端粒酶逆转录酶基因启动子调控FADD表达载体诱导人结肠细胞凋亡的研究

目的 构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因启动子调控Fas相关死亡结构域蛋白(FADD)肿瘤细胞特异性表达载体,观察其对人结肠癌细胞凋亡的作用.方法 利用hTERT基因核心启动子和FADD基因片段,构建hTERT基因启动子调控FADD 的肿瘤细胞特异性表达载体.用脂质体转染法,将其分别转染人结肠癌细胞和正常细胞,观察人结肠癌细胞和正常细胞的端粒酶活性、细胞周期及凋亡.结果 hTERT基因核心启动子调控FADD 表达载体,在所检测的肿瘤细胞中具有明显的转录活性;而在正常细胞中则无明显的转录活性.Colon320细胞、LoVo细胞、SW480细胞与WI-38细胞凋亡率在不同转染时间比较,差异有统计学意义(P均<0.01).WI-38转染pLNCX-hTERT-FADD与pLNCX-hTERT-GFP在24、48、72、96、120h凋亡率比较,差异均无统计学意义(P均>0.05).结论 hTRET基因核心启动子具有肿瘤特异性,构建hTERT基因核心启动子调控FADD 表达载体可能是一种新的肿瘤治疗途径.     

人端粒酶逆转录酶启动子调控的重组腺病毒的构建及其在膀胱癌细胞中的表达

目的构建人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子调控的表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的腺病毒系统，观察其在膀胱癌细胞中的表达。方法构建带有hTERT启动子的腺病毒穿梭载体pDC315-Tp—EGFP，细胞重组技术获得腺病毒Ad-hTERT-EGFP，按感染复数（MOI）100体外转染膀胱癌细胞株253J及人胚肺成纤维细胞株MRC-5，通过倒置荧光显微镜和Rt—PCR分别检测EGFP的表达。带有小鼠巨细胞病毒（mCMV）启动子的腺病毒Ad-EGFP作为阳性对照。结果成功构建出重组腺病毒Ad-hTERT-EGFP，滴度为3．8×10^10空斑形成单位（pfu）／ml，Ad—hTERT-EG-FP感染的253J细胞中，（85．2±3．3）％发出明亮的绿色荧光；而其感染的MRC-5细胞未产生绿色荧光（P〈0．01）；对照病毒Ad-EGFP在253J和MRC-5中分别有（87．1±2．2）％及（92．5±3．1）％的细胞可见到绿色荧光。RT-PCR检测显示：253J细胞转染Ad-hTERT-EGFP、Ad-EGFP后及MRC-5细胞转染Ad-EGFP后均有EGFP基因表达；而MRC-5细胞转染Ad-hTERT-EGFP后未见EGFP基因表达。结论该腺病毒系统中hTERT启动子调控下游基因可选择性地在膀胱肿瘤细胞中表达，在正常细胞中不表达，具有明显的靶向性。     

shRNA下调人端粒酶逆转录酶基因抑制膀胱癌细胞生长作用的实验研究

目的探讨靶向人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因shRNA载体，下调c-myc和TGF-β1表达抑制膀胱癌细胞生长的作用机理。方法采用RNAi—DNA载体技术，构建靶向hTERT基因不同片段的shRNA—hTERT—pTZU6 1真核表达载体，转染人膀胱癌T24细胞内，RT-PCR法检测hTERT基因表达筛选最有效的shRNA—hTERT—pTZU6 1载体，并转染至T24细胞内，流式细胞术检测对细胞生长周期的影响，RT-PCR和免疫组织化学检测转染前后hTERT、c-myc和TGF-β1的表达。结果成功构建3个shRNA—hTERT—pTZU6 1真核表达质粒，以1．0μg的ph2-shRNA为最佳浓度的最有效力载体，该载体转染至T24细胞后，引起细胞生长减慢，细胞周期中S期细胞数由65．2％减少至38．6％，G1／G0细胞由32．0％增至57．9％，细胞内hTERT、c-myc和TGF-β1表达减弱。结论RNAi可通过下调hTERT基因表达抑制膀胱癌细胞生长，其过程是通过下调癌细胞内c—myc和TGF-β1表达途径来进行的。     

含线粒体促凋亡蛋白基因人膀胱移行上皮特异性表达载体的构建及表达

目的 构建含线粒体促凋亡蛋白基因（Smac）、人尿路斑块蛋白Ⅰb（Up Ⅰb）启动子调控的真核表达载体，检测其在膀胱癌细胞的表达。方法 MluI＋XbaI分别双酶切含SmaC的真核表达质粒pcDNA3．1-Smac和UpⅠb启动子片段，T4DNA连接酶环化目的片段构建新质粒，酶切凝胶电泳和测序鉴定。新质粒转染12孔BIU-87细胞，逆转录,聚合酶链反应（RT-PCR）检测6孔的Smac mRAN表达，免疫组织化学过氧化酶标记的链霉卵白素（SP）法检测另6孔的Smac蛋白表达。结果 pcDNA3．1-Smac中人巨细胞病毒启动子（CMV）和T7噬菌体启动子（T7）被成功替换为upⅠb启动子，构建新质粒pcDNA3-UpⅠb promoter-Smac；转染后BIU-87细胞Smac mRNA表达增强2.1倍、71％癌细胞中Smae蛋白表达增强（P＜0．05）。结论 UpⅠb启动子调控含Smae的真核表达载体构建成功，且能在膀胱癌细胞中有效表达。     

Survivin基因干扰RNA对骨肉瘤MG-63细胞系增殖和凋亡的影响

[目的]观察Survivin基因siRNA表达载体对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响。[方法]体外构建Survivin shRNA表达载体pSilence2．1-neo-Survivin，转染骨肉瘤细胞系MG-63，筛选稳定表达的克隆，倒置显微镜观察各组细胞形态学变化，RT-PCR、Weston-blot方法检测转染后Survivin mRNA及蛋白的表达，噻唑蓝（MTT）法、克隆形成实验检测细胞的增殖情况，吖啶橙荧光染色法观察细胞凋亡情况。[结果]转染后MG-63细胞Survivin基因mRNA水平和蛋白表达显著下降，其抑制率分别为85．08％和81．14％；细胞增殖受到显著抑制，培养48h后与空白组比较，抑制率达63．4l％；吖啶橙染色显示转染组细胞出现明显核碎裂等凋亡改变，转染组凋亡率为24．54％。[结论]靶向Survivin基因的siRNA表达载体可以显著抑制骨肉瘤细胞增殖，促进细胞凋亡。     

单启动子双表达载体pIRES-p14ARF-p53的构建及其对骨肉瘤细胞增殖的抑制作用

目的 构建双质粒表达载体pIRES-p14ARF-p53，并研究其对骨肉瘤细胞增殖生长的抑制作用。方法 利用基因工程技术，将从培养的正常人肝细胞系L02细胞中扩增出的p14cDNA（0．5kb）亚克隆至pIRES载体中，通过聚合酶链反应（PCR）、限制性内切酶酶切鉴定重组质粒pIRES-p14ARF-p53。通过脂质体介导转染入骨肉瘤MG-63细胞中，并筛选出阳性克隆，流式细胞仪测定瘤细胞DNA含量和细胞周期；逆转录（RT）-PCR和Western bolt对稳定转染后的瘤细胞p53、p14ARF蛋白的表达进行定性和半定量检测。噻唑蓝（MTT）比色法与细胞生长曲线观察细胞增殖情况。结果 成功构建出双质粒表达载体pIRES-p14ARF-p53。转染后瘤细胞形态由转染前密集排列的多角形、星形转变为排列稀疏的长梭形细胞，瘤细胞生长速度较前缓慢，群体倍增时间比转染前增加了2．3倍，且易出现脱壁并见散在瘤细胞凋亡；流式细胞仪检测发现转染后的瘤细胞多停滞于G1期；RT-PCR与Western blot检测证实p14ARF、p53基因在靶细胞mRNA和蛋白水平分别有独立表达，转染MG-63后24、48、72、96h瘤细胞生长抑制率分别为：33．43％、69．37％、66，19％、75．26％，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论 野生型p53和p14ARF协同抑制骨肉瘤细胞的增殖促进瘤细胞的凋亡，为进一步研究p14ARF与p53在骨肉瘤基因治疗的体内实验奠定了基础。     

抑癌基因RUNX3在膀胱癌T24细胞株中的表达以及对凋亡的影响

目的 明确RUNX3抑癌基因在正常膀胱组织和膀胱癌T24细胞株的甲基化状态,并将野生型RUNX3基因转染T24细胞,探讨RUNX3基因恢复表达后对膀胱癌细胞凋亡的影响. 方法应用RT-PCR、甲基化特异性PCR和非甲基化PCR检测正常膀胱组织、膀胱癌T24细胞中RUNX3基因的表达以及基因启动子区域CpG岛的甲基化状态.构建真核载体的RUNX3-EGFP-pDest质粒,在LipefectamineTM2000介导下转染膀胱癌T24细胞,转染实验设立3组:空白对照组、空质粒EGFP-pDest转染组以及RUNX3-EGFP-pDest转染组.Western blot检测RUNX3蛋白表达,流式细胞仪检测细胞凋亡情况. 结果正常膀胱组织RT-PCR可检测出1248bp的RUNX3基因条带,而膀胱癌T24细胞中无法检测出RUNX3基因的表达.正常膀胱组织RUNX3基因甲基化PCR检测阴性,非甲基化PCR阳性;T24细胞反之.正常膀胱粘膜组和RUNX3-EGFP-pDest质粒转染组Western blot检测,均表达RUNX3蛋白,而膀胱癌T24细胞未表达RUNX3蛋白.流式细胞仪检测,空白对照组的凋亡率为(3.1±0.46)%,而EGFP-pDest转染组和RUNX3-EGFP-pDest质粒转染组的凋亡率分别为(10.1±1.62)%、(41.20±1.53)%,应用方差分析的LSD法和SNK法进行均数的多重两两比较,RUNX3-EGFP-pDest质粒转染组与EGFP-pDest转染组、空白对照组凋亡率之间的差异均具有显著性,P<0.01.结论 正常膀胱组织RUNX3基因正常表达,未发生启动子区域CpG岛甲基化,而膀胱癌T24细胞可能因RUNX3基因启动子区域CpG岛发生甲基化,致RUNX3基因无法表达.转染野生型RUNX3抑癌基因后促进了膀胱癌T24细胞的凋亡.     

双启动子引导自杀基因靶向杀伤5-FU耐药肿瘤细胞的研究

目的：探讨胸苷酸合成酶（TS）基因启动子和p16基因启动子引导胸苷激酶（TK）自杀基因靶向杀伤5－FU耐药肿瘤细胞的作用。方法：构建TS、p16双启动子重组表达载体,将TK基因插入TS、p16启动子之间,转染耐药人直肠癌细胞系HR－8348、外周血单个核细胞。通过克隆形成实验、细胞存活率测定和裸鼠移植瘤治疗实验,观察双启动了引导TK基因特异杀伤肿瘤细胞的作用。结果：将TS、p16双启动子重组质粒载体转入耐药HR－8348细胞,检测TS、TK基因表达阳性,TK基因与TS表达一致。转染组和对照组肿瘤细胞集落形成分别为：9／300、92／300。转染组瘤细胞集落形成率明显降低（t=33.885,P＜0．01）,癌细胞生长抑制率显著提高。对裸鼠移植瘤的生长抑制率为74．5％。在转染的外周血单个核细胞,p16表达阳性,TS、TK表达阴性。转染双启动子重组质粒对正常外周血单个核细胞无损伤作用。结论：TS和p16双启动子可引导TK基因靶向性杀伤5－FU耐药肿瘤细胞,保护肌体正常细胞,提高自杀基因治疗的安全性。     

p53与端粒酶逆转录酶在膀胱移行上皮癌的表达和作用

目的探讨p53和端粒酶逆转录酶（hTERT）在膀胱移行上皮癌的表达和作用。方法应用免疫组织化学方法和原位分子杂交检测膀胱移行上皮癌的组织学标本的p53蛋白和hTERT mRNA表达，结合病理学和临床资料进行相关分析。结果62例标本中p53阳性表达21例（33．87％），hTERT阳性表达48例（77．42％）。p53的表达与肿瘤的病理学分级显著相关（P〈0．01），与肿瘤的复发显著相关（P〈0．01）。hTERT的表达与肿瘤的分级、分期及复发无相关性。结论p53基因和端粒酶参与了膀胱移行上皮癌的发生和进展。p53蛋白阳性表达有较高的肿瘤分级，并且更可能复发。hTERT可作为临床膀胱移行上皮癌的诊断指标之一。     

siRNA沉默高迁移率蛋白A2基因对人膀胱移行细胞癌细胞T24增殖凋亡的影响

目的 观察siRNA靶向沉默HMGA2基因在人膀胱移行细胞癌T24细胞中表达的变化,探讨抑制HMGA2基因对T24细胞增殖、周期和凋亡的影响.方法 针对人HMGA2基因构建siRNA干扰片段,瞬时转染T24细胞后,采用Western-blot方法检测转染siRNA干扰片段48h后T24细胞蛋白表达量的变化,CCK-8法检测T24细胞增殖和流式细胞仪（FCM）检测T24细胞周期和凋亡情况.结果 转染后48h的T24细胞HMGA2蛋白表达水平较空白对照组（CON）和阴性对照组（NC）显著下降,差异有统计学意义（P＜0.05）,转染HMGA2-siRNA的实验组抑制T24细胞增殖,T24细胞S期细胞比例（35.47±0.23）％高于CON组和NC组（P＜0.05）,实验组T24细胞凋亡率为（17.25±0.24）％,明显高于CON组和NC组（P＜0.05）.结论 HMGA2基因的特异性siRNA可以抑制T24细胞增殖,细胞周期阻滞在S期,并促进其凋亡.     

线粒体促凋亡蛋白促进化疗药物诱导膀胱癌细胞凋亡的分子学机理研究

目的　探讨线粒体促凋亡蛋白 (Smac)促进化疗药物诱导膀胱癌细胞凋亡的分子学机理。　方法　脂质体介导Smac基因转染膀胱癌T2 4细胞 3d后 ,低剂量丝裂霉素诱导凋亡启动 ,MTT比色分析检测癌细胞生长活性 ,流式细胞术检测细胞凋亡 ;免疫组织化学法和逆转录聚合酶链反应检测Smac、XIAP、caspase 3的表达。　结果　各组癌细胞在低剂量丝裂霉素诱导下均出现凋亡 ,0 .0 5mg/ml、0 .0 0 5mg/ml丝裂霉素处理的T2 4细胞凋亡率分别为 18.84 %、10 .72 % ,转染Smac后经 0 .0 5mg/ml、0 .0 0 5mg/ml丝裂霉素处理的T2 4细胞凋亡率分别为 33.5 2 %、2 6 .2 4 % ,差异有显著性意义 (P1<0 .0 5、P2 <0 .0 1) ;同组凋亡相关基因XIAP表达下降、caspase 3表达上调 ,其表达差异均有统计学意义 (P <0 .0 5 )。　结论　Smac在癌细胞中的活化表达可以明显增强细胞在刺激信号下的凋亡 ,其作用机理是通过抑制凋亡抑制蛋白IAPs ,解除了对凋亡下游效应半胱氨酸蛋白酶caspase的抑制活性。     

The growth inhibitory effect of p21 adenovirus on human bladder cancer cells

PURPOSE: To evaluate whether p21 (WAF-1/CIP1) should be considered a potential candidate for human bladder cancer gene therapy, we determined: (1) the basal level of p21 expression in bladder cancer cell lines, (2) the response of bladder cancer cells to increased p21 expression following p21 adenovirus infection, and (3) the mechanism of growth inhibition produced by p21 overexpression. MATERIALS AND METHODS: Five established human bladder cancer cell lines and one primary culture derived from an invasive transitional cell carcinoma were used in this study. To examine the effect of p21 protein on the growth of human bladder cancer cells, a recombinant adenovirus vector system containing p21 cDNA, under the control of cytomegalovirus promoter, was constructed. A control virus containing p21 in an antisense orientation was used to eliminate potential artifacts caused by viral toxicity. RESULTS: Human bladder cancer cell lines exhibit variable endogenous p21 levels which correlate with the in vitro growth status. Significant, but highly variable increases in the steady-state level of p21 were detected in p21 adenovirus infected cells. Human bladder cancer cell lines responded heterogeneously to p21 adenovirus infection. Growth of the WH cell line was substantially inhibited in a dose and time-course dependent fashion. The mechanism of p21 growth inhibition was found to be due to G0/G1 arrest and not the induction of apoptosis. In contrast, p21 adenovirus failed to inhibit the growth of T24 bladder cancer cells because T24 cells were resistant to viral infection. The 253J bladder cancer cells exhibited marked sensitivity to adenovirus; substantial growth inhibition was seen with both sense and antisense p21 very early in the time course of infection. CONCLUSIONS: We found significant variation in the basal level of p21 protein expression in several human bladder cancer cell lines. Increased p21 expression as a result of adenoviral infection may be a potent growth suppressor in some human bladder cancer because it elicits cell cycle arrest in G0/G1 stage, but not the induction of apoptosis. Bladder cancer cells exhibit a wide spectrum of sensitivity to adenoviral infection that may be caused by the presence of viral receptor heterogeneity. This wide spectrum of sensitivity has significant basic scientific and clinical implications and warrants further study.     

Smac基因促丝裂霉素诱导膀胱癌细胞凋亡的研究

目的 探讨Smac基因的表达对于丝裂霉素(MMC)诱导膀胱癌细胞凋亡的影响。方法 脂质体介导Smac基因转染膀胱癌T24细胞3d后，用低剂量丝裂霉素诱导凋亡启动，噻唑蓝(MTT)比色分析检测癌细胞生长活性，吖啶橙-溴化乙锭荧光染色法及流式细胞术法检测细胞凋亡；免疫组织化学法和逆转录聚合酶链反应检测Smac基因的表达。结果 T24细胞在低剂量丝裂霉素的诱导下发生凋亡，两种方法检测细胞凋亡率，用0．05g／L丝裂霉素处理的T24细胞凋亡率分别为20，50％和18．84％，而经过转染Smac后用0，05g／L丝裂霉素处理的T24细胞凋亡率分别为36，40％和33．52％，差异有统计学意义(P＜0．05)。结论 促凋亡基因Smac在膀胱癌细胞中的活化表达可以明显增强细胞在刺激信号下的凋亡。     

化疗诱导人肝癌细胞凋亡中p53和bcl-2基因的调控

目的 建立化疗药物丝裂霉素诱导肝癌细胞凋亡的模型,初步探讨在该凋亡过程 中重要凋亡相关基因ｐ５３和ｂｃｌ－２的调控作用。方法 用丝裂霉素诱导人肝癌细胞系ＨｅｐＧ２凋亡,我显微镜和透射电镜观察肝癌细胞的形态学改变,琼脂糖凝胶电泳检测凋亡细胞ＤＮＡ片段的梯状条带,用流式细胞仪免疫荧光法检测凋亡不同时期Ｐ５３和Ｂｃｌ－２蛋白的表达量。结果 ８ｍｇ／ｍｌ丝裂霉素作用１２,２４,４８ｈ后,Ｐ５３蛋白表达量明显增高,尤以１２ｈ明显,而后逐渐下降。Ｂｃｌ－２蛋白在整个凋亡过程中无明显变化。结论 在化疗药物丝裂霉素诱导肝癌细胞凋亡过程中,ｐ５３基因参与了调控,并为凋亡信号传导途径中的早期事件。丝裂霉素诱导的肝癌细胞凋亡途径为ｐ５３依赖方式,而在该凋亡过程中,ｂｃｌ－２基因的调控并不重要。     

小干扰RNA抑制雄激素受体基因表达对人膀胱癌T24细胞增殖及凋亡的影响

目的 观察小干扰RNA技术(siRNA)抑制雄激素受体(AR)基因的表达对人膀胱癌T24细胞增殖及凋亡的影响.方法 化学合成针对AR的siRNA,用脂质体转染T24细胞.采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测AR mRNA和蛋白的变化.转染细胞48 h后用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞体外增殖活性的变化,流式细胞术检测细胞的凋亡状况.结果 成功的转染T24细胞,实时荧光定量RT-PCR筛选出一条AR mRNA抑制效率最高的siRNA,行Western blot检测可抑制AR蛋白表达至70.3%.转染细胞48 h后,T24细胞增殖活性抑制率达到(25.9±5.4)%,细胞凋亡率达到21.61%.结论 应用siRNA干扰技术能有效的抑制AR基因的表达,同时可抑制人膀胱癌T24细胞的体外增殖活性及促进其凋亡的发生.     

BAK基因过表达对膀胱癌细胞的诱导凋亡作用及其分子机制

目的：探讨BAK基因过表达对膀胱癌的诱导凋亡效应及机制。方法：脂质体介导BAK基因转染膀胱癌EJ细胞1－7d后，逆转录聚合酶链反应检测BAK基因表达，细胞计数法检测癌细胞生长活性，DNA Ladder法、吖啶橙－溴化乙锭荧光染色法及原位末端转移酶标记技术检测癌细胞凋亡，免疫组织化学法检测癌细胞Caspase-3、Bcl-2,p53表达。结果：转染1－7d后，癌细胞BAK基因表达显著增强（P＜0．01），体外生长抑制20．66％－35．58％（P＜0．01），部分癌细胞呈现凋亡形态学变化，凋亡率为18．0％－20．6％（P＜0．01），癌细胞Caspase-3表达增强6．6倍（P＜0．01）Bcl．2和P53表达差异无显著性（P＞0．05）。结论：BAK基因表达能显著诱导膀胱癌细胞凋亡，其中Caspase-3激活是其作用机制之一。     

Vaccinia virus mediated p53 gene therapy for bladder cancer in an orthotopic murine model

PURPOSE: We determined if vaccinia virus (VV) mediated delivery of human tumor suppressor p53 is safe and effective for bladder tumor therapy in an orthotopic murine model. MATERIALS AND METHODS: We used recombinant VV (rVV) vectors to express transgenes in murine bladder cancer MB-49 cells in culture and those growing orthotopically in syngeneic mice. Cultured MB-49 cells were infected with rVV expressing reporter genes (rVV-L15) or p53 (rVV-TK-53) to measure virus infection and apoptosis induction. Orthotopic MB-49 tumors in C57/Bl6 mice were treated with intravesical instillation of rVV, and the tumor incidence, survival and transgene expression were determined. RESULTS: Productive virus infection in vitro was observed in MB-49 cells, although at somewhat lower efficiency than in African Green Monkey kidney CV-1 cells (American Type Culture Collection, Manassas, Virginia). Expression of transgenes in vitro correlated with the virus dose. Cells infected with rVV underwent apoptosis with rVV-TK-53 inducing far greater cell death than rVV-L15. The rVV-L15 virus had no effect on tumor incidence but it increased mean survival compared with control. Instillation of rVV-TK-53 decreased the tumor incidence and 33% of mice survived treatment. At necropsy all nonsurviving mice had bladder tumor, whereas 2 survivors in the rVV-TK-53 treated group were tumor-free. Immunohistochemistry of tumors detected expression of the human p53 gene product in tumor cells. CONCLUSIONS: To our knowledge we report for the first time that recombinant vaccinia virus expressing human p53 can induce the death of MB-49 tumor cells in vivo, not only through the lytic effect of the virus, but also through expression of the death inducing p53 transgene. Further studies are needed to shed light on the mechanisms of rVV-TK-53 mediated tumor apoptosis and the antitumor immune response.