时对其中860例进行了罗氏药敏检测。结果 以罗氏药敏为“金标准”评价PCR-线性杂交酶显色法检测利福平耐药性的敏感度和特异度分别为88.69%和96.24%；检测异烟肼耐药性的敏感度和特异度分别为77.29%和96.39%。在304株利福平耐药rpoB突变株中，突变频率高的位点是531位点、526位点次之；309株katG和inhA基因突变株中，katG S315T1占73.14%、inhA C15T占12.62%。异质性耐药突变菌株占3.61%。结论 PCR-线性杂交酶显色法是耐药结核病快速筛查的有效方法，江西利福平、异烟肼耐药株主要基因突变型为rpoB的S531L和katG的S315T1，高水平耐药菌株所占比例大。     

基因芯片技术在新发涂阳肺结核患者结核杆菌菌种鉴定及药敏试验中的应用

目的探究分子芯片技术在新发涂阳肺结核患者结核杆菌菌种鉴定、药敏试验中的应用。方法入组526株菌株分离自2018年7月-2019年9月间下属7个县市区收治的新发涂阳结核患者,采用间隔区寡核苷酸分型法(Spoligotyping法)及基因芯片技术进行菌种鉴定,对鉴定为结核分枝杆菌的菌株采用绝对浓度法进行利福平、异烟肼药敏性分析,采用基因芯片技术对利福平耐药基因rpoB、异烟肼耐药基因katG、inhA突变位点进行检测,以Spoligotyping法、绝对浓度法作为金标准,分析基因芯片技术对结核杆菌菌种鉴定、药敏分析的应用价值。结果 526株分离株经Spoligotyping法鉴定,414株为结核分枝杆菌复合群,112株为非结核杆菌,其中胞内分枝杆菌57株,龟或脓肿分枝杆菌30株,鸟分枝杆菌25株;基因芯片法对结核分枝杆菌复合群鉴定符合度为100.00%,对非结核分枝杆菌鉴定符合度为95.54%。基因芯片技术共检出33株存在rpoB突变,突变频率最高的位点为531,占比为45.45%,其次为526位点,占比36.36%;共检出42株存在katG/inhA突变,其中78.57%为katG单一位点突变,19.05%为inhA单一位点突变,2.38%为katG、inhA双突变。基因芯片技术诊断利福平耐药的敏感度、特异度、准确度分别为90.90%、99.21%、98.54%,两者一致性Kappa值为0.901;对异烟肼耐药分析的敏感度、特异度、准确度分别为65.08%、99.72%、94.44%,两者一致性Kappa值为0.751;对多药耐药分析的敏感度、特异度、准确度分别为90.48%、99.23%、98.79%,两者一致性Kappa值为0.877。结论基因芯片技术可较好的鉴别结核分枝杆菌菌种及耐药性,与常规菌培养、药敏试验结果具有较高的一致性。     

福建省耐多药结核分枝杆菌耐药相关基因突变特征

目的初步分析福建耐多药结核病(multi-resistant tuberculosis,MDR-TB)临床分离结核分枝杆菌利福平和异烟肼的耐药相关基因突变情况。方法自福建福州肺科医院收集耐多药结核分枝杆菌临床分离菌株,采用PCR测序技术测定利福平和异烟肼耐药相关基因,包括rpoB、katG、inhA和mabA-inhA,并与标准菌株基因序列比对,分析基因突变特点。结果共对67株MDR-TB菌株进行了分析,91.04%的菌株在rpoB81 bp RRDR区发生突变,其中,88.06%(59/67)的MDR-TB菌株在rpoB531、526和516位发生突变;79.10%的菌株在katG、inhA或mabA-inhA上发生突变,59.70%(40/67)的菌株在katG315或者mabA-inhA(-15)位发生突变,没有检测到同时在inhA结构基因和基因调节区发生突变的菌株。结论 PCR-DNA测序分析技术可以用于检测MDR-TB临床分离菌株对RFP和INH的药物敏感性。     

用DNA芯片检测结核分枝杆菌耐利福平基因突变的初步研究

目的研制一种新型DNA芯片，用于快速检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因突变。方法根据结核分枝杆菌rpoB基因序列设计探针并制作DNA芯片，PCR掺入法荧光标记根据结核分枝杆菌rpoB基因突变热点的目的片断，与DNA芯片杂交，同时以DNA测序法为对照。结果18株结核分枝杆菌临床分离株中，1株敏感株DNA芯片杂交结果与标准株完全相同；17株耐RFP临床分离株中有17株检测到rpoB基因突变，其中14株单位点突变，1株511和516位双位点突变，与测序结果完全一致。另有两株为517和518、526和517位双位点突变，因为芯片上未点517位突变的探针，所以只检测到518和526位的突变，该突变与测序结果完全一致、结论用DNA芯片可快速、特异地检测出大多数结核分枝杆菌耐利福平分离株的rpoB基因突变，可用于临床耐药性的检测，指导临床用药。     

乌鲁木齐市耐多药结核分枝杆菌基因突变特征分析

目的 了解耐四种一线抗结核药物结核分枝杆菌的有关基因突变特征。方法 对19例耐多药结核病患者和254例全敏结核病患者痰液标本中分离的结核分枝杆菌进行药物敏感性试验,提取其DNA进行PCR扩增,对扩增产物测序并与标准株H37Rv进行比对。结果 19株耐多药结核杆菌和254株全敏结核杆菌均未检测到耐异烟肼基因inhA突变;耐多药组突变率最高的为耐异烟肼katG基因,突变位点为315;耐利福平的突变基因是rpoB,耐药位点为526和531,531位点突变率高于526位点;耐乙胺丁醇的突变基因是embB,耐药位点为206;耐链霉素的突变基因是rpsL和rrs,耐药位点分别为43和1401,rpsL基因的突变率高于rrs基因。结论 耐多药结核分枝杆菌耐异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素的突变基因分别为katG、rpoB、embB、rpsL和rrs,这对今后乌鲁木齐市耐多药结核病的快速诊断和控制提供了理论依据。     

反向斑点杂交技术在结核分枝杆菌耐药性检测中的应用研究

目的利用反向斑点杂交技术，建立结核分枝杆菌对利福平（RFP）、异烟肼（INH）、链霉素（SM）和乙胺丁醇（EMB）耐药相关基因突变的快速检测方法。方法根据结核分枝杆菌标准株H37Rv序列，自行设计针对rpoB、katG、inhA、rpsL和embB基因中常见耐药突变区的系列寡核苷酸探针，制成膜芯片，并对64例结核分枝杆菌临床株的基因突变情况进行检测。结果在36株RFP耐药菌中，有32株被检出在rpoB基因上发生突变，突变检出率为88．89％（32／36）；在39株INH耐药菌中，有30株被检出在katG或inhA基因上发生基因突变或缺失，检出率为76．92％（30／39）；在34株SM耐药菌中，有25株被检出在rpsL基因分析部位发生突变，检出率为73．5％（25／34）；在32株EMB耐’药菌中，有19株在embB基因分析部位发生突变，检出率为59．4％（19／32）。膜芯片检出的突变与基因测序结果一致。结论用膜芯片检测结核分枝杆菌对利福平（RFP）、异烟肼（INH）、链霉素（SM）和乙胺丁醇（EMB）四种主要一线抗结核药的耐药性，具有较高的特异性和敏感性，可作为常规药敏方法的补充，用于指导开展早期、有效的临床化疗。     

结核分枝杆菌部分耐药相关基因的突变特点

目的 分析结核分枝杆菌耐药相关基因的突变特点,评价DNA序列分析用于结核分枝杆菌快速耐药性检测的应用价值.方法 利用DNA序列分析检测结核分枝杆菌的katG、rpoB和gyrA基因片段.结果 86.81%(79/91)异烟肼耐药株存在katG基因的点突变和/或单碱基插入,最常见的突变形式为R463L,占76.92%(70/91).90.38%(94/104)的利福平耐药株在rpoB基因耐药决定区(RRDR)发生突变,突变类型有26种,涉及11种氨基酸,突变集中在密码子第507～533位.70.49%(86/122)氧氟沙星耐药株在gyrA基因耐药决定区(QRDR)发生突变,突变主要形式为A90V、D94Y、D94N、D94H及S91P.结论 耐药相关基因突变的检测,可作为临床快速检测结核分枝杆菌耐药性的方法之一.     

应用线性探针方法快速检测结核分枝杆菌耐药性的效果评价

目的评估线性探针方法快速检测结核分枝杆菌的耐药性效果。方法选取2013年-2014年江西省耐药监测点分离培养的阳性菌株,收集菌体,提取DNA,采用MTBDRplus试剂盒进行检测,以国际标准的比例法检测结果作为对照,评价其敏感度及特异度,并分析突变分布情况。结果检测利福平耐药的灵敏度为93.33%,特异度为98.35%;检测异烟肼的灵敏度为76.31%,特异度为98.83%。耐利福平基因突变频率最高的位点为rpo B H531L(57.89%),耐异烟肼基因突变频率最高的位点是kat G S315T1(60.61%)。结论可利用MTBDRplus快速检测利福平和异烟肼的耐药性,是快速发现耐药结核分枝杆菌的有效方法。     

煤矿工尘肺结核患者结核分枝杆菌L型耐药基因rpoB序列分析

目的 探讨淮南矿区尘肺结核患者感染结核分枝杆菌L型利福平耐药基因rpoB突变特点.方法 收集结核分枝杆菌L型临床分离株42株,其中利福平耐药株31株,敏感株11株,抽提临床分离株DNA和H37Rv标准菌株DNA,PCR法扩增rpoB基因,并应用全自动DNA测序仪对rpoB基因的突变集中区域进行测序分析.结果 42株结核分枝杆菌L型中,31株耐药株rpoB基因突变率93.55%(29/31),主要集中在531位点(51.61%,16/31)和526位点(32.26%,10/31)碱基置换突变,新发现516位点突变目前在国内外研究中未见报道.11株敏感株未见rpoB基因单链构象异常.结论 高度保守的rpoB基因突变是导致结核分枝杆菌L型利福平耐药的分子基础,其突变位点呈多样性.