乙型肝炎病毒X基因诱导卵圆细胞恶性转化的研究

目的 研究乙型肝炎病毒X(HBx)基因对卵圆细胞转化和分化的影响.方法 用稳定表达HBx的转基因即圆细胞株pEGFP-HBx卵圆细胞作为实验组,pEGFP卵圆细胞及LE/6卵圆细胞作为对照组,运用倒置相差显微镜和透射电镜、流式细胞术、糖原染色、软琼脂生长、实时定量PCR、细胞免疫化学技术观察和检测pEGFP-HBx卵圆细胞在细胞形态、细胞周期、分化标志物、癌基因c-myc及TGF-α的变化.结果 (1)与对照组相比,pEGFP-HBx卵圆细胞体积增大,核具有明显异型性;(2)流式细胞仪检测显示,与对照组相比,pEGFP-HBx卵圆细胞G0/G1期细胞百分比下降,S期和G2/M期细胞百分比明显升高,而且非整倍体细胞明显增多;(3)糖原染色显示,pEGFP-HBx卵圆细胞胞质内可见大量糖原颗粒;(4)软琼脂中可见pEGFP-HBx卵圆细胞克隆形成;(5)癌基因c-myc及TGF-α表达量明显增高,卵圆细胞分化指标HNF-4α、AFP表达上升,CK-7、CK-19表达下降,未见有cps1 mRNA表达.结论 HBx基因可以引起卵圆细胞异常分化,并直接诱导卵圆细胞发生恶性转化.     

Fibulin-5真核表达载体的构建及稳定转染人膀胱癌细胞的研究

目的 构建Fibulin-5真核表达载体并转染人膀胱癌5637细胞.方法 经聚合酶链反应(PCR)扩增Fibulin-5 cDNA,然后将其与pMD-19T载体连接.pMD-19T-Fibulin-5重组体经过限制性内切酶Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ的消化后产生Xho Ⅰ-Fibulin5-EcoR Ⅰ片段.将该片段插入增强型绿色荧光蛋白载体(p-EGFP N1)质粒的相似位点并最终合成p-EGFP-F5质粒重组体,并通过BgⅢ单酶切鉴定.通过脂质体介导法将p-EGFP-F5质粒转染至人膀胱癌5637细胞株内.结果 PCR扩增片段长度为1429 bp.Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切的片段经DNA测序显示Fibulin-5 cDNA插入正确.p-EG-FP-F5质粒重组体经BgⅢ单酶切出一约450 bp的条带.转染48 h后,pEGFP-Fibulin-5和pEGFP-N1转染成功的细胞均有不同程度的绿色荧光表达.结论 成功构建Fibulin-5绿色荧光蛋白真核表达载体并转染至人膀胱癌细胞内.     

可体内、外示踪的BMP2真核表达载体的构建和表达

目的 拟构建双顺反子增强型绿色荧光蛋白标记的人骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein-2,BMP2)真核表达载体,为其在真核细胞体内外示踪定位打下基础.方法 以重组质粒pcDNA3.1/CT-hBMP2为模板,结合已设计好的特异性引物,采用PCR方法获得BMP2片段,将其分别与克隆载体pTA2-T-easy和真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS连接,转化入感受态DH5α细胞中,通过筛选得到含有绿色荧光蛋白的重组表达载体pSELECT-GFPzeo-hBMP2,并进行测序鉴定.将质粒转染CHO细胞后Western Blot检测BMP2蛋白表达,用RT-PCR检测BMP2mRNA表达.结果 琼脂糖电泳显示PCR产物为一条长约1216 bp的带,重组表达载体pSELECT-GFP zeo-hBMP2经双酶切可得到约1216 bp的片段,测序证实与Genebank中hBMP2序列完全相符,重组表达载体脂质体法转染CHO细胞48～72 h后荧光显微镜下证实转染成功,经RT-PCR证实CHO细胞中存在BMP2基因表达,采用免疫荧光化学方法证实载体中CHO细胞表达BMP2蛋白.经Western Blotting鉴定重组蛋白为分泌蛋白,相对分子质量在17×103左右.结论 成功构建可体内外示踪增强含双顺反子绿色荧光蛋白人BMP2真核表达载体.     

基因重组免疫毒素白细胞介素18-PE38融合基因治疗类风湿性关节炎的初步研究

目的构建白细胞介素18(interleukin18,IL-18)-PE38融合基因的真核表达载体,并研究其在小鼠软骨细胞及3T3细胞中的表达,探讨类风湿性关节炎的基因治疗方法. 方法经限制性内切酶双酶切从质粒PRKL459K-IL18-PE38中获取IL-18-PE38融合基因, 将其与真核表达载体PsecTag2B连接,转化感受态菌,挑取单克隆培养并提取质粒,EcoRⅠ单酶切鉴定.脂质体转染法将构建的真核表达载体转染入3T3细胞及小鼠软骨细胞中,分别设置空载体对照,通过荧光免疫细胞化学法鉴定转染后瞬时表达情况. 结果 EcoRⅠ单酶切后电泳鉴定显示,所构建的真核表达载体PsecTag2B-IL-18-PE38片段长度约为6 000 bp.荧光免疫细胞化学法、荧光显微镜摄片均显示转染融合基因组荧光表达强,空载体对照组荧光表达微弱. 结论 IL-18-PE38融合基因真核表达载体构建成功,并在小鼠软骨细胞及3T3细胞中表达,为类风湿性关节炎的基因治疗研究奠定基础.     

睾丸特异性新基因T490真核荧光表达载体的构建及其表达

目的 构建含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的睾丸特异性新基因T490超表达质粒pDT490-EGFP,检测其在Hela细胞中的表达情况.方法 采用RT-PCR的方法从成年Balb/c小鼠睾丸组织中扩增T490基冈,将该基凶连接克降到含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的真核表达载体pEGFP-N1上,再将T490和EGFP融合基因酶切下来,克隆到pcDNA3.1(-)真核超表达载体上,以构建重组质粒pDT490EGFP.将该重组质粒通过阳性脂质体Lipofectamine 2000导入Hela细胞系中,在荧光显微镜F观察转染24h后融合基因的超表达情况,并用RT-PCR的方法进一步证实目的 基因mRNA的表达水平.结果 RT-PCR获取编码T490基因的全序列cDNA,大小为508bp;DNA测序和PCR方法证实T490和EGFP融合基因成功克隆到真核超表达载体L;在荧光显微镜下,转染24h后的Hela细胞具有很强的绿色荧光;RT.PCR显示转染后的Hela细胞T490基因mRNA的表达明显.结论 重组质粒pDT490-EGFP构建成功,并在细胞内明显表达,此质粒可应用于研究睾丸特异性新基因T490的功能,为T490的生物学研究奠定基础.     

乙型肝炎病毒X蛋白对卵圆细胞中Smad2、Smad3、Smad4基因表达的调控作用

目的 观察乙型肝炎病毒编码X蛋白(HBX)对肝脏卵圆细胞中转化生长因子-β(TGF-β)/Smad中核心元件Smad2、Smad3、Smad4表达的调控作用。方法 稳定转染HBX基因的大鼠卵圆细胞株HBX-EGFP-LE/6作为实验组,转染绿色荧光蛋白标记空载体的大鼠卵圆细胞株EGFP-LE/6,大鼠卵圆细胞株LE/6作为对照组。Real-time聚合酶链反应(PCR)与Western blot分别检测3种细胞株中Smad2、Smad3、Smad4的mRNA和蛋白表达。结果 对照组Smad3的mRNA表达量分别是实验组的(4.56±0.79)倍和(4.14±0.38)倍,差异有统计学意义(P＜0.01)。对照组Smad4的mRNA表达量分别是实验组的(1.41±0.04)倍和(1.63±0.43)倍,差异有统计学意义(P＜0.01)。实验组Smad3蛋白表达水平有一定程度降低。结论 HBX可以在卵圆细胞中影响TGF-β/Smad信号通路中的核心元件Smad3的转录及蛋白合成,对Smad4的转录有一定影响。     

WWOX基因真核表达载体的构建及其在SMMC-7721中的表达

目的克隆人WWOX基因及构建WWOX基因真核表达载体并研究其表达。方法取人新鲜正常肝组织，提取总RNA，采用逆转录-聚合酶联链反应（RT—PCR）扩增WWOX基因，将该基因定向克隆到真核表达载体pEGFP—N1中，构建真核细胞表达载体pEGFP—N1-WWOX，用限制性内切酶酶切分析，DNA序列分析鉴定重组质粒；将测序正确的WWOX基因通过脂质体介导下转染肝癌细胞SMMC-7721。结果重组质粒pEGFP—N1-WWOX经HindⅢ和BamHI双酶切后，获得4700bp片断和1234bp插入片断，序列分析表明插入的片段与Gene Bank发布的序列一致；荧光显微镜下可见转染的SMMC-7721细胞有绿色荧光蛋白的表达。结论成功构建了真核表达载体pEGFP—N1-WWOX，WWOX基因在SMMC-7721细胞内成功表达。     

Tip30真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的：探讨人Tip30全长基因的真核表达载体pAAV-TIP30的构建,并观察其转染肝癌细胞株HepG2后的表达。方法：以正常人肝组织mRNA为模板,用RT-PCR方法扩增Tip30,利用限制性内切酶BamH I和Xba I,将Tip30基因克隆到真核表达载体pAAV-MCS中,并经酶切和测序鉴定。重组质粒转染HepG2细胞,运用Western blot法检测Tip30蛋白表达。结果：RT-PCR方法正确地扩增出全长Tip30基因。限制性内切酶酶切和测序结果证实Tip30基因克隆完全正确。重组质粒转染肝癌细胞系HepG2后,Western blot证实Tip30蛋白表达增高。结论：成功构建了真核表达重组质粒pAAV-TIP30并转染HepG2细胞,为进一步研究Tip30基因对肝癌的影响及其机制打下了基础。     

真核表达载体pcDNA3.1-β淀粉样前体蛋白裂解酶的构建及其在COS-7细胞中瞬时表达

目的 构建β淀粉样前体蛋白裂解酶（β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme，BACE）基因的真核表达载体，为修复阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）损伤神经元奠定基础。方法采用RT-PCR方法，从人的成神经细胞瘤的总cDNA中，扩增出1．5kb的BACE cDNA片段，再用BamHI和XhoI双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中，用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒；以免疫细胞化学法检测BACE基因的表达情况。结果人BACE基因的cDNA已克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1质粒中；经脂质体转染COS-7细胞后，并由潮霉素进行筛选，可见转染细胞胞浆中和胞膜上有较高量的BACE蛋白表达。结论成功构建了pcDNA3．1-BACE的真核表达载体，为研究BACE基因在AD发病机制中的作用及抑制BACE，为治疗AD奠定一定的实验基础。     

大鼠pEGFP-N1-PLZF真核表达载体的构建和意义

目的构建真核表达载体pEGFP-N1-PLZF，为基因水平研究早幼粒细胞白血病锌指蛋白（PLZF）在精原千细胞增殖和分化中的调控机制提供理论参考。方法参考分子克隆技术，采用RT-PCR的方法从大鼠睾丸组织中扩增PLZF，将该基因连接克隆到含有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的真核表达载体pEGFP-N1上，以构建重组质粒pEGFP-N1-PLZF。结果实验从大鼠睾丸组织中提取总RNA，以RT-PCR方法获取编码PLZF基因的全序列cDNA。构建PLZF的CDNA真核表达质粒时将能发出绿色荧光的EGFP报告基因融合在PLZF基因，并经酶切后DNA电泳鉴定及DNA测序证实结果。结论构建重组质粒pEGFP-N1-PLZF成功，实验中将能发出绿色荧光的EGFP报告基因融合在PLZF基因的3’端。提高PLZF在真核细胞中的表达，而且不影响其目的蛋白的结构和功能，对研究PLZF调控精原干细胞增殖和分化机制具有重要的意义。     

乙型肝炎病毒X蛋白对DNA甲基转移酶3A/3B表达的影响

目的观察乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）对QSG7701细胞中DNA甲基转移酶（DNMT）3A/3B表达的影响。方法本研究室前期构建好的重组表达质粒pcDNA-X及空载体pcDNA3.0分别转染QSG7701细胞,经含G418的选择性培养基筛选获得稳定转染HBV-X基因的细胞克隆（pcDNA-X/QSG7701）及稳定转染空载体pcDNA3.0的细胞克隆（pcDNA3.0/QSG7701）。采用RT-PCR、Westernblot分别检测转染细胞中HBxmRNA和HBx蛋白的表达。Real-timePCR检测3种细胞DNMT3A/3BmRNA的表达情况。免疫组织化学法检测3种细胞DNMT3A/3B蛋白的表达情况。结果RT-PCR、Westernblot检测结果显示pcDNA-X/QSG7701细胞中有HBxmRNA及HBx蛋白的表达。Real-timePCR结果显示pcDNA-X/QSG7701中DNMT3A/3BmRNA表达水平显著高于pcDNA3.0/QSG7701及未转染的细胞QSG7701（P〈0.05）。免疫组织化学检测结果显示pcDNA-X/QSG7701细胞中DNMT3A/3B蛋白表达水平显著高于pcDNA3.0/QSG7701及QSG7701细胞（P〈0.05）。结论稳定转染HBV-X基因的人源性永生化非瘤性肝细胞QSG7701中DNMT3A/3BmRNA和蛋白的表达水平均显著升高,提示HBV-X基因在mRNA及蛋白水平能上调转染细胞中DNMT3A/3B的表达,而细胞中DNMT3A/3B表达的增加是否能进一步影响癌基因、抑癌基因的表达水平,从而导致细胞癌变,尚有待进一步研究。     

表达丙肝病毒核心蛋白基因的人肝细胞模型的建立

目的 构建表达丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV-C)基因的人肝细胞模型。方法用聚合酶链反应(PCR)方法从pHCV-MA质粒中钩出HCV-C基因，酶切纯化后克隆于质粒pTRE中，建立重组质粒pTRE-C。pTRE-C经酶切、纯化后目的片段与质粒PcDNA3连接，通过限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定筛选出正确重组质粒PcDNA3-tRe-C，由脂质体介导转染Chang-liver人肝细胞，建立表达HCV-C基因的人肝细胞模型，PCR方法鉴定Chang-1iver人肝细胞内HCV-C基因。反转录聚合酶链反应(RT—PCR)方法检测HCV—C基因在Chang—liver人肝细胞内的表达，抗生物索蛋白-生物素-过氧化物酶复合体法(ABC法)方法分析HCV核心蛋白在人肝细胞内的表达及定位。结果 构建了表达HCV-C基因的重组真核表达载体，并在Chang-1iver人肝细胞中表达出HCV-C蛋白。结论 成功地建立了表达HCV—C基因的人肝细胞模型，该模型为进一步研究HCV-C的生物学特性及HCV感染所致肝硬化、肝癌的致病机制提供基础材料。     

MAGE-A3基因过量表达对人肝癌细胞株SMMC7721的作用

目的 观察MAGE-A3基因过量表达对人肝癌细胞株增殖及侵袭能力的影响.方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从肝癌组织中制备出含NheI和KpnI酶切位点的MAGE-A3目的 基因,克隆到pcDNA3.1(-)真核表达载体,并通过酶切鉴定、测序验证.经脂质体法正义瞬时转染肝癌细胞株SMMC7721,通过RT-PCR、Western blot分别检测MAGE-A3 mRNA和蛋白表达产量.以噻唑蓝(MTT)比色法、Boy-den小室实验观察MAGE-A3基因过量表达对人肝癌细胞增殖及侵袭的影响.结果成功扩增出目的 基因;得到重组质粒pcDNA3.1-MAGE-A3,经过酶切鉴定与测序,结果正确;RT-PCR和Western blot检测显示,MAGE-A3基因mRNA及蛋白产物的表达水平明显高于未转染组和空载体组(3组MAGE-A3 mRNA量分别为7838、2847、1557,蛋白量分别为30938、24 088、29 654);转染组细胞数量增多,穿透Matrigel膜的细胞数显著增加,与未转染组和空载体组比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 成功构建pcDNA3.1-MAGE-A3真核表达载体,转染人肝癌细胞株SMMC7721后可促进细胞增殖和侵袭能力,提示MAGE-A3基因在肝癌复发和转移中起到重要作用.     

转乙型肝炎病毒x基因肝癌细胞株的建立

目的 建立表达转乙型肝炎病毒Ｘ基因（ＨＢＸ）的人肝癌细胞株,为研究ＨＢＸ基因与肝癌生物学行为间的关系提供模型。方法 以聚合酶链反应（ＰＣＲ）法从３．２ｋｂ 型肝炎病毒（ＨＢＶ）全基因组中主增ＨＢＸ基因,亚克隆至逆转 功体,磷酸钙共沉淀法将其导入包装细胞系,以含病毒的培养上清感染人肝癌细胞系ＱＧＹ７７０１,新霉素（Ｇ４１８）筛选,ＰＣＲ与反转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）鉴定。结果 ＰＣＲ法从ＨＢＶ基因     

乙型肝炎病毒X基因转染人胆管癌细胞系及对端粒酶逆转录酶mRNA表达的影响

目的了解乙型肝炎病毒X(HBx)基因转染对胆管癌细胞端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA的表达影响,阐明HBx基因调节hTERT基因转录表达在胆管癌发生中的意义。方法体外培养胆管癌细胞QBC939,应用脂质体介导的基因转染技术,将含HBx基因的真核表达载体转染到胆管癌细胞中;转染36h后以增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)表达判定转染成功率,流式细胞仪检测转染率;收集细胞提取总RNA,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析转染后细胞内hTERT mRNA的表达变化,并通过细胞免疫化学和Western Blotting了解转染后胆管癌细胞内有无HBx蛋白的表达。结果转染含HBx基因表达载体和空载体的QBC939转染率为29．6％;转染HBx基因后hTERT mRNA表达量比未经转染或转染空载体的hTERT mRNA表达量明显增加;细胞免疫组化和Western Blotting也证实只在转染了HBx基因的胆管癌细胞有HBx蛋白表达。结论HBx基因转染能上调胆管癌细胞hTERT mRNA的转录表达。     

重组质粒pEGFP-N2-GPC3的构建及GPC3对生长因子FGF2、IGF2促进细胞增殖的影响

目的 构建GPC3基因真核表达重组质粒,观察GPC3对生长因子FGF2、IGF2促进肝癌细胞增殖的影响.方法 自行设计引物从GPC3原核扩增重组质粒pDNR-LIB.GPC3中获得编码GPC3的基因片段.应用基因重组技术,将GPC3基因片段克隆到真核表达载体pEGFP-N2中,然后经脂质体介导转染SK-Hep-1,并通过C418(600 mg/L)筛选出抗性克隆,应用荧光显微镜及逆转录-聚合酶链反应(RT-PER)法对转染细胞内pEGFP-GPC3的表达进行鉴定,采用噻唑蓝(MTT)比色法研究GPC3对生长因子FGF2、IGF2促细胞增殖效应的影响.结果 限制性内切酶酶切分析、重组质粒测序鉴定表明为正确重组子,荧光显微镜下可见转染的SK-Hep-1胞膜区发出强绿色荧光,RT-PCR表明GPC3在SK-Hep-1中成功表达,生长因子实验中,GPC3明显抑制FGF2促细胞增殖效应,与空质粒转染组比较差异有统计学意义(P<0.05),IGF2实验组与空质粒转染组比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 测序表明,编码的氨基酸序列与人GPC3完全一致;构建完成真核表达重组质粒pEGFP-N2-GPC3;GPC3基因在SK-Hep-1中成功表达;GPC3在FGF2信号通路中可能发挥负性调控因子的作用.     

SD大鼠MSX-2基因真核表达载体的构建与功能鉴定

目的 构建SD大鼠颅颌面发育相关基因MSX-2与PcDNA 3.1融合的高效真核表达载体,为研究MSX-2基因的功能奠定基础.方法 根据SD大鼠MSX-2基因的核苷酸序列,设计并合成引物,采用PCR技术,扩增编码MSX-2基因,TA克隆到PMD18-T载体上,再亚克隆到真核表达载体PcDNA 3.1的BamHI和Xhol位点.对该重组体进行酶切鉴定,以及测序验证.重组体转染HEK293细胞,RT-PCR和Western blot检测重组MSX-2基因的RNA和蛋白表达情况.结果 重组真核表达载体PcDNA3.1-MSX-2经PCR扩增、酶切鉴定均显示有476bp左右的特异性基因片断,证明MSX-2基因正向插入真核表达载体中;碱基序列的测定证明重组质粒中含有SD大鼠的MSX-2基因序列.重组体转染HEK293细胞,RT-PCR和Western blot可检测到重组MSX-2基因的mRNA和蛋白的特异表达.结论 成功构建SD大鼠MSX-2基因的高效真核表达载体,为进一步研究MSX-2基因的功能及基因治疗奠定了基础.     

肝细胞癌高表达新基因BC047440功能的研究

目的探讨肝细胞癌高表达新基因BC047440在肝癌形成中的作用。方法通过DOTAP^TM脂质体介导的转染技术，将BC047440基因反义真核表达载体导入HepG2肝癌细胞，经G418筛选，获得稳定表达BC047440反义基因的HepG2肝癌细胞，采用半定量RT—PCR检测反义基因对转染细胞的内源性BC047440基因抑制效果，噻唑蓝（MTT）比色法观察转染细胞生长曲线及流式细胞术比较细胞周期的变化。结果转染BC047440反义基因的肝癌细胞内源性BC047440基因受到有效抑制，细胞生长速度明显减慢，细胞周期中G1期细胞比例明显增高。结论肝细胞癌高表达基因BC047440可能是一个新的肝癌相关基因，在肝癌中的异常高表达可能对肝癌的发生发展具有一定的促进作用。