靶向Plk1基因的shRNA对肝癌BEL-7402细胞株生物学行为及化疗增敏的影响

目的 利用RNA干扰技术(RNAi),研究表达Polo-like kinase 1 (Plk1)的短发夹RNA (shRNA)载体对肝癌细胞株BEL-7402生物学行为及对化疗药物长春新碱敏感性的影响. 方法 根据靶基因的不同区域构建针对Plk1mRNA的两组干扰质粒shRNA-Plk1:Plk1siRNA-251,Plk1siRNA-1396以及阴性对照质粒Plk1siRNA-hk,利用电穿孔法转染入肝癌细胞株BEL-7402,用长春新碱处理细胞后,用MTT法检测四组细胞的生长抑制率,计算IC50值,流式细胞仪检测各组细胞凋亡. 结果 半定量RT-PCR检测Plk1siRNA-251,Plk1siRNA-1396组Plk1mRNA、Cdc25CmRNA表达较Plk1siRNA-hk转染组与空白对照组明显下降(P＜0.01),p53mRNA表达增加.长春新碱处理后,Plk1siRNA-251组和Plk1siRNA-1396组与BEL7402组之间的生长抑制率有显著性差异(P＜0.01).5 μg/ml浓度长春新碱作用24h后,Plk1siRNA-251组和Plk1siRNA-1396组凋亡指数分别为19.09％ ±3.97％、19.80％ ±5.47％明显高于Plk1siRNA-hk组和BEL7402组(P＜0.01).结论 成功筛选出两条能特异而高效抑制Plk1基因表达的shRNA,可以显著抑制Plk1 mRNA、Cdc25CmRNA及Plkl蛋白的表达,并使p53mRNA表达增高,并明显抑制细胞增殖,能增加长春新碱的化疗敏感性,从而为进一步研究该基因的功能和作用机制提供了新的手段.     

靶向Polo-like kinase 1基因的shRNA对肝癌BEL-7402细胞株生物学行为的影响

目的利用RNA（RNAi）干扰技术,研究表达Polo-like kinase 1（Plk1）的短发夹RNA（shR-NA）载体对肝癌细胞株BEL-7402生物学行为的影响。方法根据靶基因的不同区域构建针对Plk1mRNA的两组干扰质粒shRNA-Plk1：Plk1siRNA-251,Plk1siRNA-1396以及阴性对照质粒Plk1siRNA-hk,利用电穿孔法转染入肝癌细胞株BEL-7402,获得稳定表达的克隆后,RT-PCR检测肝癌细胞株BEL-7402的Plk1mRNA的变化,Western blot检测Plk1蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果利用电穿孔将载体转入肝癌细胞株BEL-7402,利用G418筛选,获得稳定表达的克隆。RT-PCR检测Plk1siRNA-251,Plk1siRNA-1396组Plk1mRNA表达较Plk1siRNA-hk转染组与空白对照组明显下降（P〈0.01）。Western blot检测转染BEL-7402细胞shRNA载体后的Plk1蛋白的表达分别为0.032±0.007、0.040±0.008、0.272±0.041、0.278±0.053。MTT检测发现转染shRNA载体后BEL-7402细胞增殖明显减慢。细胞周期检测证实转染Plk1siRNA可以引起BEL-7402细胞G0/G1期减少,G2/M期增高,而对S期影响不大。结论成功构建出两条能特异而高效抑制Plk1基因表达的shRNA,可以显著抑制Plk1 mRNA的转录及Plk1蛋白的表达,并明显抑制细胞增殖,从而为肝癌的基因治疗提供新的切入点。     

乙型肝炎病毒X基因诱导卵圆细胞恶性转化的研究

目的 研究乙型肝炎病毒X(HBx)基因对卵圆细胞转化和分化的影响.方法 用稳定表达HBx的转基因即圆细胞株pEGFP-HBx卵圆细胞作为实验组,pEGFP卵圆细胞及LE/6卵圆细胞作为对照组,运用倒置相差显微镜和透射电镜、流式细胞术、糖原染色、软琼脂生长、实时定量PCR、细胞免疫化学技术观察和检测pEGFP-HBx卵圆细胞在细胞形态、细胞周期、分化标志物、癌基因c-myc及TGF-α的变化.结果 (1)与对照组相比,pEGFP-HBx卵圆细胞体积增大,核具有明显异型性;(2)流式细胞仪检测显示,与对照组相比,pEGFP-HBx卵圆细胞G0/G1期细胞百分比下降,S期和G2/M期细胞百分比明显升高,而且非整倍体细胞明显增多;(3)糖原染色显示,pEGFP-HBx卵圆细胞胞质内可见大量糖原颗粒;(4)软琼脂中可见pEGFP-HBx卵圆细胞克隆形成;(5)癌基因c-myc及TGF-α表达量明显增高,卵圆细胞分化指标HNF-4α、AFP表达上升,CK-7、CK-19表达下降,未见有cps1 mRNA表达.结论 HBx基因可以引起卵圆细胞异常分化,并直接诱导卵圆细胞发生恶性转化.     

稳定表达TSLC1基因骨肉瘤MG63细胞系的建立及鉴定

目的 建立稳定表达人肺癌抑癌基因-1（TSLC1）骨肉瘤细胞系并对其进行鉴定.方法 脂质体转染的方法 将真核表达载体pCI-TSLC1稳定转染至MG63细胞系,经克隆化培养以及G418筛选,获得了1株稳定高表达TSLC1蛋白的细胞系.对其表达的蛋白性质进行了鉴定,对其分泌动态、细胞纯度、遗传稳定性、外源基因整合等生物学特性做了鉴定.结果 获得高表达TSLC1的稳定细胞系,命名为M8T.生物学性状研究结果 表明该转基因细胞系纯度好,遗传性状稳定,抽提细胞RNA进RT-PCR,扩增到与预期结果 大小一致的DNA片段,说明TSLC1基因成功整合到细胞基因组中.细胞系无细菌和霉菌污染.结论 成功建立了稳定表达TSLC1的骨肉瘤细胞系M8T.该细胞系遗传性质稳定,为进一步研究抑癌基因TSLC1在骨肉瘤中的作用奠定了基础.     

HBx基因在乙型肝炎病毒相关性肾炎致病机制中的研究进展

HBx基因是一种多功能的调节因子,具有广泛的反式激活作用,能激活转录因子、抑制DNA修复,并调节细胞的增殖、转化及凋亡.近年来,HBx在乙型肝炎病毒相关性肾炎（HBV-GN）致病中的作用成为研究的热点.研究显示,HBx对肾小球系膜细胞增殖、足细胞及肾小管上皮细胞的损伤及凋亡存在广泛影响.此文就HBx的生物学特性及在肾脏损伤机制中的研究进展进行了综述.     

基因重组人生长激素对体外培养的肝癌细胞增殖的影响及配体调控

目的 了解基因重组人生长激素(rhGH)对体外培养的Bel-7402细胞增殖的影响,并探讨rhGH对肝癌细胞生长激素受体(GHR)的调控作用.方法 分别采用肿瘤细胞计数、MTT比色法和集落形成实验等方法 了解Bel-7402细胞株在不同浓度rhGH(0、1、10、100、1000、10 000 ng/ml)作用下的药物敏感性,计算细胞生长率;用3H-TdR掺入法研究肿瘤细胞DNA代谢情况;应用放射配体法了解Bel-7402细胞GHR的表达,以及rhGH在上述浓度下对肝癌细胞GHR的影响.结果 rhGH对体外培养的Bel-7402细胞的生长有一定程度促进作用,表现为rhGH在100 ng/ml浓度下促进肝癌细胞增殖较为显著,rhGH在其他浓度(1、10、1000、10000 ng/ml)的部分时段,对肝癌细胞的增殖虽亦有一定程度的促进作用,但总体效果较rhGH在100 ng/ml浓度时弱;放射配体法发现Bel-7402细胞表达GHR,在rhGH作用后24 h,Bel-7402细胞GHR的位点数量(103个/细胞)在10、100 ng/ml组较对照组显著增加,在10000ng/ml组较对照组显著减少.结论 一定浓度范围rhGH对Bel-7402细胞的增殖有促进作用,原因可能与Bel-7402细胞表达GHR有关;同时rhGH对Bel-7402细胞的GHR有一定调控作用.     

乙型肝炎病毒x基因上调肝癌细胞胰岛素样生长因子-Ⅱ胚胎启动子活性的研究

目的　研究乙型肝炎病毒x基因（HBx）对肝癌细胞胰岛素样生长因子-Ⅱ(IGF-Ⅱ)启动子活性的影响,探讨HBx基因影响肝癌恶性表型的分子机制。方法　应用定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测QGY7701肝癌细胞株和转HBx基因肝癌细胞株QGY/HBx的IGF-Ⅱ成年启动子P1与胚胎启动子P3、P4的活性。结果　与QGY7701细胞相比,QGY/HBx细胞IGF-Ⅱ基因P1启动子活性无明显改变(分别为3.12±1.18与3.74±1.87,P＞0.05),而P3与P4活性显著升高(2.27±0.68、3.97±1.66与1.20±0.39、1.45±0.43比较,P＜0.05)。结论　HBx基因可上调肝癌细胞IGF-Ⅱ基因胚胎启动子P3、P4活性,这可能HBx基因增强肝癌恶性表型的一个重要机制。     

稳定表达PTEN抑癌基因的炎性乳腺癌细胞系MDA-MB-468的建立和鉴定

目的建立稳定表达外源性PTEN(phosphataseandtensinhomologdeletedfromchromosometen)基因的人炎性乳腺癌MDA MB 468细胞系。方法用脂质体lipofectamine2000转染法,将野生型PTEN基因导入高转移性炎性乳腺癌细胞系MDA MB 468,经G418筛选抗性克隆,扩大培养后,应用RT PCR、免疫组化方法及Westernblot分析目的基因及其蛋白表达。结果野生型PTEN基因成功地导入炎性乳腺癌细胞系MDA MB 468,转染细胞稳定表达PTEN蛋白,PTEN蛋白分布于细胞质。结论MDA MB 468炎性乳腺癌细胞株能稳定表达外源性PTEN基因。     

P120catenin在胰腺癌中的表达及其基因多态性的研究

目的 探讨P120catenin在胰腺癌中的表达及其基因T755G位点多态性与胰腺癌发病因素的关系.方法 分别应用RT-PCR及Western Blot方法检测52例胰腺癌及癌旁正常胰腺组织中P120catenin的表达水平;应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术对52例胰腺癌患者及60名正常对照的P120catenin基因T755G位点基因型分析.结果 胰腺癌组P120catenin mRNA及蛋白表达与癌旁正常胰腺组相比均减少,差异有统计学意义(P=0.000,P=0.002);P120catenin mRNA异常表达更多见于低分化者(P=0.033)、淋巴转移者(P=0.004)、血管侵犯者(P=0.022)和高PTNM分期者(P=0.003).胰腺癌患者P120catenin基因T755G位点基因型频率及等位基因频率与正常组相比,差异有统计学意义(P=0.008,P=0.016).与TT基因型相比,GG基因型可增加胰腺癌发病风险(OR=2.765,95%CI为1.312～3.958).结论 P120catenin低表达与胰腺癌淋巴结转移、血管侵犯、pTNM分期密切相关,提示其可能在胰腺癌侵袭、转移过程中起重要作用.P120catenin基因T755G多态性与胰腺癌的发生风险相关,有利于胰腺癌的早期诊断与预防.     

大鼠肝卵圆细胞的分离与鉴定

目的：分离、培养和鉴定大鼠卵圆细胞。方法：以3'-me-DAB刺激卵圆细胞迅速增生,改良梯度离心法分离、培养大鼠卵圆细胞,观察其形态及增值特点并进行细胞免疫组织化学鉴定。结果：改良的梯度离心的方法能够有效地分离大鼠肝卵圆细胞,卵圆细胞胞体为卵圆形,代谢缓慢,具有干细胞的特点,可以形成集落,并且表达OV6、CD34及Nestin。结论：改良梯度离心法分离的细胞具有干细胞的特点,可以表达卵圆细胞特异性的表面标记OV6、造血干细胞表面标记CD34和神经中间丝蛋白Nestin,具有横向分化的可塑性,为进一步实验研究提供参考依据。     

抑制乙肝病毒X蛋白表达对肝癌细胞上皮-间质转化和凋亡的影响

目的 探讨乙肝病毒X蛋白(HBx)对肝癌细胞转移能力的影响及其机制.方法 采用siRNA干扰技术抑制MHCC97H细胞的HBx表达.通过Transwell小室和裸鼠肺转移模型实验比较HBx抑制前后MHCC97H细胞转移能力的变化.应用Western blotting技术检测肝癌细胞上皮间质转化(EMT)和凋亡相关基因的表达变化.结果 将HBx-siRNA导人MHCC97H细胞可以抑制HBx的表达及其转移能力,可下调EMT相关分子Twist和N-cadherin的表达,并上调E-cad-herin表达而抑制EMT,同时还可通过Twist-P53途径诱发细胞的凋亡.结论 抑制HBx表达可以通过改变上皮-间质转化和诱发凋亡而减弱高侵袭肝癌细胞MHCC7H的转移能力.

Abstract：

Objective To investigate the effects and possible mechanism of action of inhibiting hepatitis B virus X protein (HBx) expression on liver cancer metastasis. Methods The suppression of HBx expression in MHCC97H cells was performed by siRNA interference technique, and the effects of HBx suppression on the metastasis of MHCC97H cells were detected by Matrigel invasion assays and in a lung-metastasis mouse model. The expression levels of related epithelial-mesenchymal transition (EMT) and apoptosis proteins were examined by Western blotting. Results Introduction of HBx-siRNA into MHCC97H cells inhibited the expression of HBx and the ability to metastasize,downregulated the expression of Twist and N-cadherin, and upregulated E-cadherin expression. These changes resulted in inhibiting EMT of MHCC97H cells. Meanwhile, apoptosis involved in the Twist-P53 pathway was also found. Conclusions Inhibiting expression of HBx can decrease the metastatic a-bility of MHCC97H cells by changing EMT and inducing apoptosis.     

受强力霉素调控表达的人肝癌HepG2细胞系的建立

目的建立受强力霉素 (doxycycline)调控表达的人肝癌HepG2细胞系。 方法用阳离子脂质体lipofectamine 2 0 0 0 0将pTet on质粒转染人肝癌HepG2细胞 ,通过G4 18筛选得到稳定转染的抗性克隆 ;将抗性克隆细胞分别培养扩增 ,通过 pTRE luc质粒瞬时转染 ,加入终浓度为 1μg/ml的doxycycline诱导剂培养 4 8h后 ,逐一检测每个细胞株的荧光素酶表达活性。 结果第 6号克隆的细胞诱导后荧光素酶的表达活性为 16 76 4 ,而非诱导状态下该细胞株的背景活性为 87,诱导后的活性增加 192倍。结论HepG2 /Tet on细胞株是可调控基因表达的人肝癌细胞株 ,为研究肝癌的发病和基因治疗提供了较为理想的研究工具。     

稳定表达重组成人型和胎儿型乙酰胆碱受体细胞株的构建

目的 稳定表达重组成人型乙酰胆碱受体(ε-nAChR)和胎儿型乙酰胆碱受体(γ-nAChR)细胞株的构建.方法 通过亚克隆技术将含有乙酰胆碱受体亚基基因的原核细胞表达质粒pSP65a、pSP65β、pSP64γ、pSP65δ和pBssKε分别连接到真核细胞表达质粒pcDNA3.1构建阳性重组子pcDNA3.1α、pcDNA3.1β、pcDAN3.1γ、pcDNA3.Iδ及pcDNA3.1ε,并将含有α、β、δ、ε或α、β、δ、γ亚基基因的重组子按摩尔比2:1:1:1(质粒总量<1.5μg)转染HEK293细胞.采用G418筛选出有ε或γ亚基基因表达的阳性细胞株,再采用免疫荧光法筛选出表达ε-nAChR或γ-nAChR的细胞株,进一步采用全细胞膜片钳技术选出乙酰胆碱诱发ε-nAChR或γ-nAChR产生内向电流的细胞株.结果 酶切鉴定结果显示pSP65α、pSP65β、pSP64γ、pSP65δ和pBssKε均正确定向插入pcDNK3.1.未传代、连续传10代及冻存并复苏的表达ε-nAChR和γ-nAChR的细胞株均可呈现稳定的免疫荧光,荧光主要分布在细胞膜表面.乙酰胆碱刺激后,6株转染ε-nAChR的细胞上记录到100～400 pA内向电流,3株转染γ-nAChR的细胞上记录到200～600 pA内向电流.结论 成功构建出稳定表达ε-nAChR和γ-nAChR的细胞株.     

不同方法HBx基因表达质粒转染肝癌HepG2细胞的效果比较

目的：比较Lipo2000、磷酸钙法和Lonza电转法转染乙型肝炎病毒X（HBx）基因的表达质粒pHA-HBx至HepG2肝癌细胞的转染效率及其细胞毒性。方法：分别用Lipo2000、磷酸钙法和Lonza电转法将绿色荧光蛋白（GFP）标记的pHA-HBx转染至HepG2肝癌细胞,以荧光显微镜及流式细胞仪检测转染效率,RT-PCR鉴定HBx基因在HepG2细胞基因组的整合,Annexin V/PI法检测细胞的存活情况。结果：RT-PCR结果显示,外源性HBx基因通过3种转染方法均可导入HepG2细胞并表达;Lipo2000和Lonza电转法的转染效率均高于磷酸钙法（均P<0.05）,而Lipo2000和Lonza电转法的转染效率间差异无统计学意义（P>0.05）;细胞存活率从高到低依次为Lonza电转法、Lipo2000、磷酸钙法（均P<0.05）。结论：Lonza电转法转染pHA-HBx至HepG2肝癌细胞转染效率高,且细胞毒性小,是较好的转染方法。     

肝细胞癌中HBx的表达及其与肿瘤病理分级的关系

目的 检测乙型肝炎病毒x蛋白(HBx)在肝细胞癌中的表达并探讨其与肝癌病理分级的关系.方法 用免疫组织化学法检测41例肝癌患者肿瘤组织中HBx蛋白的表达,与临床资料进行相关分析,并应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、PCR及Western blot法检测肝癌患者肿瘤组织及血清中HBx的表达.结果 肝癌组织中HBx的总体阳性检出率为27/41(65.85%),HBx+与HBx-者肿瘤组织低分化比例分别为11/27(40.74%)及2/14(14.29%),差异有统计学意义(P<0.01),且肿瘤组织低分化比例随HBx阳性表达程度的增加而增加,HBx强阳性表达者肿瘤组织低分化比例高达4/6(66.67%);RT-PCR对肿瘤组织HBx mRNA的检出率为10/16(62.50%),PCR对血清中HBx拷贝的检出率为1/7(14.29%),Western blot对血清中HBx蛋白的检出率则为6/7(85.71%).结论 肝癌肿瘤组织中HBx的表达与肿瘤的病理分级呈负相关,肿瘤组织低分化比例随HBx阳性表达程度的增加而增加.     

HCV核心基因转染的胆管癌细胞中p53的表达及意义

目的：探讨丙肝病毒感染在胆管癌中的致癌机理。方法：通过分子克隆技术构建HCV－C基因重组质粒（PBK－HCVc)，经酶切鉴定后，将其转染到胆管癌细胞（QBC939）中，经G418选择培养，免疫细胞学，Western blotting鉴定其表达，透射电镜观察细胞形态学改变。并用免疫细胞学检测p53的表达。结果：构建的PBK－HCVc质粒在QBC939细胞中有稳定表达，透射电镜见胞质空泡内球型病毒颗粒，病毒颗粒直径50－80nm，有外膜结构。HCV核心基因转染后QBC939细胞的p53表达比转染前明显增多（P＜0．01）。结论：本实验为进一步探讨丙肝病毒感染与肝门部胆管癌中的致癌机理提供了理想的细胞株模型，HCV核心基因可诱发p53突变，可能与丙肝病毒感染的胆管细胞癌变有关。