输注转染人IL-10基因的骨髓间充质干细胞延长异种肝移植大鼠存活时间

目的 探讨人白细胞介素10(hlL-10)修饰的豚鼠骨髓间充质干细胞(hIL-10-MSCs)输注对异种肝移植大鼠存活的影响及其可能机制.方法 以携带hIL-10基因的慢病毒(hIL-10/LOX-ewGFP)为载体构建hIL-10-MSCs.以豚鼠为供者,Wistar大鼠为受者,制作非协调性异种原位肝移植模型,将受者随机分成3组,每组60只:空白对照组大鼠术前3天和术后1天各静脉注射生理盐水和地塞米松1次;MSCs组大鼠术前3天和术后1天各静脉注射MSCs和地塞米松1次;hIL-10-MSCs组大鼠术前3天和术后1天各静脉注射hIL-10-MSCs和地塞米松1次.记录供者手术时间、供肝冷缺血时间、受者手术时间、肝上下腔静脉(SVC)吻合时间、无肝期及受者存活时间,测定术后各组受者血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和乳酸脱氢酶(LDH)的含量,酶联免疫吸附试验法测定各组受者移植肝组织中自细胞介素2(IL-2)、IL-4、hIL-10、IL-12、IL-15、IL-18和TGF-β1的含量,逆转录聚合酶链反应法检测各组受者移植肝组织中上述各细胞因子mRNA的表达.结果 hIL-10-MSCs组受者存活时间为(72.0±5.5)h,空白对照组和MSCs组受者的存活时间分别为(29.0±2.2)h和(48.0±4.6)h,前者明显长于后二者,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.05).hIL-10-MSCs组移植肝组织中IL-4和TGF-β1mRNA的表达明显高于空白对照组和MSCs组(P<0.05,P<0.05),而IL-2、IL-12、IL-15、IL-18 mRNA的表达明显低于空白对照组和MSCs组(P<0.05,P<0.05),hIL-10-MSCs组肝组织中hIL-10 mRNA的表达明显高于空白对照组和MSCs组.结论 静脉输注hIL-10-MSCs可延长异种肝移植大鼠的存活时间,其机制可能与hIL-10-MSCs抑制IL-2、IL-12、IL-15、IL-18等细胞因子的表达,促进IL-4和TGF-β1的表达有关.     

输注转染人白细胞介素10基因的骨髓间充质干细胞对移植肝的保护作用

目的研究输注转染人IL-10基因的骨髓间充质干细胞（hIL-10-MSC）对大鼠原位异种肝移植后移植肝的保护作用及机制。方法建立豚鼠对Wistar大鼠的非协调性异种原位肝移植模型,受体分为3组：空白对照组、骨髓间充质干细胞（MSC）对照组、hIL-10-MSC组。术后12h取移植肝,HE染色观察移植肝组织形态学变化,用RT-PCR、蛋白质印迹法观察移植肝组织IL-10、穿孔素、颗粒酶B的表达情况。结果与空白对照组、MSC对照组相比,hIL-10-MSC组大鼠移植肝排斥反应最轻,穿孔素、颗粒酶B的表达明显降低,而IL-10的表达显著升高（均P〈0.05）。结论 hIL-10-MSC对移植肝的保护作用可能与其减少穿孔素/颗粒酶B的表达有关。     

hIL-10基因修饰骨髓间充质干细胞对肝移植大鼠排斥反应的影响

目的研究hIL-10基因修饰的骨髓间充质干细胞（mesenehymal stem cell,MSC）对大鼠原位异种肝移植排斥反应的影响及机制。方法利用两套管吻合技术行豚鼠对Wistar大鼠的非协调性异种原位肝移植构建模型,按照构建模型过程中处理方式的不同（生理盐水＋地塞米松、MSC＋地塞米松、hIL-10-MSC＋地塞米松）分为空白对照组、MSC组、hIL-10-MSC组。观察受鼠存活时间、肝功能、术后24h移植肝组织IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18及TNF-α的含量及其mRNA表达。结果与空白对照组、MSC组相比,hIL-10-MSC组大鼠生存时间延长、肝功能好转,细胞因子IL-2、IL-12、IL-15、IL—18、TNF-α表达明显降低,IL-4、IL-10表达显著升高（P〈0．05）。结论hIL-10-MSC对移植肝保护作用可能与其抑制IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、TNF—α细胞因子的表达,促进细胞因子IL-4的表达有关。     

缺血预处理对大鼠肝脏移植物再灌注早期NF-κB活性的影响及意义

目的 观察缺血预处理对大鼠肝脏移植后再灌注早期核转录因子-κB(NF-κB)活性和TNF-α、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达的影响,探讨缺血预处理的保护机理.方法 建立大鼠肝脏移植模型,供肝在林格液中保存2 h,实验分假手术组、对照组和缺血预处理组(IP组)3组,IP组于供肝切取前夹闭第一肝门10 min,然后开放10 min.分别于移植再灌注后1、2、4及6 h抽血进行肝酶学检查,切取肝脏作NF-κB活性、TNF-α和ICAM-1表达的测定.结果 IP组肝功能得到有效改善.与假手术组比较,对照组及IP组再灌注后移植物的NF-κB活性明显增强,且在1、2 h达高峰,4 h后减弱,TNF-α和ICAM-1表达也随之增加;同对照组相比,IP组的NF-κB活性降低,并且在1、2 h差异具有统计学意义(P＜0.05),TNF-α和ICAM-1表达亦降低.结论 缺血预处理对于供肝的保护作用可能是通过抑制再灌注早期NF-κB的活性,减少了TNF-α和ICAM-1炎症介质的释放,从而减轻了移植物再灌注早期的炎症反应实现的.     

hIL-10基因修饰骨髓间充质干细胞对异种T淋巴细胞增殖的影响及机制研究

目的 研究hIL-10基因修饰的MSCs(骨髓间充质干细胞)对异种混合T淋巴细胞增殖的影响及机制.方法 RT-PCR克隆hIL-10基因并将构建慢病毒hIL-10/pLOX-cwGFPs,然后将慢病毒转导hIL-10入豚鼠MSCs;ELISA测定hIL-10-MSCs培养上清hIL-10含量;CCK-8法检测hIL-10基因修饰的骨髓间充质干细胞对体外混合淋巴细胞培养的影响;ELISA测定其培养上清对外周血单个核细胞分泌IFN-γ的影响.结果 成功构建慢病毒hIL-10/pLOX-cwGFP,hIL-10-MSCs培养上清的IL-10水平明显高于未转染(P<0.05);hIL-10-MSCs能抑制异种T淋巴细胞混合培养的增殖反应(P<0.05);加入IL-2能逆转MSCs的抑制作用(P<0.05);hIL-10-MSCs培养上清组能抑制PHA刺激的PBMC分泌IFN-γ(P<0.05).结论 hIL-10-MSCs对混合异种淋巴细胞培养有显著的抑制作用,能抑制PHA刺激的PBMC分泌IFN-γ.     

供肝冷缺血时间延长诱发大鼠原位肝移植术后早期急性排斥反应的研究

目的 研究供肝冷缺血时间延长对大鼠原位肝移植术后早期急性排斥反应的影响.方法 选取30只健康纯系清洁级BN大鼠和30只Lewis大鼠.分别作为纯系移植和同种异体移植的供者,受者均为健康纯系清洁级BN大鼠60只,建立纯系和同种异体原位肝移植模型.根据纯系移植和同种异体移植供肝冷缺血时间的不同,将供、受者分为A、B、C和D组,每组15对.A组:供肝冷缺血1 h后进行纯系移植;B组:供肝冷缺血18 h后进行纯系移植;C组:供肝冷缺血1 h后进行同种异体移植;D组:供肝冷缺血18 h后进行同种异体移植.术后观察受者的2周存活率、移植肝组织病理学及肝功能的改变,检测受者主要组织相容性复合物(MHC)-Ⅱ类分子和核转录因子κB(NF-κB)的表达水平.结果 肝移植术后2周,A、B、C和D组的存活率分别为83.3%、66.7%、16.7%和0%,不管是纯系移植组还是同种异体移植组中供肝的冷保存时间越短,受者的存活率越高,且经肝功能检查发现冷保存时间短的受者移植肝功能恢复较好,移植肝组织病理学损伤和急性排斥反应也明显较轻.B组受者术后移植肝大量表达MHC-Ⅱ类分子,明显高于A组(P＜0.05);两同种异体移植组MHC-Ⅱ类分子的表达量较两纯系移植组增加明显,D组增加最多.A组几乎不表达NF-κB,而B组NF-κB的表达显著增加(P＜0.05);两同种异体移植组受者NF-κB的表达峰值提前.结论 冷缺血时间的延长可以诱导发生和加重大鼠原位肝移植术后早期急性排斥反应,降低术后2周存活率.     

糖尿病对大鼠自体移植静脉内膜增生的影响

目的:探讨AGE-RAGE系统对糖尿病大鼠自体移植静脉内膜增生的作用。方法:雄性SD大鼠40只，随机分为糖尿病组及正常对照组。两组均建立自体静脉移植模型，制模后的7 d和14 d测定血清AGE含量，取自体静脉移植标本行组织形态学观察，半定量RT-PCR检测RAGE，NF-κB p65及VCAM-1mRNA的表达，Western蛋白印迹和免疫组化方法检测RAGE，NF-κB p65及VCAM-1蛋白表达,并用免疫组化方法检测PCNA的表达。结果:术后7 d及14 d，与对照组比较，糖尿病组自体移植静脉内膜增生明显为重，PCNA，RAGE，NF-κB p65及VCAM-1mRNA和蛋白表达均增强，血清AGE含量增加，差异均有统计学意义（均P<0.05）。 结论:AGE-RAGE系统激活NF-κB，增强黏附分子的表达，可能是糖尿病大鼠自体移植静脉内膜增生加重的原因。     

胶原凝胶复合骨髓间充质干细胞对小鼠 急性肝衰竭的疗效与机制研究

目的 探讨移植胶原凝胶复合骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,MSCs） 对小鼠急性肝功能衰竭（acute liver failure,ALF）的治疗效果与机制。方法 105只雄性C57BL/6 小鼠随机 分为5组：对照组、ALF组、ALF+胶原凝胶组、MSCs组和胶原凝胶-MSCs组,每组21只。ALF组、ALF+ 胶原凝胶组、MSCs组和胶原凝胶-MSCs组采用腹腔注射D-氨基半乳糖苷（D-Gal）12 h后,分别于肝脏多 点注射200 μL PBS、200 μL胶原凝胶、1×106 MSCs和1×106胶原凝胶-MSCs。记录各组小鼠7 d存活率, 全自动生化仪检测肝功能水平,HE染色检测肝脏组织病理学改变,免疫组化检测肝细胞凋亡和增殖情况, 利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测肝脏炎症因子水平,Western blotting检测PI3K-AKT信号通路表达。 结果 扫描电镜示胶原凝胶与MSCs具有较好的相容性,动物活体成像检测显示胶原凝胶-MSCs移植的 信号强于单独MSCs移植的ALF小鼠。D-Gal处理后,胶原凝胶-MSCs组和MSCs组的小鼠生存率明显提高 （P＜0.05）,小鼠血清AST、ALT在胶原凝胶-MSCs组和MSCs组的小鼠明显优于ALF组和ALF+胶原凝胶 组（P＜0.05）,且肝功能指标明显改善,胶原凝胶-MSCs组要更优于MSCs组（P＜0.05）。 HE染色提示胶原 凝胶-MSCs组肝脏的病理改变（肝细胞坏死部位和范围）轻于MSCs组,Western blotting、Ki-67和cleavedCaspase3免疫组化结果显示,胶原凝胶-MSCs组肝细胞增殖能力强于MSCs组,同时肝细胞凋亡程度要低 于MSCs组,相应的胶原凝胶-MSCs组肝脏内IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS和CCL2等炎性因子水平也低于 MSCs组。且胶原凝胶-MSCs移植能明显激活肝脏内的PI3K-AKT通路。结论 胶原凝胶复合MSCs移植能 增强MSCs的肝脏定植能力,通过抑制细胞凋亡和促进细胞增殖减轻肝损伤,并调控AKT信号通路改善肝 细胞功能,因此胶原凝胶复合MSCs移植优于单纯MSCs移植治疗ALF。     

骨髓间充质干细胞经脾移植治疗大鼠急性肝功能衰竭的实验研究

目的 探讨大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）经脾移植治疗急性肝功能衰竭的疗效，并观察MSCs在体内的迁徙情况。方法 收集1只SD雄性大鼠胫骨及股骨的骨髓，采用密度梯度离心联合贴壁培养法分离、纯化及扩增雄性SD大鼠的骨髓MSCs，再行免疫组化染色以观察第4代骨髓MSCs的表面标志物。联合应用D-氨基半乳糖和肿瘤坏死因子-α （TNF-α）建立24只雌性大鼠急性肝功能衰竭模型，将其随机分为2组：实验组（n=12）大鼠于造模后24 h行骨髓MSCs脾内移植；空白对照组（n=12）仅于脾内注射0.5 mL生理盐水。2组大鼠于移植后均取血检测丙氨酸氨基转移酶（ALT）、总胆红素（TBIL）及白蛋白（ALB）水平，采用PCR法检测大鼠肝脏组织中Y性别决定区基因（SRY基因）的表达，并行HE染色观察肝脏组织的病理学改变。结果 第4代MSCs表达CD44和CD29，但不表达CD34。MSCs移植72 h及以后，实验组存活5只大鼠（41.7%），空白对照组存活3只大鼠（25.0%），2组大鼠的存活率比较差异有统计学意义（P＜0.05），实验组较高。将雄性大鼠的骨髓MSCs移植于雌性大鼠的脾内后，在雌性大鼠肝脏中能检测到SRY基因的表达；且HE染色结果显示，实验组大鼠的肝功能在移植后4周明显改善。移植后与空白对照组比较，实验组各时点的ALT和TBIL水平均较低（P＜0.05）；移植后1周和2周，实验组的ALB水平均高于空白对照组（P＜0.05）。结论 骨髓MSCs经脾内移植后迁徙并定居于受损的肝脏内，可替代肝细胞的功能。     

输注转染人IL-10基因的骨髓间充质干细胞减轻大鼠异种移植肝脏的细胞凋亡

目的 探讨转染人白细胞介素10(Hil-10)基因的骨髓间充质干细胞(MSC)对大鼠异种移植肝脏细胞凋亡的影响.方法 以携带Hil-10基因的慢病毒Hil-10/LOX-cwGFP转染豚鼠的MSC.以豚鼠为供者,Wistar大鼠为受者,利用两套管法行原位肝移植.空白对照组的受者分别于术前24 h和术后24 h经股静脉注射生理盐水2 ml+地塞米松0.5 ml(2 mg/ml)各1次;MSC组的受者分别于上述时间点自股静脉注射2.0×106/ml的MSC单细胞悬液2 ml+地塞米松0.5 ml(2mg/ml)各1次;Hil-10-MSC组的受者分别于上述时间点自股静脉注射2.0×106/ml的Hil-10-MSC单细胞悬液2 ml+地塞米松0.5 ml(2 mg/ml)各1次.术后12 h切取移植肝脏,观察移植肝组织学变化,测定肝组织中Hil-10、凋亡蛋白酶-3(Caspase-3)、Fas和FasL的表达,观察肝细胞的凋亡情况.结果 与空白对照组、MSC组相比,Hil-10-MSC组的病理改变最轻,IL-110表达明显增加,FasL明显减少.Hil-10-MSC组的Fas和Caspase-3的阳性区域面积分别为11.5%和25.1%,明显低于空白对照组的35.3%和70.8%(P＜0.05).Hil-10-MSC组的凋亡指数为32.5%,明显低于空白对照组的74.1%和MSC组的50.3%(P＜0.05).结论 Hil-10-MSC可明显减轻大鼠异种移植肝脏的细胞凋亡,其机制可能与其抑制Fas/FasL的表达有关.     

缺血后处理减轻肠缺血再灌注引起的肝损伤的机制研究

目的：探讨缺血后处理减轻肠缺血再灌注引起的肝损伤的作用机制,为外科防治缺血再灌注损伤提供策略。方法将36只SD大鼠随机分为假手术组（SO组,仅手术显露肠系膜上动脉）、缺血再灌注组（IR组,阻断肠系膜上动脉60min,再灌注120min）、缺血后处理组（IP组,阻断肠系膜上动脉60min后行3个循环的灌注30s/阻断30s,再持续灌注117min）,每组12只。建立模型2h后采集各组大鼠动、静脉血及部分小肠、肝组织,检测血肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素10（IL-10）、丙氨酸氨基转氨酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）水平,测定血清及肝组织内丙二醛（MDA）、髓过氧化酶（MPO）水平,光学显微镜下观察小肠及肝脏病理学改变,免疫组织化学法检测肝脏组织中核因子κBp65（NF-κBp65）和缺氧诱导因子1α（HIF-1α）的表达变化。结果与SO组比较,IR组小肠、肝脏病理损伤加重,肝组织NF-κBp65和HIF-1α的表达显著升高,血清和肝组织中MDA、MPO水平及血清TNF-α、IL-10、ALT和AST水平升高;与IR组比较,IP组小肠、肝脏损伤减轻,肝组织NF-κBp65表达下降而HIF-1α的表达显著升高,血清和肝组织中MDA、MPO水平及血清TNF-α、ALT和AST水平均显著下降,血清IL-10水平增加,差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论缺血后处理可以促进抗炎因子的激活,抑制NF-κB信号通路调控的炎症级联反应,上调HIF-1α的表达,减轻小肠缺血再灌注引起的肝损伤。     

乌司他丁对肝脏移植早期外周血NF-κB和TNF-α及酶学活性的影响

目的：通过观察乌司他丁对肝脏移植早期外周血NF-κB、TNF-α和酶学活性的影响,研究乌司他丁对肝脏移植术后早期再灌注损伤的保护作用。方法：收集36例肝硬化晚期患者,随机分为实验组和对照组（各18例）,实验组在肝移植时给予乌司他丁30万U＋生理盐水10mL静脉滴注,对照组给生理盐水10mL静脉滴注,在供肝恢复血供后1、2、4及6h抽取患者外周血进行肝酶学检查,用Westernblot技术检测外周血中核转录因子κB（NF-κB）P65表达,用双抗体夹心酶联免疫吸附法测定外周血中TNF-α表达水平。结果：和对照组相比,实验组肝移植术后早期各时相点外周血肝酶学指标、NF-κBP65和TNF-α的表达水平明显下降,且差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论：乌司他丁能抑制肝移植后早期肝脏炎症通路,对肝脏移植后再灌注损伤具有保护作用。