稳定表达EGFP-LC3蛋白SH-SY5Y细胞系的构建

目的:建立稳定表达微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3)与绿色荧光蛋白(EGFP)形成的融合蛋白(EGFP-LC3)的人神经母细胞瘤株SH-SY5 Y细胞系,验证EGFP-LC3点状聚集物能够实时直观地反映自噬小体和自噬流.方法:以人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)的cDNA为模板,克隆LC3,并连接EGFP绿色荧光蛋白.将EGFP-LC3连接入慢病毒载体GV348中,构建慢病毒表达载体EGFP-LC3-GV348.慢病毒转染人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5 Y细胞),使用3μg/mL嘌呤霉素筛选并处理细胞1月,筛选得到EGFP-LC3稳转系.诱导自噬后,用共聚焦显微镜观察LC3荧光斑点并定量分析.Western blot检测目的蛋白表达情况.结果:经酶切证实,EGFP-LC3-GV348慢病毒表达载体构建正确.在激光共聚焦显微镜下,可以观察到细胞内的绿色荧光EGFP代表的自噬小体,活体染料LysoTracker Red DND-99将溶酶体染成红色荧光,红色荧光与绿色荧光重叠代表自噬溶酶体.无血清诱导自噬后,自噬小体(绿色荧光斑点)明显增加,差异有统计学意义(P<0.001).Western Blot免疫印迹可见EGFP-LC3融合蛋白表达条带.结论:成功构建了稳定表达EGFP-LC3的SH-SY5 Y细胞系,EGFP-LC3荧光斑点可以直观实时反映自噬囊泡,为进一步探讨神经退行性疾病的自噬机制提供了实验基础.     

微波辐射诱导人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡的可能机制

目的:观察微波辐射对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡的影响,并探讨其机制.方法:采用10、30和50 mW·cm-2辐射强度的微波辐射SH-SY5Y细胞5 min,以假辐射组(0 mW·cm-2)为对照,光镜下观察细胞形态变化;荧光显微镜下观察DAPI染色细胞核的形态;CTAB法提取细胞基因组DNA,电泳观察DNA...     

反义P38cDNA抑制胆红素诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡

目的：观察P38激酶特异性抑制剂SB203580及反义P38激酶cDNA对胆红素诱导人神经母细囊瘤SH—SY5Y细胞凋亡的影响，探讨P38激酶信号转导通路在胆红素诱导SH—SY5Y细胞凋亡中的作用及高胆红素血症损伤中枢神经细胞的分子机制及在听神经病发病中的作用。方法：分别经SB203580和二甲基亚砜预处理的SH—SY5Y细胞在胆红素作用3h和5h后，在倒置光显微镜下观察细胞形态的变化及存活情况；流式细胞仪检测凋亡细胞百分率。采用脂质体法将含人反义P38cDNA的真核表达载体pcDNA3．O—antiP38导入SH—SYSY细胞，建立稳定低表达P38蛋白的细胞株，经Western blotting鉴定后命名为SH—SY5Y—antiP38，而转染空载体pcDNA3．0的SH—SY5Y细胞株则命名为SH—SY5Y细胞株则命名为SH-SY5Y-pcDNA3.0；SH—SY5Y—antiP38细胞和SH-SY5Y-pcDNA3．O细胞分别经胆红素作用3h和5h，在倒置光显微镜下观察细胞形态的变化及存活情况；流式细胞仪检测凋亡细胞百分率。结果：在0．02g／L胆红素作用下，流式细胞仪显示与对照相比SB203580预处理的SH—SY5Y细胞在胆红素作用3h后，其凋亡细胞由19．4％下降到12．1％，5h后由66．2％降到39．3％；与SH—SY5Y—pcDNA3．O细胞相比，SH—SY5Y—antiP38细胞在胆红素作用3h后，其凋亡细胞由11．1％降到8．02％，5h后67％降到23．4％。结论：P38激酶参与了胆红素诱导SH—SY5Y细胞凋亡的信号转导。P38通路的激活可能在高胆红素血症导致的神经细胞损伤中(包括听神经细胞)发挥重要作用。     

TOCP对人成神经瘤细胞SH-SY5Y的氧化损伤作用

目的研究三邻甲苯基磷酸酯（TOCP）对人成神经瘤细胞（SH．SY5Y）的氧化损伤作用。方法常规方法培养SH-SY5Y细胞,经TOCP染毒,分别检测不同浓度（0～1．0mmol／L）TOCP作用48h以及相同浓度FOCP（0．5mm01／L）作用不同时间后（0、24、48、72h）细胞内丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）的含量变化,MDA舍量用硫代巴比妥酸法（TBA）检测,CAT含量用可见光分光光度法检测。结果TOCP染毒SH-SY5Y细胞48h均半数抑制浓度（IC50）为0．77mmol／L。随着TOCP染毒浓度的增高,细胞内MDA的含量逐渐增高,CAT含量逐渐下降,这种变化趋势呈现明显的剂量一效应关系（P〈0．05）。随着TOCP染毒时间的延长,细胞内MDA和CAT含量均呈明显的时间一效应关系。结论TOCP对SH-SY5Y细胞有明显的氧化损伤作用。     

纳米SiO2对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的凋亡诱导作用及其机制

目的:探讨纳米二氧化硅(SiO₂)对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡和周期的影响,阐明其作用机制。方法:选取不同浓度粒径为90 nm的SiO₂颗粒作用于SH-SY5Y细胞,分别为0、3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 mg·L^-1 SiO₂组,其中0 mg·L^-1组为对照组。MTT法检测各组SH-SY5Y细胞存活率;采用AO/EB染色和 Annexin Ⅴ-FITC/PI法检测各组细胞凋亡率;流式细胞术(FCM)检测细胞周期百分比和细胞中活性氧(ROS)水平。结果:MTT检测,6.250、12.500、25.000和50.000 mg·L^-1 SiO₂组细胞存活率低于对照组 (P<0.05),12.500、25.000和50.000 mg·L^-1 SiO₂组细胞存活率低于3.125 mg·L^-1 SiO₂组 (P<0.05)。AO/EB染色和 Annexin V-FITC/PI法检测,6.250、12.500、25.000和50.000 mg·L^-1 SiO₂组细胞凋亡率高于对照组(P<0.05),12.500、25.000和50.000 mg·L^-1 SiO₂组细胞凋亡率高于3.125 mg·L^-1 SiO₂组(P<0.05)。FCM检测,3.125、6.250、12.500、25.000和50.000 mg·L^-1 SiO₂组细胞中ROS水平高于对照组 (P<0.05)。25.000和50.000 mg·L^-1 SiO₂组G₀/G₁期细胞百分比低于3.125 mg·L^-1SiO₂组和对照组(P<0.05),50.000 mg·L^-1 SiO₂组G₂/M期细胞百分比高于对照组 (P<0.05)。结论:纳米SiO₂ 可降低SH-SY5Y细胞的活力,诱导细胞凋亡,增加细胞中ROS水平,可干扰细胞周期进程,对SH-SY5Y细胞的增殖具有抑制作用。     

白藜芦醇对SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞增殖的影响研究

目的 观察不同浓度白藜芦醇及不同作用时间对SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞生长的影响,并对其增殖进行初步研究.方法 用MTT方法观察不同浓度(12.5、25、50、100)μmol/L白藜芦醇作用20 h、30 h、40 h 后SY5Y细胞存活的数量.用增殖仪器观察不同浓度(32、63、125)μmol/L白藜芦醇作用40 h内SH-SY5Y细胞数量变化情况.用显微镜观察不同浓度药物作用20 h、30 h、40 h时的细胞状态.结果 MTT结果显示白藜芦醇对SY5Y细胞的抑制率随着药物浓度的增加而增加,并且每个浓度的抑制率在作用40 h最大,P值小于0.05,具有统计学意义. 增殖仪器显示白藜芦醇能够抑制该细胞的增殖,并且随着白藜芦醇浓度的增加,抑制细胞增殖的作用越明显.药物作用细胞后显微镜观察可看出,白藜芦醇作用的细胞密度变小,变圆、变亮.随着白藜芦醇浓度的增加,抑制细胞增殖的作用越明显. 结论 白藜芦醇对SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞的增殖具有抑制作用.     

枳壳活性成分对人神经母细胞瘤株SH-SY5Y生长的影响

目的：探讨枳壳醇提有效部位及其所含部分单体成分对人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y生长的影响。方法：将细胞分为不同给药组,给以枳壳醇提有效部位及其所含的川陈皮素、红橘素、伞形酮和葡萄内酯不同浓度的试药,以四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定细胞的活力,分析药物对SH-SY5Y细胞生长的作用。结果：红橘素和伞形酮在实验浓度下对SH-SY5Y细胞生长无显著性影响;枳壳醇提有效部位、川陈皮素和葡萄内酯在实验浓度下对SH-SY5Y细胞生长有显著性影响,且呈浓度效应关系。结论：枳壳醇提有效部位、葡萄内酯和川陈皮素对神经细胞生长有保护作用。     

芍药苷通过促进细胞自噬抑制H2O2诱导的SH-SY5Y细胞的氧化损伤

目的研究芍药苷对氧化损伤细胞模型的抗氧化作用和细胞自噬的调控作用。方法以H_2O_2诱导的SH-SY5Y细胞系构建氧化损伤模型。实验设对照组,模型组,芍药苷低、中、高剂量组。采用MTT法检测芍药苷干预后细胞存活率;2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)检测细胞内ROS水平;Ad-mCherry-GFP-LC3B融合蛋白腺病毒检测细胞自噬水平;Western blot检测细胞自噬相关蛋白LC3及SQSTM1/p62的表达水平。结果 250μmol/L H_2O_2干预24 h后SH-SY5Y细胞存活率约55%为模型复制条件。芍药苷低、中、高剂量干预后,与模型组比较,细胞存活率呈剂量依赖性上升(P0.05)。与对照组相比,模型组细胞内ROS水平升高,差异具有统计学意义(P0.05);自噬溶酶体形成受阻;LC3Ⅱ及SQSTM1/p62在细胞内表达升高,差异具有统计学意义(P0.05)。芍药苷的干预可促进自噬小体与溶酶体结合;与模型组比较,芍药苷中、高剂量组细胞内ROS水平显著下调(P0.05);细胞内LC3Ⅱ及SQSTM1/p62的表达降低,差异具有统计学意义(P0.05)。结论芍药苷可通过促进细胞自噬改善H_2O_2诱导的SH-SY5Y细胞氧化损伤。     

稳定表达人MCHR2的SH-SY5Y细胞系的建立

目的：构建黑色素浓集激素受体2（MCHR2）/增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合蛋白真核表达载体pEGFPN1-MCHR2,转染人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y,建立稳定表达人MCHR2的SH-SY5Y细胞系MCHR2-SH-SY5Y。方法：采用聚合酶链反应(PCR)法从人胎脑cDNA文库扩增MCHR2全长cDNA片段。用基因重组方法将其克隆到质粒pEGFPN1,构建真核表达载体pEGFPN1-MCHR2,并用Lipofectamine^TM转染到SH-SY5Y细胞,通过G418筛选,建立稳定表达MCHR2的MCHR2-SH-SY5Y细胞系,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blotting检测MCHR2的表达并用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白亚细胞定位。结果：扩增出人MCHR2全长cDNA;成功构建真核表达载体pEGFPN1-MCHR2;RT-PCR、Western blotting检测到MCHR2-SH-SY5Y细胞MCHR2的表达,激光共聚焦显微镜观察转染pEGFPN1-MCHR2的MCHR2-SH-SY5Y细胞融合蛋白定位于细胞膜,而转染空质粒pEGFPN1的SH-SY5Y细胞EGFP定位于细胞质。结论：成功建立稳定表达人MCHR2的MCHR2-SH-SY5Y细胞株。     

瘦素减轻鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞损伤

目的 探讨瘦素对鱼藤酮（rotenone） 所诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y 细胞凋亡的抑制作用。 方法 建立鱼藤酮诱导的SH-SY5Y 细胞损伤模型,用瘦素进行干预,采用MTT 比色法检测细胞存活率,锥虫蓝检测细胞死亡率,细胞形态学观察,并用Western blot 法检测Bcl-2、Bax、p-GSK-3β（Ser9） 和GSK-3β 的表达水平,免疫荧光检测α-synuclein 的表达水平。 结果 成功建立了鱼藤酮诱导的SH-SY5Y 细胞损伤模型。在模型的基础上,瘦素干预后,细胞状态改善,细胞存活率提高约14%（P ＜ 0.05）,细胞死亡率降低约17%（P ＜ 0.05）,α-synuclein 的浓度下降,Bcl-2 和p-GSK-3β 的表达显著提高。 结论 瘦素对鱼藤酮诱导的SH-SY5Y 细胞损伤具有明显的抑制作用,可能是通过抑制GSK-3β 的活性上调Bcl-2/Bax 的比率和降低α-synuclein 的表达而得以实现。     

氯化钴诱导SH-SY5Y细胞缺氧损伤作用的研究

目的探讨氯化钴(Co Cl2)诱导SH-SY5Y细胞缺氧损伤的作用及相关机制。方法用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)观察不同浓度Co Cl2对SH-SY5Y细胞生长情况影响;ELISA法检测细胞内相关凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3及缺氧相关蛋白HIF-1α的表达情况。结果 Co Cl2可以诱导SH-SY5Y细胞损伤,并呈现浓度和时间依赖性;Co Cl2作用于SH-Y5Y细胞导致HIF-1α、Caspace-3和Bax的表达增多(P<0.05),Bcl-2表达减少(P<0.01)。结论 Co Cl2诱导SH-SY5Y细胞缺氧损伤与上调HIF-1α表达、促进细胞凋亡有关。     

14-3-3蛋白过表达对SH-SY5Y细胞的保护作用

目的探讨14-3-3蛋白过表达对神经母细胞瘤细胞株（SH-SY5Y）的保护作用和可能机制。方法利用脂质体转染的方法在SH-SY5Y细胞株中瞬时表达14-3-3蛋白。通过四甲基偶氮唑盐（MTT）法、Ho-echst 33342染色法、流式细胞仪和荧光显微镜分别检测14-3-3蛋白过表达对神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y的细胞活性、细胞凋亡、细胞内活性氧类物质（ROS）水平的影响。结果 14-3-3蛋白过表达可促进SH-SY5Y细胞的增殖;抑制SH-SY5Y细胞内ROS的产生。结论 14-3-3过表达对SH-SY5Y起神经保护作用,其机制可能是通过抑制细胞内ROS的产生而实现的。     

SH-SY5Y human neuroblastoma cell line: in vitro cell model of dopaminergic neurons in Parkinson’s disease

Objective To evaluate the human neuroblastoma SH-SY5Y cell line as an in vitro model of dopaminergic （DAergic） neurons for Parkinson＇s disease （PD） research and to determine the effect of differentiation on this cell model. Date sources The data of this review were selected from the original reports and reviews related to SH-SY5Y cells published in Chinese and foreign journals （Pubmed 1973 to 2009）. Study selection After searching the literature, 60 articles were selected to address this review. Results The SH-SY5Y cell line has become a popular cell model for PD research because this cell line posses many characteristics of DAergic neurons. For example, these cells express tyrosine hydroxylase and dopamine-13-hydroxylase, as well as the dopamine transporter. Moreover, this cell line can be differentiated into a functionally mature neuronal phenotype in the presence of various agents. Upon differentiation, SH-SY5Y cells stop proliferating and a constant cell number is subsequently maintained. However, different differentiating agents induce different neuronal phenotypes and biochemical changes. For example, retinoic acid induces differentiation toward a cholinergic neuronal phenotype and increases the susceptibility of SH-SY5Y cells to neurotoxins and neuroprotective agents, whereas treatment with retinoic acid followed by phorbol ester 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate results in a DAergic neuronal phenotype and decreases the susceptibility of cells to neurotoxins and neuroprotective agents. Some differentiating agents also alter kinetics of 1-methyl-4-phenyl-pyridinium （MPP~） uptake, making SH-SY5Y cells more similar to primary mesencephalic neurons. Conclusions Differentiated and undifferentiated SH-SY5Y cells have been widely used as a cell model of DAergic neurons for PD research. Some differentiating agents afford SH-SY5Y cells with more potential for studying neurotoxiclty and neuroprotection and are thus more relevant to experimental PD research.     

瘦素减轻6-羟基多巴胺诱导的SH-SY5Y细胞损伤

目的探讨瘦素对6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine,6-OHDA）所诱导的人神经母细胞瘤细胞（SH—SY5Y）凋亡的抑制作用。方法建立6-OHDA诱导的SH—SY5Y细胞损伤模型,用瘦素进行干预,采用倒置显微镜观察细胞形态,MTT法检测细胞活性,LDH法检测细胞损伤,台盼蓝检测细胞死亡率,流式细胞术检测细胞凋亡率,并用免疫荧光检测activecaspase-3的荧光强度,Westernblot检测Bcl-2和Bax的表达水平。结果成功建立了6-OHDA诱导的SH—SY5Y细胞损伤模型。在模型的基础上,瘦素干预后,细胞凋亡率降低约15％,细胞存活率提高约14％,细胞损伤降低率和死亡率,activecaspase-3的浓度下降,Bcl～2／Bax的比值显著提高（P〈0．05）。结论瘦素对6-OHDA诱导的SH—SY5Y细胞凋亡具有一定的抑制作用,这对瘦素可能参与帕金森病的保护作用提供了证据。     

氯化钴预处理在培养分化的人神经母细胞瘤细胞株缺氧损伤中的保护作用

目的 探讨氧化钴(CoCl2)对体外培养分化的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞株的缺氧损伤保护作用及缺氧诱导因子1、2和其调节基因产物血管内皮生长因子在其中的作用.方法 分化的SH-SY5Y细胞分为对照组、化学缺氧预处理组(细胞用50 μmol/L CoCl2预处理3 h,换液后常氧培养1 h,然后在2%的低氧孵箱内缺氧28 h)、缺氧组(无CoCl2预处理过程,其余同化学缺氧预处理组).用Western blotting法测细胞HIF-1α、HIF-2α和VEGF的蛋白表达,通过乳酸脱氢酶释放率测定、MTT细胞活力测定判断细胞损伤程度.结果 化学缺氧预处理组细胞 HIF-2α和VEGF的蛋白表达显著高于缺氧组(P＜0.01),HIF-1α蛋白表达在两组之间没有显著性差异(P＞0.05),化学缺氧预处理组细胞较缺氧组细胞存活率高、乳酸脱氢酶释放率减少(P＜0.01).结论 CoCl2化学预缺氧可保护分化的SH-SY5Y细胞对缺氧产生耐受,缺氧预处理可能通过HIF-2促进VEGF的表达而产生保护作用.