细粒棘球绦虫囊液McAb的制备及鉴定

McAbs were prepared by fusing SP2/0 cells with spleen cells of BALB/c mice immunized with hydatid cyst fluid (HCF) antigen. Antibodies in hybrid culture supernatant were detected by ELISA, and positive hybrids were cloned by technique of limiting dilutions. Numbers of chromosomes of five hybridoma cell lines (1D1, 1D8, 2D6, 4B10, 4F4) were demonstrated in the range of 99-108. The immunoglobulin class/subclass of McAb 4F4 was IgM and the others belonged to IgG1. IHA, ELISA and I-ELISA were used for identifying titer and specificity of five McAbs. The titers of two McAbs (1D1, 1D8) reached 1:10(6)-10(7) in IHA and ELISA. Two of these McAbs (1D1, 4F4) with other parasitic antigens revealed cross-reactions. This indicated that the McAbs 1D1 and 4F4 were against common antigen determiners of different parasitic antigens and the McAbs 1D8, 2D6, 4B10 against specific antigen determiners of HCF.     

棘球绦虫主要虫卵抗原蛋白分子特性的生物信息学分析

目的 采用生物信息学软件分析棘球绦虫主要虫卵抗原（MEAs）蛋白的分子特性。方法 从NCBI蛋白质数据库中下载棘球绦虫MEAs蛋白的氨基酸序列,采用ProtParam、NetSolP-1.0、SignalP-5.0、TMHMM 2.0、ProtComp 9.0、Structure、NetPhos 3.1、BCPREDS等在线分析程序预测理化性质、在大肠杆菌中的表达特性、信号肽、跨膜结构域、亚细胞定位、保守结构域、磷酸化位点及B细胞表位,并通过MEGA 6.06程序对不同物种来源的MEAs蛋白构建进化树。 结果 对11条棘球绦虫MEAs蛋白序列进行分析,序列长度为314~503 aa,等电点为5.73~7.26,分子量为35 843.76~ 54 356.24;在大肠杆菌中表达的可溶性为0.488 0~0.563 2,可用性为0.254 5~0.283 5;均具有典型的α晶体结构域,属于HSP20超家族;均含有丝氨酸磷酸化位点、苏氨酸磷酸化位点和酪氨酸磷酸化位点;均不存在信号肽序列及跨膜结构域,为非分泌、非跨膜蛋白;主要定位于胞质、胞核,在线粒体、胞外和质膜上也有分布;棘球绦虫MEAs蛋白优势B细胞抗原表位的数量为1~3。不同物种来源的MEAs蛋白分为两大枝,其中EmMEAp40_1、EgMEA_4、EgMEAp40_1 与微小膜壳绦虫MEAp40等聚为一枝,其余8条棘球绦虫MEAs蛋白与日本血吸虫MEAs等聚为一枝。结论 通过生物信息学软件筛选了棘球绦虫MEAs蛋白的优势B细胞抗原表位,为进一步研究棘球绦虫MEAs蛋白的生物学功能提供参考。     

细粒棘球绦虫66 kDa抗原的超微结构定位

目的：确定细粒棘球绦虫66kDa抗原在虫体组织超微结构中的精确定位。方法：本实验采用金标免疫组织化学方法，电镜观察66kDa抗原在细粒棘球绦虫原头蚴及成虫超薄切片中的定位。结果：该抗原定位于细粒棘球绦虫原头蚴及成虫虫体的体表、微毛内外、皮层、皮层合体细胞体(核周体)内和皮下肌纤维中。结论：该抗原可能由皮层合体细胞产生。     

细粒棘球绦虫原头蚴抗原对犬的免疫效果和抗原组份分析

分别用细粒棘球绦虫活原头蚴匀浆抗原和分泌抗原２ｍｌ，加完全佐剂和不完全佐剂，免疫犬２次，每次间隔２１天，可使犬获得不完全抗攻击感染的能力。匀浆抗原的免疫优于分泌抗原，感染率为２５％，与对照组９０％比有显著差异，并对体现人虫体的发育有明显抑制作用，孕卵率为０；分泌抗原的感染率、孕卵率与对照组相比差异不大，经抗原蛋白组份分析，原头匀浆抗原显示１４条蛋白组份，分别为２２．５、３１．０、３６．０、４０．０     

青海细粒棘球绦虫的种内变异研究

为了探讨青海细粒棘球线虫是否存在种内变异,本文对青海不同生活史循环结型的细粒棘球绦虫进行了研究。结果表明牦牛─藏犬型和藏羊─藏犬型虫体的病原生物学、形态学、超微结构、生物发育学、免疫原性及对化学药物的敏感性均存在明显差别。提示青海细粒棘球绦虫存在种内变异,形成了独特的牦牛株和藏羊株。     

新疆吉木乃县犬肠寄生虫调查及细粒棘球绦虫虫株探讨

1983年4月在新疆吉木乃县调查细粒棘球绦虫终宿主犬107只,共发现肠寄生虫10种。感染各种寄生虫的犬为79只,73.8％。感染细粒棘球绦虫(E. granulosus)的犬为29只,27.1％。并发现细粒棘球绦虫成虫的虫体节数、顶突钩的形态、成熟节片的位置、睾丸的分布、孕节与虫体前部之比等方面与文献记载有一定差异。提示吉木乃地区可能存在细粒棘球绦虫不同的株。在一犬肠内首次发现棘头虫(Oncicola sp.)感染。犬的其他肠寄生虫感染为水泡带绦虫(T. hydatigena)44只,41.1％、多头绦虫(M. multiceps)15只,14％、豆状带绦虫(T. pisiformis)6只,5.6％、猫泡尾带绦虫(H. taeniaeformis)1只,0.93％、犬复孔绦虫(D. caninum)1只,0.93％、线中殖孔绦虫(M.lineatus)1只,0.93％、狭头钩虫(U. stenocephala)1只,0.93％、犬弓蛔虫(T. canis)21只,19.6％。     

细粒棘球绦虫原头蚴生长发育机制研究进展

细粒棘球绦虫的棘球蚴寄生于中间宿主体内,可造成中间宿主肝、肺或其他器官发生以包囊为主的囊型棘球蚴病(又称囊型包虫病),对人体健康及畜牧业发展造成了严重影响.细粒棘球绦虫原头蚴的双向发育是形成棘球蚴的重要原因,也是研究的热点之一,但是原头蚴向不同方向发育的分子机制至今仍不清楚.近年来随着多组学技术的发展,对细粒棘球绦虫转...     

细粒棘球绦虫AgB8/1重组抗原表达系统的构建

目的 构建pET32a-AgB8/1原核表达载体,并对其重组蛋白进行原核细胞表达.方法 从细粒棘球绦虫原头蚴中提取总RNA,反转录生成cDNA,以此cDNA为模板用基因特异性引物扩增EgAgB8/1基因编码其分泌型多肽的片段,经测序后,以此基因片段为依据,人工合成合成EgAgB8/1抗原编码核酸序列,将其克隆至pUCm-T载体,测序鉴定其正确性.通过对pUCm-T/AgB8/1重组质粒进行双酶切,将获得的AgB8/1抗原编码核酸序列用定向克隆技术克隆至原核表达质粒pET32a上,测序鉴定插入片段正确性后,转化至E.coli BL21 (DE3)Lys S,IPTG初步诱导表达pET32a-AgB8/1重组蛋白.用SDS-PAGE电泳分析鉴定重组蛋白的表达水平.结果 测序表明,AgB8/1抗原编码核酸序列正方向插入至pET32a质粒.SDS-PAGE电泳分析显示,IPTG诱导后重组蛋白得到成功表达,在相对分子量约28 kDa处有表达条带.结论 本研究成功构建了pET32a-AgB8/1原核表达质粒,并初步诱导表达出AgB8/1重组蛋白,为进一步研究其免疫学特性奠定了基础.     

细粒棘球绦虫重组pCD-Eg95质粒构建及鉴定

目的:构建并鉴定细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)重组pCD-Eg95质粒.方法:从细粒棘球蚴包囊中分离原头节,超声粉碎后抽提总RNA,采用RT-PCR方法扩增Eg95编码基因,将该基因定向克隆到真核表达载体pCDNA3.1中构建pCD-Eg95重组质粒;电穿孔转化大肠杆菌BIA21(DE3)株,抽提质粒进行酶切及PCR鉴定.结果:电泳及测序证实471 bpEg95基因克隆成功.经酶切及PCR证实重组质粒pCD-Eg95成功转入BL21(DE3).结论:成功构建了Eg重组pCD-Eg95质粒.     

噬菌体7肽库中筛选细粒棘球蚴头节抗原的模拟表位的初步研究

目的：从噬菌体7肽库中寻找细粒棘球头节抗原的模拟表位。方法：以细粒棘球蚴头节抗原的单克隆抗体作靶分子筛选噬菌体7肽库，经过第3轮筛选后进行ELISA检测及竞争抑制试验后，挑取9株阳性克隆进行序列测定，序列比较后得到保守序列。结果：经过第3轮亲和筛选，阳性克隆得到富集。ELISA检测和竞争抑制试验证明，该小肽具有良好的免疫活性和特异性。结论：肽片段可能是细粒棘球蚴头节抗原的抗原表位，可作为包虫病疫苗的备选免疫原。     

细粒棘球绦虫烯醇酶(EgEnolase)基因的克隆和序列分析

目的 细粒棘球绦虫烯醇酶基因(EgEnolase)的克隆和所编码的蛋白质的结构、功能以及应用前景分析.方法 利用美国国家生物技术信息中心(NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的在线分析工具BLASTx和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(ExPaSy.http://ca.expasy.org/),以及CBS Prediction Servers提供的蛋白序列在线分析工具,结合Vector NTI suite生物信息学分析软件,从GenBank中细粒棘球绦虫的表达序列标签(EST)数据库中发现烯醇酶的5'端和3'端的EST序列,根据预测的编码区两端序列设计引物,从细粒棘球绦虫青海绵羊分离株中用多聚酶链式反应(PCR)方法扩增其基凶组序列,PCR产物克隆到T载体,测序并分析序列中的内含子,以内含子两侧序列的合并序列为引物.采用不对称PCR方法去除其中的内含子序列,预测编码蛋白的结构和功能特征,并分析其应用前景.结果 细粒棘球绦虫青海绵羊株烯醇酶基因的基因组序列长为1 449 bp,含有两个长度分别为78 bp和69 bp的小内含子.该基因编码433个氨基酸;预测其氨基酸序列中含有一段跨膜区(aa104-124),N端在膜外,C端在膜内,恰好分为两个不同的功能域,膜内区是执行酶催化功能的主体,Swiss-Model模建的3D结构显示,膜内区由α螺旋和β折叠相间排列形成桶样结构,底物结合位点、催化中心、Mg2+结合位点等关键位点在空间上紧密靠近,位于桶形结构的中心.该蛋白还有一个潜在的核定位序列aa190-199 .该蛋白含有多个T、B细胞表位,且膜外的aa49-57.和膜内的aa228-236兼性的T、B细胞表位,线性B细胞表位aa206-213中包含了催化位点Glu210.结论 细粒棘球绦虫烯醇酶可能是一个位于虫体皮层表膜具有较好的免疫诊断和疫苗应用前景的膜蛋白,同时还可能进入细胞核调节基因表达.     

新疆不同地区犬细粒棘球绦虫形态学特征进一步观察

作者对新疆北疆北部吉木乃县、沿天山一带和位于准噶尔盆地西北缘农场犬自然感染细粒棘球绦虫成虫的顶突钩和链体各部分进行了形态学观察,证实吉木乃县与盆地西北缘农场犬细粒棘球绦虫在节片长度及成熟节片和孕节内形态结构上显著不同。认为它们是两个不同的虫株。     

细粒棘球绦虫囊液McAb的制备及鉴定

作者用人源包虫囊液抗原免疫的BALB/c小鼠脾细胞与SP 2/0骨髓瘤细胞杂交,获得成功。融合率100％,抗体阳性率10.7％。经克隆化培养获得分泌抗人源细粒棘球绦虫抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞5株,其染色体数为99～108。经鉴定其中3株(1D_3、2D_6、4B_(10))是特异针对细粒棘球绦虫抗原决定簇的,均属IgG_1亚类;另外2株(4F_4、1D_1)则针对细粒棘球绦虫与其他几种寄生虫抗原的共同决定簇,它们分属IgM和IgG_1类免疫球蛋白。     

用核酸原位杂交技术观察细粒棘球绦虫66kDa抗原mRNA在虫体上的细胞定位

目的：用核酸原位杂交技术观察细粒棘球绦虫66kDa抗原mRNA在虫体上的细胞定位以及在虫体发育的不同时期mRNA含量的变化。方法：以66kDa抗原的cDNA克隆EgA31为模板制备RNA探针，与细粒棘球绦虫原头蚴、育囊和成虫虫体进行原位杂交实验。结果：原位杂交实验显示EgA31 mRNA主要位于原头蚴和成虫的皮层下某种细胞中，并在棘球蚴育囊的生发层中也存在这种细胞。在原头蚴向成虫的发育过程中虫体吸盘处细胞内EgA31 mRNA含量显著增加。结论：含EgA31 mRNA的细胞很可能是皮层细胞；EgA31蛋白可能参与吸盘上肌纤维的收缩作用并与虫体的免疫逃避功能有关。     

细粒棘球绦虫原头蚴抗原对犬的免疫效果和抗原组份分析

分别用细粒棘球绦虫活原头蚴勾浆抗原和分泌抗原2ml(蛋白含量2mg/ml),加完全佐剂和不完全佐剂,免疫犬2次,每次间隔21d,可使犬获得不完全抗攻击感染的能力.匀浆抗原的免疫效果优于分泌抗原,感染率为25%,与对照组90%比有显著差异,并对体内虫体的发育有明显抑制作用,孕卵率为0;分泌抗原组的感染率、孕卵率与对照组相比差异不大.经抗原蛋白组份分析,原头蚴匀浆抗原显示14条蛋白组份,分别为22.5、31.0、36.0、40.0、42.1、46.5、5l.0、57.6、66.2、74.4、83.1 KD,94.0 KD以上有3条蛋白组份.其中83.1KD和 94.0 KD以上3条蛋白组份可被免疫犬和对照阳性犬血清识别.     

细粒棘球绦虫Innexin-unc9基因在不同发育阶段的表达分析

目的 探究胆汁酸盐(胆盐)对细粒棘球绦虫(E.granulosus,E.g)发育分化的影响,分析E.gInnexin-unc9 (EgInx)基因在体外有无胆盐-牛磺胆酸钠(Sodium taurocholate)培养的原头蚴(PSC)的表达水平,为研发犬抗E.g疫苗奠定基础。方法 采用含与不含T4009(牛磺胆酸钠的商品型号缩写)的单相培养基分别进行PSC培养,在不同培养时间点对比分析PSC外翻率和发育状态;利用反转录荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western Blotting检测不同培养点样本的EgInx相对表达量。结果 不同时间点平行培养的原头蚴外翻情况不同,在培养30 min时和10 d以后,无T4009组的PSC外翻率急剧下降;RT-qPCR结果显示：与从体内刚采集的PSC相比,其EgInx的表达量在培养30 min的T4009组较高,且此时T4009组表达量高于平行无T4009组,且差异具有统计学意义(P<0.05),培养到17 d时,得到类似的结果;Western Blotting和RT-qPCR结果一致。结论 提示在有牛磺胆酸钠的环境中,E.gInnexin...     

改进的细粒棘球蚴生发细胞分离培养方法与鉴定

目的 探讨细粒棘球蚴生发细胞原代培养的改进方法.方法 剪碎自然感染的绵羊棘球蚴包囊组织,用胶原酶与胰蛋白酶等比混合液消化解离,对获得的细胞以显微镜、电镜以及免疫荧光试验方法进行形态学研究及鉴定.结果 分离出足量细胞进行体外培养且细胞具有生发细胞样形态和免疫特征.结论 改良的胶原酶消化法是一种简单有效的生发细胞分离培养方法.     

细粒棘球绦虫腺苷酸活化蛋白激酶AMPKα生物信息学分析

目的 运用生物信息学方法分析细粒棘球绦虫腺苷酸活化蛋白激酶α(AMP-activated protein kinaseαof Echinococcus granulosus,EgAMPKα)基因序列的结构与功能.方法 通过NCBI蛋白数据库获取EgAMPKα基因序列,利用ProtParam、ProtScale、Sign...