重组 PBP2a 转肽酶区蛋白核酸适配体的筛选及鉴定

目的：筛选和鉴定重组青霉素结合蛋白2a（PBP2a）转肽酶区蛋白的核酸适配体。方法利用指数富集的配体系统进化技术（SELEX）,以重组 PBP2a 转肽酶区蛋白为靶标,从单链 DNA 文库中筛选能与之特异性结合的核酸适配体。筛选产物克隆测序后,对其进行结构分析和特性鉴定。结果经过11轮筛选,单链 DNA 文库与靶标蛋白的亲和力趋向稳定,将第8、10轮筛选产物克隆测序,对获得的40个适配体进行分析,一级结构分析显示40个适配体并无共同的保守序列,二级结构预测分析表明,其可分为3个家族。其中13号适配体与重组 PBP2a 蛋白亲和力最高,并能与之特异性结合。结论利用 SELEX 技术成功筛选出特异性结合重组 PBP2a 转肽酶区蛋白的核酸适配体,为探索耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的诊疗新途径奠定基础。     

利用细胞-指数式富集的配体系统进化技术筛选肿瘤细胞DNA适配子

目的建立一种通用的细胞-指数式富集的配体系统进化（Cell—SELEX）技术平台,用于筛选特异性结合于肿瘤细胞的DNA适配子。方法采用PCR法建立随机双链DNA（dsDNA）寡核苷酸文库,用卵白素包被的琼脂糖珠从dsDNA库分离单链DNA（ssDNA）文库;以体外培养的肿瘤细胞作为正筛选的靶标,以相同组织来源的正常对照细胞作为负筛选的靶标,消减法进行Cell—SELEX筛选和PCR扩增以获取DNA适配子;流式细胞仪监测适配子的富集效率（亲和力）;采用常规分子生物学技术进行适西亡子的克隆、测序和序列分析。结果成功建立了ssDNA库,经过12轮Cell—SELEX筛选,获得了特异性结合于肿熘细胞的DNA适配子;挑选120个阳性克隆送测序,鉴定出21个适配子,采用NCBI网站提供的B]astn程序进行精确比对末发脱相似序列。结论本实验建立的技术平台可在较短时间内获取特异性结合于特定肿瘤细胞的DNA适配子。     

大鼠骨髓间充质干细胞特异性核酸适配子的筛选和鉴定

目的 利用指数富集的配体系统进化技术(SELEX)筛选与大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)特异性结合的核酸适配子,并对核酸适配子与大鼠BMSCs的结合方式及能力进行鉴定.方法 利用SELEX技术,以分离获取的大鼠BMSCs为靶点,从构建的核酸文库中最大程度富集与BMSCs特异性结合的核酸序列,流式细胞术检测文库富集的特...     

以大肠埃希菌tolC蛋白为靶标的适配体的筛选及结构分析

目的:筛选大肠埃希菌外排泵tolC蛋白的核酸适配体.方法:重组表达大肠埃希菌外排泵外膜蛋白tolC,利用指数富集的配体系统进化技术(stematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)从单链DNA文库中筛选出一组能够特异性与其结合的核酸适配体.利用FITC荧光素标记技术检测每轮单链DNA文库与靶蛋白的亲和力,直至亲和力的上升趋于饱和,将最后一轮筛选产物克隆测序,并用DNAman软件分析其二级结构.结果:经过12轮筛选,单链DNA文库与靶标蛋白的亲和力趋向稳定,将第12轮筛选产物克隆测序,对获得的23个适配体进行分析.一级结构分析显示23个适配体并无共同的保守序列,但分别有3对和2对适配体序列完全一致.二级结构预测分析表明,茎环结构为适配体主要的结构形式,提示其可能是适配体与tolC蛋白蛋白特异性结合的基础.根据二级结构特点可将23个适配体分为4个家族,其中20号适配体与靶标蛋白亲和力最高.结论:成功利用SELEX技术筛选获得了特异结合tolC的高亲和力的核酸适配体,为大肠埃希菌耐药干预及机制研究奠定了基础.     

核酸适配体筛选方法研究进展

指数富集的配基数系统进化(SELEX)技术的基本过程是用化学方法合成一个单链寡核苷酸库,将之于与靶标物质混合,寡核苷酸链与靶标物质结合形成复合物,去除未结合的核酸链后,再将结合的核酸分子与靶标物质分离,以此寡核苷酸分子为模板进行PCR扩增,用其产物进行下一个循环的筛选。经过数次循环,即可得到能与靶标物质高亲和力高特异性结合的核酸适配体分子。本文综述了SELEX技术筛选核酸适配体技术的一些研究进展。     

核酸适配子在疾病诊断研究中的应用

核酸适配子是通过指数富集的配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)
技术从单链随机寡核苷酸文库中筛选得到的单链寡核苷酸配体，其与靶标的结合具有高特异性及高亲和力等优点，
使其能广泛地应用于疾病诊断研究。适配子在生化检测、新肿瘤标志物发现、分子成像、病原微生物检测等领域的
研究应用中均有报道，并显示出良好的应用前景。     

SELEX技术筛选HCV非结构蛋白NS3的DNA适配子

目的 用配基指数富集的系统进化技术(SELEX)技术筛选丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS3的DNA适配子.方法 构建随机ssDNA文库,两端为固定序列,中间为39 nt的随机序列,总长度为85 nt,将NS3蛋白包被在96孔板上,ssDNA与NS3蛋白进行亲和反应,洗去未结合的ssDNA,洗脱回收与NS3蛋白结合的DNA,PCR扩增后,磁珠法分离成单链.重复以上筛选步骤,直至筛选出高特异性和亲和力的核酸适配子.将核酸适配子连接质粒载体克隆转人大肠杆菌,挑选阳性克隆提取质粒外送到公司进行测序.结果 通过8轮筛选,成功筛选出DNA适配子,并获得其中6条克隆的DNA一级序列.6条适配子序列长度相同,均为85 nt,两端固定序列与设计相符,中间为随机序列,随机序列无共同保守系列.所有寡核苷酸适配子的二级结构以茎环和凸环为主.结论 以NS3蛋白作为药物研究的靶点,结合SELEX筛选技术研究其核酸适配子,具有巨大的潜力和研究价值.     

SELEX技术的靶标范围拓展

靶标范围的不断拓展是SELEX技术和其他随机文库技术(如噬菌体表面展示技术等)的显著特征之一。经过20多年发展,SELEX的靶标已经拓展到包括金属离子、各种有机小分子、药物、蛋白质等生物大分子、致病微生物、活细胞和组织等在内的多种形式。以细胞和组织为靶标的SELEX筛选策略在肿瘤靶向诊断和治疗的研究中得到初步应用。     

SELEX筛选LPS寡核苷酸适配子方法的建立

目的 建立SELEX筛选LPS的适配子方法,为后续大规模筛选奠定基础.方法 在成功构建含40个随机序列的单链DNA(ssDNA)文库的基础上,优化了扩增为双链DNA(dsDNA)文库的PCR反应条件;同时对液相筛选与固液相筛选两种方法进行比较,确定最优的筛选方法并进行4轮筛选.结果 确定了扩增为双链DNA(dsDNA)文库的PCR反应的最佳条件,采用液相筛选方法经过4轮筛选,随机单链DNA(ssDNA)文库与内毒素(LPS)的结合率明显上升,CPM值与初始库相比差异有统计学意义.结论 建立了SELEX筛选LPS寡核苷酸适配子的筛选方法.     

琼脂磁珠消减SELEX技术筛选HIV gp41抗原适配体

目的 通过消减SELEX技术筛选得到高特异性、强亲和力的HIV gp41抗原适配体,为HIV的早期诊断提供了新的检测技术.方法 以琼脂磁珠为载体,HIV gp41抗原为靶标分子,利用消减SELEX技术和实时定量-PCR技术,筛选得到HIV gp41抗原适配体.结果 通过6轮筛选,筛选得到的次级ssDNA库通过PCR扩增得到dsDNA,dsDNA与pMDTM 18载体链接,进行克隆、测序,获得4条HIV gp41抗原适配体.获得的4条适配体亲和力(Kd)均在纳摩尔水平,其中15号适配体的亲和力最强,特异性检测表明筛选得到的适配体几乎只与HIV gp41抗原结合,不与其他非特异性蛋白结合.结论 利用随机单链寡核苷酸文库成功获得与HIV gp41抗原特异性结合的适配体,所获得的适配体具有拮抗HIV gp41抗原的能力.     

适配子治疗获得性免疫缺陷综合征的研究进展

适配子(aptamer)是在体外人工合成的具有特定3级结构的单链DNA或RNA分子,从随机寡核苷酸文库中通过配体指数富集系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential Enrichment,SELEX)筛选出来,能与靶分子以高亲和力、高特异性结合。由于适配子和靶分子结合后可阻断靶分子的生物学活性,与相应抗体分子相比,适配子具有许多优越性,如分子量小、易于修饰、无免疫原性等,因而在各种疾病的治疗中具有广阔的应用前景。文中就适配子治疗人类免疫缺陷病毒1(human immunodeficiency virus 1,HIV-1)感染所致的获得性免疫缺陷综合征(acquired immune deficiency syndrome,AIDS)的研究进展作一综述,以深入研究适配子对病原体感染的治疗作用。     

癌胚抗原特异性单克隆抗体(Anti-CEA)核酸适配体的筛选

目的:筛选癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)特异性单克隆抗体(Anti-CEA)的核酸适配体(aptamers),为肺癌血清肿瘤标志物核酸适配体的筛选奠定实验基础?方法:利用羧基化琼脂磁珠作为筛选介质,以Anti-CEA为筛选的目标靶分子,通过消减SELEX技术及实时定量PCR技术,从随机ssDNA文库中筛选出与Anti-CEA特异性结合的aptamers,并通过凝胶阻滞实验(EMSA)鉴定筛选到的Anti-CEA-aptamer复合物,然后将得到的第10轮富集文库扩增为双链DNA,通过切胶纯化后,连接PMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,同时利用交错PCR技术鉴定阳性克隆,经测序,获得aptamers的序列?结果:经过10轮筛选得到了4条与Anti-CEA结合的aptamers,测序结果显示均为不同序列?结论:验证筛选出的与Anti-CEA结合的aptamer,特异性检测结果表明2号aptamer与靶分子结合的特异性很高,且与非特异蛋白无明显吸附,筛选出的aptamers用于识别Anti-CEA,将为肺癌的早期诊断和早期治疗提供新的突破口?     

高特异性心肌肌钙蛋白Ⅰ适配体的ePCR技术筛选及其表征

目的 筛选出与心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)具有高亲和力和高特异性的核酸适配体,为诊断急性心肌梗死(AMI)提供实验基础.方法 采用基于乳液PCR(ePCR)的SELEX技术筛选出能与cTnI特异性结合的3个适配体,并对ePCR条件进行优化,对适配体进行亲和力(Kd值)测定并与市售cTnI抗体进行比较,选出Kd值最小的适配...     

核酸重组和标记新方法的建立及在EB病毒核酸研究中的应用

鼻咽癌病毒病因的研究是在大量血清流行病学的基础上,建立分子生物学手段检查癌上皮细胞中的EB病毒基因,用以阐明鼻咽癌与EB病毒的关系:(1)除人的B淋巴细胞外,在其他类型的细胞中EB病毒均不能复制,带EB病毒的淋巴母细胞株也只产生极少的病毒颗粒;(2)从病毒感染的细胞中制备病毒核酸,不可避免地会污染少量细胞DNA,而直接影响了反应的特异性,因此迫切需要用基因工程手段制备EB病毒核酸;(3)直接研究癌组织中的EB病毒核酸,需要更敏感而有效的探针,以用于原位核酸杂交技     

胃癌血清适配体的筛选及其鉴定

目的:以羧基化琼脂磁珠为筛选介质,利用RT-PCR和靶标替换消减SELEX技术从胃癌血清中筛选得到高特异性?强亲和力的适配体?方法:以离心超滤(50 000超滤管)法处理后的胃癌血清作为靶分子,羧基化琼脂磁珠为载体,先将寡核苷酸文库与反筛磁珠(结合正常血清)结合,取上清再与筛选磁珠(结合胃癌血清)结合,洗去未结合的寡核苷酸分子,对结合在磁珠上的寡核苷酸分子进行分离和扩增,λ酶切法制备ssDNA次级库,进行10轮筛选,将第10轮的文库扩增得到dsDNA,利用胶回收试剂盒回收纯化目的片段的dsDNA,并与pMDTM18-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆,测序获得适配体序列,同时用流式细胞术测定胃癌血清适配体的Kd值?结果:经过10轮筛选后,得到20条与胃癌血清结合的适配体?结论:特异性检测表明,筛选得到的胃癌血清适配体与胃癌血清的结合解离常数均在纳摩尔级水平,其中5?7?16?17?18号适配体能高特异性?强亲和力结合胃癌血清,与正常人血清不结合?该研究为胃癌的早期诊断提供了实验基础?     

鼻咽癌活检组织中EB病毒膜抗原和EB病毒核酸的分析

应用抗EB病毒膜抗原(EBV/MA)的单克隆抗体检测51例病理确诊的鼻咽癌(NPC)活检标本的冰冻切片,其中49例有EBV/MA的表达。经细胞形态学分析首次发现鼻咽癌癌细胞,增生上皮细胞以及正常鼻咽部上皮细胞都有EBV/MA。以Southern杂交法检查20例鼻咽癌活检组织中EB病毒核酸(EBV/DNA),结果证实鼻咽癌组织中不仅有EB病毒核酸的重复序列W片段,还有与细胞转化有关的K片段的序列存在。进一步表明EB病毒在鼻咽癌的发生中并非“过客”,很可能是其病原因素之一。     

SELEX技术筛选特异性结合高转移性肺癌细胞Anip973的单链DNA适配子

目的:筛选获得一种高亲和力的能特异性结合高转移性肺癌细胞Anip973的单链DNA适配子.方法:体外合成全长88 nt的单链DNA文库,通过反复的SELEX筛选获得特异性结合Anip973细胞的单链DNA适配子,并通过生物素-辣根过氧化物酶-链霉亲和素系统初步测定筛选的适配子与细胞的亲和力,将结合力最高的适配子库进一步...     

高特异性心肌肌钙蛋白I适配体的ePCR技术筛选及其表征

目的筛选出与心肌肌钙蛋白I(cTnI)具有高亲和力和高特异性的核酸适配体,为诊断急性心肌梗死(AMI)提供实验基础。方法采用基于乳液PCR(ePCR)的SELEX技术筛选出能与cTnI特异性结合的3个适配体,并对ePCR条件进行优化,对适配体进行亲和力(Kd值)测定并与市售cTnI抗体进行比较,选出Kd值最小的适配体,进行特异性鉴定。结果SELEX过程中通过优化得到ePCR最佳条件,筛选得到的3个适配体均对cTnI具有较强的亲和力,其Kd值范围为2.04~16.85 nmol/L,其中适配体Apt-1的亲和力最强[Kd为(2.04±0.11) nmol/L]且优于市售抗体,特异性高,敏感性强,不与其他相关蛋白有非特异性结合。结论筛选出的适配体Apt-1能与cTnI产生高亲和力的特异性结合,可进一步用于临床样本中cTnI的检测。     

鼻咽癌病例一级亲属 EB 病毒壳抗原抗体的对照研究

本文运用病例对照研究方法,应用免疫酶法检测了126例鼻咽癌病例与对照者家族内1328名一级亲属血清中的 EB 病毒 VCA 抗体。结果发现 VCA-IgA 在鼻咽癌病例家族内似具聚集现象,鼻咽癌病例一级亲属组 IgA 阳性率(7.75%)显著高于对照组(4.41%)。表明 EB 病毒与鼻咽癌关系极为密切,同时也提示应鼻咽癌病例家族成员考虑为鼻咽癌普查与防治中的重点高危人群。本文还对鼻咽癌病例家族成员是否对 EB 病毒具有较高的遗传易感性进行了初步讨论。     

EB病毒VCA-IgA联合FH检测在鼻咽癌早期诊断中的价值研究

目的 探讨血清EB病毒VCA-IgA联合鼻咽部黏膜细胞稳定性FH检测在鼻咽癌早期诊断中的临床应用价值.方法 回顾性分析2019年6月至2020年6月于本院肿瘤科就诊的168例疑似鼻咽癌患者的临床资料,均进行EB病毒VCA-IgA检测、FH检测.所有患者经手术后进行病理活检.以病理切片的结果为金标准,探讨分析EB病毒VCA-IgA检测、FH检测单独检测和联合检测的结果.结果 168例疑似鼻咽癌患者经病理活检确诊88例,良性病变80例.EB病毒VCA-IgA在鼻咽癌患者中阳性率可达85.23％,鼻咽部黏膜细胞稳定性FH检测阳性率可达90.91％.两者联合检测敏感度(94.44％)、特异度(96.15％)、准确度(95.23％)、阳性预测值(96.59％)、阴性预测值(93.75％),均高于单独检测.结论 血清EB病毒VCA-IgA联合鼻咽部黏膜细胞稳定性FH检测在鼻咽癌的早期诊断中具有较高的敏感性和特异性,能提高鼻咽癌的检出率,具有较高的临床应用价值.