抗人CD38分子单克隆抗体生物学功能研究

目的 研究抗人CD38单克隆抗体(1C6)的生物学功能.观察1C6对多种肿瘤细胞系生长增殖的影响,利用不同刺激原诱导的淋巴细胞增殖反应,观察抗人CD38单克隆抗体(1C6)在人外周血淋巴细胞增殖反应中的作用.方法 以MTT法检测单克隆抗体抑制细胞增殖以及介导补体杀伤靶细胞的功能.利用抗人CD3单克隆抗体刺激人外周血淋巴细胞增殖、同种异型抗原诱导混合淋巴细胞反应,在加入或未加入抗人CD38单克隆抗体(1C6)的情况下,观察细胞形态并检测3H-TdR掺入量.结果 加入不同浓度的1C6的实验组与对照组相比,多种细胞系的生长受到不同程度的抑制.不同刺激原诱导的淋巴细胞增殖反应中,加入1C6的实验组细胞克隆明显减少,3H-TdR掺入量明显下降,细胞增殖受抑.结论 1C6可抑制多种肿瘤细胞的生长,可介导补体杀伤多种靶细胞.1C6对抗CD3刺激的外周血淋巴细胞增殖以及混合淋巴细胞培养均具有明显的抑制效应.     

人CD38抗原胞外段基因克隆及表达

目的 克隆并表达人CD38抗原分子的胞外估基因。方法 采用RT－PCR法，从高表达CD38抗原的Daudi细胞系中，扩增CD38全长cDNA，并将其插入pGEM-T载体中。重新设计引物，从重组pGEMT载体中，扩增CD38抗体分子的胞外段基因，再亚克隆到表达载体pET28a( )，转化大肠杆菌BL21，用IPTG诱导表达。结果 经酶切鉴定及序列分析表明，克隆的CD38外段基因的序列与文献^[1,2]的报道完全一致。将该片段亚克隆到表达载体pET28a( ) ,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21中获得表达。结论 获得了人CD38抗原分子胞外段基因及其原核表达产物，对进一步制备单克隆抗体，研究CD38分子的功能具有重要的意义。     

利用基因重组抗原研制人CD20单克隆抗体及其功能的研究

目的　利用基因重组抗原免疫小鼠 ,制备人CD2 0单克隆抗体 ,研究其特异性和功能。方法　用表达重组人CD2 0基因的细胞NIH 3T3免疫BALB c小鼠 ,取其脾细胞与Sp2 0细胞融合 ,以间接免疫荧光法筛选杂交瘤上清。免疫沉淀法及流式细胞术鉴定其识别抗原的相对分子质量 (Mr)和特异性 ;以MTT法、流式细胞术及形态学方法检测诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖的功能。结果　利用杂交瘤技术获得了 1株抗人CD2 0的单克隆抗体 1 2 8,它具有CD2 0抗体特异的细胞反应谱 ,其识别的抗原Mr 为 33× 10 3 。MTT实验证实 1 2 8能显著抑制Daudi和Raji细胞生长。结论　利用基因重组抗原制备了 1株能够稳定分泌抗人CD2 0的单克隆抗体的杂交瘤细胞株 1 2 8,此单抗具有抑制CD2 0阳性细胞增殖和诱导其凋亡的功能。     

抗人CD38单克隆抗体抗原识别表位的初步研究

目的:确定抗人CD38分子单克隆抗体(mAb)1C6识别的抗原表位所在区域。方法:分别构建缺失人CD38不同表位的重组质粒,用IPTG诱导表达融合蛋白。对表达产物进行SDS-PAGE蛋白电泳及Westernblot分析。结果:1C6不能识别缺失第220～241位氨基酸的D4片段,而对其他的缺失突变体均可识别。结论:mAb1C6抗体识别的抗原表位位于CD38分子胞外段第220～241位氨基酸。     

抗人喉癌/抗CD3双功能抗体的制备及对Hep-2细胞株的杀伤作用

目的：研究制备抗人喉癌／抗CD3双功能抗体，探讨喉癌主动免疫治疗。方法：以化学方法将人喉癌及抗CD3单克隆抗体交联为双功能抗体，进行介导对肿瘤细胞的杀伤作用。结果：该双功能抗体介导效应细胞对靶细胞的杀伤率高于抗CD3的介导作用，并随着效靶比的提高而升高。结论：采用化学交联法制备的抗人喉癌／CD3双功能抗体具有潜在的临床应用价值。     

抗CD3/抗CD20双特异双链抗体的生物学活性研究

目的研究抗CD3/抗CD20双特异双链抗体的生物学活性.方法采用亲和层析法纯化本室构建的抗CD3/抗CD20双特异双链抗体可溶性表达产物,并用SDS-PAGE,Westernblot和分子排阻层析鉴定纯化产物;采用FACS法和玫瑰花环试验测定纯化产物与靶细胞的结合活性;采用3H-TdR掺入实验和51Cr释放试验测定该双特异双链抗体的生物学性质.结果纯化的抗CD3/抗CD20双特异双链抗体具有与Jurkat(CD3+)和Daudi细胞(CD20+)的结合活性,且能同时与Jurkat和Daudi细胞结合形成玫瑰花环,并能竞争性封闭亲代鼠源性抗体HIT3a和HI47与Jurkat和Daudi细胞的结合位点;该双特异双链抗体具有促有丝分裂原作用和介导激活的T细胞杀伤Daudi细胞的活性.结论抗CD3/抗CD20双特异双链抗体具有与亲代鼠源性抗体HIT3a和HI47相同的性质,且能介导激活的T细胞杀伤表达CD20抗原的肿瘤细胞,是一个有望用于B细胞恶性肿瘤临床治疗的双特异性抗体.     

CD3／抗CD20双特异双链抗体生物学活性研究

目的 研究抗CD3/抗CD20双特异双链抗体的生物学活性。方法 采用亲和层析法纯化本室构建的抗CD3/抗CD20双特异双链抗体可溶性表达产物,并用SDS-PAGE,Western blot和分子排阻层析鉴定纯化产物;采用FACS法和玫瑰花环试验测定纯化产物与靶细胞的结合活性;采用^3H-TdR掺入实验和^51Cr释放试验测定该双特异双链抗体的生物学性质。结果 纯化的抗CD3/抗CD20双特异双链抗体具有与Jurkat(CD3^ )和Daudi细胞（CD20^ )的结合活性,且能同时与Jurkat和Daudi细胞结合形成玫瑰花环,并能竞争性封闭亲代鼠源性抗体HIT3a和HI47与Jurkat和Daudi细胞的结合位点;该双特异双链抗体具有促进丝分裂原作用和介导激活的T细胞杀伤Daudi细胞的自学成才性。结论 抗CD3/抗CD20双特异双链抗体具有与亲代鼠源性抗体HIT3a和H147相同的性质。且能介导激活的T细胞杀伤表达CD20抗原的肿瘤细胞,是一个有望用于B细胞恶性肿瘤临床治疗的双特异性抗体。     

抗人CD80单链抗体的构建、表达及与抗原结合的特性分析

目的:构建及表达抗人CD80单链抗体(ScFv),并初步研究其生物学功能。方法:采用RT-PCR法从分泌鼠抗人CD80mAb的杂交瘤细胞株(4E5)中克隆VH和VL基因。用重叠延伸拼接PCR方法构建具有前导肽的L-VH-Linker-VL单链抗体基因,并亚克隆至pIRES2-EGFP表达载体,脂质体法转染中华仓鼠卵巢细胞(CHO),G418加压筛选。纯化抗CD80-ScFv,并分析其对膜型CD80的识别。竞争抑制实验分析抗CD80-ScFv与相应抗原的结合能力。MTT法体外分析抗CD80-ScFv对CD80介导的共刺激信号的阻断作用。结果:构建的抗CD80-ScFv基因全长为828 bp,经测序含有信号肽和连接肽。实验获得稳定表达细胞株SA-Ⅱ,其培养上清与L929-CD80细胞的阳性结合率达98%以上。抗体纯化后产率约为15.12 mg/L,其能够识别Raji和Daudi细胞天然表达的CD80分子,结合率分别为96.6%和95.0%。抗CD80-ScFv对鼠源亲本抗体4E5与抗原结合的竞争抑制率达98.67%,并能阻断CD80介导的共刺激信号转导,抑制PBMC的增殖,增殖率下降43.48%。结论:成功建立了抗CD80-ScFv CHO细胞的表达株(命名为SA-Ⅱ),该抗体能够特异识别细胞表面膜型CD80分子并介导相应的生物学功能。     

抗Pgp/抗CD3双特异双链抗体的生物学活性研究

目的　研究抗Pgp 抗CD3双特异双链抗体介导的特异性靶向杀伤活性。方法　采用亲和层析法分离纯化本室构建的抗Pgp 抗CD3双特异双链抗体可溶性表达产物 ,并用SDS PAGE、Westernblot及抗活细胞间接免疫荧光法鉴定纯化产物 ;采用51 Cr释放试验测定其介导的体外靶向杀伤活性。结果　纯化的抗Pgp 抗CD3双特异双链抗体具有与Jurkat细胞 (CD3 )和K5 6 2 A0 2 (Pgp )细胞结合的活性 ;抗Pgp 抗CD3双特异双链抗体具有介导激活的T淋巴细胞杀伤Pgp表达阳性的耐药肿瘤细胞的作用 ,杀伤作用的强弱显示出效靶比和剂量依赖关系 ,且可被CD3ScFv或PgpScFv特异性的阻断。结论　抗Pgp 抗CD3微型双功能抗体有望成为治疗耐药肿瘤 ,特别是肿瘤残留灶和微小转移灶的治疗的一种新策略。     

BsAb HER-2×CD3对过度表达HER-2乳腺癌细胞的细胞毒作用

目的 :研究应用抗HER 2抗原和CD3抗原的双向基因工程抗体BsAbHER 2×CD3介导T淋巴细胞对过度表达HER 2乳腺癌细胞的细胞毒作用。方法 :以过度表达HER 2的乳腺癌细胞株SK BR 3为靶细胞 ,T淋巴细胞为效应细胞 ,采用MTT法、3 H TdR掺入法测定BsAbHER 2×CD3对靶细胞、效应细胞的抑制作用及其介导的效应细胞对靶细胞的杀伤作用。结果 :BsAbHER 2×CD3具有MAbHER 2和MAbCD3的双重特性 ,既能抑制SK BR 3细胞生长 ,又可促进正常人外周血T淋巴细胞增殖。BsAbHER 2×CD3介导T淋巴细胞对靶细胞产生显著的细胞毒作用 ,明显强于MAbHER 2对靶细胞的作用 ,E∶T =2 0∶1为最佳效靶比。结论 :BsAbHER 2×CD3 ,既可以与HER 2过度表达的肿瘤细胞特异性结合 ,又可以介导T淋巴细胞对肿瘤细胞产生特异性杀伤作用 ,具有明显的抗肿瘤作用     

一株识别CD83单克隆抗体的研制及其生物学特性鉴定

目的:鼠抗人CD83功能性单克隆抗体(mAb)的研制及其生物学特性的鉴定.方法:以人CD83转基因细胞L929/CD83为免疫原,常规免疫6～8周龄的雌性BALB/c小鼠;采用B淋巴细胞融合技术,将免疫小鼠脾脏细胞与Sp2/0融合,以L929/CD83、293/CD83转基因细胞为抗体筛选阳性细胞,经免疫荧光标记分析对杂交瘤进行反复筛选和多次的克隆化培养;采用Ig类和亚类快速定性试纸法、染色体核型分析、竞争结合抑制试验、间接免疫荧光法、Western blot对mAb的生物学特性进行鉴定.结果:获得1株稳定分泌鼠抗人CD83mAb的杂交瘤细胞株(命名为9D8),该mAb能特异性地识别成熟的DC、活化的T细胞及肿瘤细胞株Daudi、8226表达的CD83分子,该mAb识别的位点不同于商品化抗人CD83mAb(HB15e).结论:成功地研制1株鼠抗人CD83mAb,识别位点与HB15e不同,为更好地研究该分子的功能提供良好的物质基础.     

抗人CD20单克隆抗体诱导Daudi细胞凋亡的功能研究

目的　观察由基因重组抗原制备的抗人CD2 0单克隆抗体 (CD2 0 McAb) 1- 2 8对B淋巴瘤细胞的促凋亡作用 ,并探讨其作用机理。方法　利用流式细胞术测定所获 1- 2 8单抗对标准CD2 0 FITC单抗的竞争抑制作用及对胞内游离钙的影响 ;通过电镜观察其诱导Daudi细胞凋亡后形态上的改变 ,免疫印迹实验显示Daudi细胞凋亡后功能上的变化。结果　 1- 2 8能明显竞争标准CD2 0 FITC单抗与Daudi细胞表面CD2 0分子的结合。电镜结果证实了 1- 2 8能够促进Daudi细胞发生凋亡的结论 ;实验结果显示Daudi细胞与 1- 2 8作用后胞内游离钙浓度明显升高 (P <0 .0 5 ) ,细胞内Bcl 2蛋白和caspase酶原的表达量下降 ,而Bax蛋白和caspase酶原降解的活性产物表达增加。结论　 1- 2 8能竞争结合Daudi细胞表面的CD2 0分子并诱导其发生凋亡     

两株鼠抗人GL50单克隆抗体的制备及其生物学特性的初步研究

目的　研制鼠抗人GL5 0分子单克隆抗体并对其生物学特性进行初步研究。方法　以天然高表达人GL5 0分子的Daudi细胞为免疫原 ,人GL5 0 L92 9转基因细胞为目的单克隆抗体(McAb)的筛选细胞 ,采用B淋巴细胞杂交瘤技术 ,获得分泌特异性鼠抗人GL5 0分子McAb的杂交瘤细胞株 ;免疫荧光标记和流式细胞术分析McAb识别GL5 0的表达 ;Westernblot检测抗体对特异性细胞膜蛋白的识别 ;台盼蓝 (Trypanblue)染色细胞计数法和MTT法检测McAb对Daudi细胞体外生长的抑制作用 ;3 H TdR法检测抗体对GL5 0 L转基因细胞介导的活化T细胞体外增殖的效应。结果　成功制备 2株分泌特异性抗人GL5 0抗体的杂交瘤细胞株 12B11和 11C4 ;两者皆为IgG2a亚型 ;腹水效价皆在 1∶10 0 0以上 ;12B11、11C4特异性地识别GL5 0分子。 11C4McAb可以明显抑制Daudi细胞在体外的生长 ,并可抑制GL5 0 L转基因细胞介导的活化T淋巴细胞的体外增殖效应。结论　成功获得了 2株特异性鼠抗人GL5 0抗体 ,其中 11C4McAb具有诱导表达GL5 0分子的B淋巴瘤细胞Daudi的体外生长抑制作用 ;在T淋巴细胞体外增殖反应中发挥了重要的调节作用。     

一株识别CD40分子新位点的单克隆抗体研制及生物学特性鉴定

目的：研制识别CD40分子新位点的单克隆抗体（mAb）。方法：以转人CD40转基因细胞L929-CD40为免疫原，常规免疫6—8周龄的雌性BALB／c小鼠；采用B淋巴细胞融合技术，将免疫小鼠脾脏细胞与Sp2／0融合，以L929-CD40转基因细胞为抗体筛选阳性细胞，经免疫荧光标记分析对杂交瘤进行反复筛选和多次的克隆化培养；采用快速定性试纸法及竞争抑制结合试验分析了该mAb的亚类及抗原识别位点；采用MTT法分析mAb在体外对肿瘤细胞的促增殖效应、ELISA法测定细胞因子分泌以及PI染色分析细胞周期。结果：获得1株持续、稳定分泌鼠抗人CIM0mAb的杂交瘤细胞株（命名为286），该mAb能特异性地识别人CD40分子并较好的识别肿瘤细胞株H08910表达的CD40分子并能够体外促进肿瘤细胞增殖。结论：成功地研制1株识别CD40新位点mAb，该mAb能够很好地识别肿瘤细胞表达的CD40分子并具有体外促进肿瘤细胞生长的作用。     

一株识别肿瘤细胞上CD40突变体分子的单克隆抗体的研制及其生物学功能研究

目的:以本科室发现肿瘤细胞上表达的CD40 787AA突变为基础,研制识别肿瘤细胞上CD40突变体分子的单克隆抗体(mAb),并对其生物学特性作初步分析.方法:以转人CD40突变体转基因细胞L929-CD40mu为免疫原,免疫6～8周龄的雌性BALB/c小鼠;采用B淋巴细胞融合技术,将免疫小鼠脾脏细胞与Sp2/0融合,以L929-CD40mu转基因细胞为抗体筛选阳性细胞,免疫荧光标记法对杂交瘤进行反复筛选和多次的克隆化培养;采用快速定性试纸法及竞争抑制结合试验分析该mAb的亚类及抗原识别位点;免疫印迹法对该mAb进行鉴定;采用MTT法分析mAb在体外对肿瘤细胞的抑制增殖效应以及PI-annexin V方法进行细胞凋亡测定.结果:获得1株稳定分泌鼠抗人CD40mu mAb的杂交瘤细胞株(命名为10C5),该mAb能特异性地识别人肿瘤细胞株H08910表达的CD40突变体分子,而不识别正常扁桃体B淋巴细胞及血管内皮细胞表达的CD40分子,并且能够在体外促进肿瘤细胞凋亡.结论:成功地研制出1株特异性识别肿瘤细胞上CD40突变体分子的mAb,该mAb具有体外抑制肿瘤细胞生长并促进其凋亡的作用.     

人CD112(Nectin2/PRR2)单克隆抗体的制备和鉴定

目的：表达和纯化CD112 胞膜外区重组蛋白, 制备针对CD112胞膜外区的单克隆抗体（mAb）, 并且研究CD112的分布.方法：采用基因重组技术在真核系统表达CD112-Fc融合蛋白, 亲和层析法进行蛋白纯化;纯化的CD112-Fc融合蛋白免疫BALB/c小鼠, 杂交瘤技术建立分泌CD112 mAb的杂交瘤细胞株, 间接ELISA、 Western blot及FCM鉴定mAb 的特异性.用流式细胞术（FCM）检测 CD112 的细胞系分布.结果：构建了高效真核表达载体pIg3C-CD112, 表达并纯化了CD112-Fc融合蛋白, 其纯度大于 90%.以纯化重组蛋白为免疫原共制备9株分泌抗CD112 mAb的杂交瘤细胞株（命名为FMU-CD112.1 ～FMU-CD112.9）, 制备腹水并纯化 mAb.FMU-CD112.1、 3、 6和8能用于Western blot, FMU-CD112.1、 4、 6和8可用于 FCM.CD112细胞分布检测显示该分子主要分布在正常上皮及内皮细胞系、巨核细胞谱系和部分T细胞系, 并高表达于上皮及内皮来源的肿瘤、胶质瘤等细胞系.结论：成功地表达纯化了CD112-Fc融合蛋白并建立了稳定分泌CD112 mAb的杂交瘤细胞株, 为CD112的功能研究打下坚实的基础.     

两株抗人CD40配体单克隆抗体的制备及生物学特性的研究

目的 :研制功能性抗CD4 0L单克隆抗体 ,探讨其生物学特性及其运用价值。方法 :采用B淋巴细胞融合、免疫荧光、免疫印迹和竞争抑制等方法获得鼠抗人CD4 0LmAb ,通过Daudi细胞生长抑制试验、混合淋巴细胞反应观察抗CD4 0LmAb的生物学功能。结果 :经表型分析、Westernblot和竞争抑制试验 ,证实mAbB1、mAb4F1是识别人CD4 0L分子的特异性单抗 ,且识别的位点不同 ;mAbB1、mAb4F1均能不同程度地拮抗CD4 0L TC介导的Daudi细胞生长抑制和抑制混合淋巴细胞反应。结论 :成功地获得两株能稳定分泌特异性抗人CD4 0L单克隆抗体的杂交瘤 (1B1、4F1) ,这两株单抗对CD4 0L的生物学功能具有明显的阻断作用 ,为阻断型单抗     

人肝再生增强因子单克隆抗体的制备:以非纯化的大肠杆菌表达抗原筛选杂交瘤

目的 :利用杂交瘤技术、以非纯化的大肠杆菌表达重组蛋白作为筛选抗原 ,制备小鼠抗人肝再生增强因子(hALR)的单克隆抗体。方法 :用实验室纯化的重组hALR 硫氧环蛋白融合蛋白免疫BALB c小鼠 ;小鼠脾细胞与SP2 0骨髓瘤细胞融合后经HAT选择培养基筛选杂交瘤 ;以重组质粒pQE30 hALR与空质粒pQE30在大肠杆菌中诱导表达后的细菌裂解产物作为筛选抗原和对照抗原 ,用ELISA方法筛选能分泌抗hALR单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞克隆 ;进一步以ELISA方法和免疫印迹方法检测该杂交瘤细胞产生的抗体对真核细胞表达的重组hALR及人体血清中天然hALR的反应性。结果 :成功筛选出一株能稳定分泌抗hALR单克隆抗体的杂交瘤细胞 ;其产生的抗体能对真核细胞表达的重组hALR及人体血清中天然的hALR发生特异的抗原抗体反应。结论 :大肠杆菌表达的重组蛋白在以空质粒表达产物作为对照下 ,不经过任何纯化步骤也能够用于单克隆抗体制备中的杂交瘤筛选 ;hALR单克隆抗体为深入研究hALR提供了研究手段。