靶向人ERG基因的siRNA重组慢病毒表达载体的构建

目的构建靶向人ERG基因的siRNA重组慢病毒表达载体。方法针对人ERG基因的mRAN序列,设计特异性干扰序列,两端引入酶切位点,人工合成OligoDNA,退火后与双酶切的pLVX-shRNA2慢病毒载体质粒连接,构建慢病毒载体质粒pLVX-shRNA2-ERGsiRNA,通过测序鉴定连接正确后,以293T细胞包装得到荷载ERGsiRNA基因的慢病毒;根据293T细胞表达绿色荧光蛋白水平计算病毒滴度;病毒感染前列腺癌VCaP细胞株,通过实时荧光定量PCR检测ERGmRNA的表达。结果测序结果表明,靶向人ERG基因的siRNA慢病毒表达载体构建成功,包装后的慢病毒滴度为1.1×108TU/ml。感染VCaP细胞后,实验组和对照组相比ERGmRNA的表达水平显著降低,siRNA对ERG表达的干扰效率为87.46%。结论成功构建靶向人ERG基因的siRNA慢病毒表达载体。     

siRNA介导的Bcl-2表达下调对肝癌细胞Hep3B的影响及对氨甲蝶呤化疗敏感性的影响

目的构建靶向Bcl-2基因的siRNA表达质粒,观察其对肝癌细胞Hep3B的影响及对氨甲蝶呤(MTX)化疗敏感性的影响。方法根据siRNA设计原则,设计并合成Bcl-2的siRNA序列,克隆到pRNAT-U6.1/Neo质粒U6启动子下游构建重组质粒;经序列分析确认质粒构建成功后,将重组质粒转染入人肝癌细胞Hep3B,通过RT-PCR、Western blot分析Bcl-2的表达,细胞生长实验分析其对肝癌细胞生长的影响及对MTX化疗敏感性的影响。结果重组质粒pRNAT-U6.1/Neo-Bcl-2经过基因序列分析,siRNA片段成功插入,转染此质粒可使Bcl-2的翻译和蛋白表达水平一定程度的降低,并且可抑制Hep3B细胞的生长,增加其对MTX化疗的敏感性。结论成功构建并筛选出靶向Bcl-2基因的siRNA表达载体,它能抑制肝癌细胞Hep3B的生长及增加其对MTX化疗的敏感性,为基因治疗肝癌提供了新策略和实验基础。     

siRNA XIAP表达载体的构建及其生物学作用

目的构建靶XIAP的siRNA表达载体,研究其对Hep3B细胞中XIAP表达的影响。方法根据siRNA设计原则,设计并合成三段XIAP的siRNA序列,克隆到pRNAT—U6．1／Neo质粒构建重组质粒;经序列分析确认质粒构建成功后,将重组质粒转染入人肝癌细胞Hep3B,通过RT．PCR、Westernblot和免疫组化分析X!AP的表达。结果重组质粒pRNAT—u6．1／Neo．XIAP经过基因序列分析,siRNA片段成功插入,转染不同siRNAXIAP质粒均可使XIAP的翻译和蛋白表达水平不同程度的降低。结论成功构建并筛选出靶向XIAP基因的siRNA表达载体,为进一步研究XIAP在调控肝癌细胞凋亡方面的作用奠定了基础。     

潜伏活性的人可溶性TNFⅠ型受体融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的:采用基因工程技术,将转化生长因子β前体相关蛋白(LAP)通过基质金属蛋白酶(MMP)水解部位与人可溶性TNFⅠ型受体(hsTNFRⅠ)连接,构建pcDNA3.1/LAP-MMP-hsTNFRⅠ融合蛋白真核表达载体,获得LAP-MMP-hsTNFRⅠ融合蛋白。方法:将编码MMP水解部位氨基酸的正反义DNA序列退火形成互补双链后定向克隆插入真核表达载体pcDNA3.1( ),得到pcDNA3.1/MMP重组体;将TGF-β1的LAP段和hsTNFRⅠ与MMP水解部位连接,获得pcDNA3.1/LAP-MMP-hsTNFRⅠ真核表达载体。测序鉴定后,脂质体介导重组质粒转染COS-7细胞,通过RT-PCR检测融合基因的表达。结果:酶切及测序结果证实pcDNA3.1/LAP-MMP-hsTNFRⅠ重组载体构建成功,转染后RT-PCR结果表明重组质粒在COS-7细胞中得到有效表达。结论:成功构建了融合蛋白真核表达载体pcDNA3.1/LAP-MMP-hsTNFRⅠ,并获得融合基因的瞬时表达,为进一步研究融合蛋白在子宫内膜异位症中的靶向治疗奠定了实验基础。     

Pgenesil-1质粒载体介导的表达ERCClshRNA的质粒构建和鉴定

目的:设计构建Pgenesil－1质粒载体介导的表达ERCClshRNA的重组体质粒.方法:以ERCC1为靶基因,以Pgenesil－1质粒为载体,设计构建重组体,根据ERCCl基因cDNA序列,设计有小发卡结构的2条寡核苷酸序列,克隆到空载体Pgenesil－1中,转化DH5a菌株,提取质粒,进行酶切鉴定和测序分析.结果:经酶切鉴定筛出的重组体测序结果和目的序列相同,重组体载体构建成功.结论:成功构建了能表达ERCClshRNA的质粒载体Pgenesil－1/ERCC11和Pgenesil－1/ERCC12,为下一步研究ERCC1基因在卵巢癌细胞株顺铂耐药中的作用奠定了实验基础.     

构建siRNA慢病毒载体抑制A549细胞株VEGF受体KDR基因的表达

目的构建针对血管内皮生长因子(VEGF)受体KDR基因的siRNA慢病毒载体,鉴定其对肺癌细胞株A549基因干扰效果。方法设计合成针对KDR编码区的三条siRNA序列及阴性对照序列,克隆到PGCL-GFP载体,构建重组质粒,行PCR鉴定、DNA测序分析;转染人肺癌细胞株A549,Real-Time PCR及Western blot分别检测KDR mRNA、蛋白水平变化;细胞计数法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期。结果成功构建pGCL/KDR-siRNA重组质粒。A549干扰组KDR mRNA表达率下降,KDR蛋白表达量明显减少,细胞周期改变。结论构建的pGCL/KDR-siRNA表达载体可在mRNA和蛋白水平上有效抑制A549细胞株KDR基因的表达。     

MAGE-A4重组蛋白的原核表达与纯化

目的 构建MAGE-A4的原核表达质粒并表达纯化相应蛋白,为恶性肿瘤的早期诊断和基因治疗疫苗的研制奠定基础.方法 根据目的基因序列合成目的基因并与原核表达载体连接,以构建原核表达质粒pET30a(+)/MAGE-A4,将酶切鉴定及测序正确的重组质粒转入E.coli BL21,经IPTG诱导表达并行可溶性分析,Western Blot鉴定重组蛋白特异性后,通过亲和层析法纯化重组蛋白.结果 成功构建pET30a (+)/MAGE-A4原核表达质粒,诱导表达得到重组蛋白MAGE-A4,主要以可溶性形式表达,纯化后获得纯度较高的蛋白.结论 成功构建pET30a(+)/MAGE-A4原核表达质粒并表达纯化出具有生物学活性的重组蛋白MAGE-A4.     

大鼠生精相关基因TSARG1原核表达载体的构建和表达

目的构建大鼠生精相关基因pGEX-KG/TSARG1重组载体并进行原核表达。方法应用RT-PCR技术从大鼠睾丸组织mRNA中扩增TSARG1的开放阅读框（ORF）,T-A克隆后将TSARG1插入到原核表达载体pGEX-KG中,经测序鉴定后将重组质粒转入宿主菌E.coliBL21,IPTG诱导表达GST/TSARG1融合蛋白。结果成功构建pGEX-KG/TSARG1重组质粒;转化重组质粒的E.coli BL21经IPTG 37℃诱导高效表达GST/TSARG1融合蛋白。结论 pGEX-KG/TSARG1原核表达载体的成功构建为进一步研究TSARG1的生物学功能奠定了基础。     

PCR点突变改造人透明带蛋白3酵母表达载体

目的:构建人透明带蛋白3的186位氨基酸突变体重组质粒并鉴定。方法:通过PCR点突变改造人透明带蛋白3的Kex2位点,构建pPICZα-hZP3186S突变载体。结果:经DNA测序表明,ZP3基因的556～558bp处碱基由AGG突变为TCC,读码框正确。结论:成功构建了pPICZα-hZP3186S突变载体(186位精氨酸突变为丝氨酸),为重组人ZP3蛋白在毕赤酵母能够分泌性表达奠定基础。     

siRNA靶向抑制铜绿假单胞菌oprM基因表达

目的探讨siRNA能否抑制铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)主动外排系统oprM基因的表达。方法针对oprM基因序列设计合成3对siRNA片段,分别转化耐药PA,采用抗菌素药物敏感试验筛选出能抑制PA耐药的siRNA片段及其最佳转化剂量,再构建siRNA质粒表达载体,转化PA标准菌株,应用western blot技术检测OprM蛋白表达量的变化。结果筛选出一对能抑制PA耐药的siRNA片段,确定其最佳转化剂量为25μL(20μm/L)/100μL PA菌液。成功构建了靶向oprM基因的siRNA质粒表达载体。Western Blot检测结果显示,转化siRNA质粒载体的PA其OprM蛋白的表达量明显降低。结论靶向oprM基因的siRNA能够抑制PA oprM基因的表达。     

胃肿瘤组织中缺失型Midkine基因的克隆和表达

目的对人胃肿瘤组织中缺失型Midkine(tMK)基因进行克隆并在大肠杆菌中表达。方法根据Genbank报道的序列,设计一对引物,通过RTPCR从胃肿瘤患者肿瘤组织中获得了tMK成熟肽DNA编码序列,与pMD18Tvector连接测序后,将该片段克隆入大肠杆菌高效表达载体pBV222中,转化大肠杆菌DH5α,在42℃进行诱导表达。结果在胃肿瘤组织中克隆到tMK表达基因,并获得高效表达tMK重组蛋白的工程菌株DH5αpBV222tMK。SDSPAGE结果表明,pBV222tMK表达的重组蛋白与预计分子量一致。结论在中国胃肿瘤患者的肿瘤组织中也有tMK的表达,经克隆重组实现了在大肠杆菌中的高效表达。     

结核分枝杆菌吡嗪酰胺酶-GST融合蛋白表达载体构建及在大肠杆菌中的表达

目的构建结核分枝杆菌pncA基因的原核表达质粒,获得结核分枝杆菌吡嗪酰胺酶的表达蛋白。方法制备结核分枝杆菌基因组DNA,采用聚合酶链反应技术扩增目的基因片段;通过pGEX4T-1构建表达载体pGEX4T-pncA,经序列测定证实正确后转化大肠杆菌DH10b,再经IPTG诱导表达谷胱甘肽S转移酶(GST)-吡嗪酰胺酶融合蛋白;用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析重组蛋白。结果扩增出了结核分枝杆菌pncA基因,构建了具有正确基因序列的质粒载体pGEX4T-pncA,转化大肠杆菌BL21后经诱导产生了高水平的表达产物。结论构建了质粒载体,并诱导表达了GST-吡嗪酰胺酶融合蛋白,为进一步研究吡嗪酰胺耐药性奠定了基础。     

弓形虫微线体蛋白1部分基因的克隆、测序及表达

目的 构建弓形虫ZS2株pWR450-1－微线体蛋白1（MIC1）原核表达重组质粒,对MICI基因进行序列测定,并在不同大肠杆菌中表达。方法 用PCR技术从弓形虫ZS2株的基因组DNA中扩增编码MICI的基因片段,酶切,连接,重组入pWR450-1表达载体,再经含氨苄培养基筛选、酶切、PCR鉴定,进行序列测序后转化大肠杆菌TG－1、JM109（DE3）和DH5α。在不同菌体浓度及不同剂量异丙基－β－D－硫代半乳糖诱导下,用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定MIC1融合蛋白的表达。结果 从ZS2株基因组DNA中扩增出特异的MIC1基因片段,克隆后获得pWR450-1/MIC1重组质粒,测序结果表明,MIC1这部分基因与弓形虫RH株相应基因序列完全一致,高度保守。该基因可在不同大肠杆菌中表达相对分子质量约70000的融合蛋白。结论 构建了弓形虫ZS2株pW450-1-MCI1重组质粒,为研究MIC1的结构与功能奠定了基础。     

ATRN基因siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建并鉴定针对基因ATRN的特异性siRNA真核表达载体。方法:根据ATRN基因cDNA序列,设计针对目的基因ATRNcDNA序列的3个siRNA靶序列,将其插入H1启动子下游,克隆到真核表达载体psiRNA-hH1neo中,转化DH5α菌株扩增,提取质粒通过酶切鉴定和DNA测序鉴定。结果:酶切鉴定及DNA测序结果显示插入片断正确。结论:本研究成功构建针对ATRN的特异性真核表达载体,为进一步研究ATRN基因在雄性生殖系统的功能奠定基础。     

5种食源性致病微生物毒力基因重组质粒的构建、克隆表达与表达产物的研究

目的构建大肠杆菌O157∶H7、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌5种主要食源性致病微生物毒力基因重组质粒载体并鉴定其表达产物,为探讨高通量磁性荧光纳米颗粒标记相应的抗体技术快速检测带毒力基因的致病微生物的可行性奠定基础。方法分别从5种食源性致病微生物毒力岛中选择特异性的毒力基因进行引物设计,分别提取5种目的细菌DNA片段,经PCR扩增、电泳回收目的基因片段,将目的基因片段与原核表达载体pET-23a、pET-28a、pET-32a构建各自的重组质粒,将重组质粒转化入大肠杆菌DH5α内并提取质粒载体,构建后的重组质粒进行酶切和测序鉴定,再转化入表达宿主E·coliBL21（DE3）。在0.1 mmol/L的IPTG诱导下,目的质粒载体在E·coliBL21（DE3）株中表达,SDS-PAGE电泳检测表达蛋白。结果实验成功构建大肠杆菌O157∶H7、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌等细菌的毒力基因重组质粒载体pET-23a-eaeA、pET-28a-tdh、pET-28a-enterotoxin B、pET-32a-invA和pET-28a-ipaH,并克隆出969 bp的eaeA基因片段、567 bp的tdh基因片段、798 bp的enterotoxin B基因片段、1 041 bp的invA基因片段和771 bp的ipaH基因片段。重组质粒载体经酶切和测序与目标基因序列一致。在E·coliBL21（DE3）株中有质粒表达蛋白37.5 kDa（eaeA）、26 kDa（tdh）、34.5 kDa（enterotoxin B）、41 kDa（invA）、32 kDa（ipaH）。结论本研究成功构建了5种食源性致病微生物毒力基因重组质粒并在原核细胞中高效表达,为下一步获得相应的毒力基因抗体及快速诊断试剂的研制应用奠定了基础。     

汉坦病毒G2糖蛋白在昆虫细胞中的表达及其在免疫诊断中的应用

目的构建汉坦病毒(HV）Z10株包膜糖蛋白G2基因的重组表达载体，探索其在昆虫细胞中的表达及在免疫荧光诊断中的应用。方法以质粒pUCm—Z10M为模板设计引物，用聚合酶链反应(PCR)扩增Z10株G2基因片段，将G2片段克隆入pUCm—T质粒载体，碱法提取质粒pUCm-Z10-G2，酶切后将回收片段插入杆状病毒转移载体pFastBacHTa，构建重组体pFastBacHTa-Z10-G2，重组体转化感受态细胞E．coli DH10Bac后，经2轮筛选，提取重组质粒转染昆虫细胞sf9，并用间接免疫荧光技术检测表达的G2蛋白。结果获得含有编码HV Z10株的包膜糖蛋白G2基因的重组质粒，转染昆虫细胞表达出G2蛋白，与肾综合征出血热(HFRS)阳性血清反应，昆虫细胞内呈现特异性环状荧光。检测40份HFRS血清，与全病毒细胞抗原片的符合率为95％。结论成功构建HV Z10株包膜糖蛋白G2基因的表达载体，并在昆虫细胞中表达。可利用重组G2蛋白检测HV感染。     

A new system for detecting mutations in arabidopsis thaliana and the mutational spectra resulting from ethylmethanesulfonate treatment

A system was developed for the detection and analysis of mutations occurring on chromosomal DNA in plants. The plasmid pML4, carrying the Escherichia coli rpsL gene, a target gene for mutagenesis, was inserted into a shuttle vector, pCGN5138, to construct a plasmid which could be used for the transformation of plants. pML4 sequences were introduced into Arabidopsis thaliana mediated by Agrobacterium. The pML4 DNA was rescued from transgenic Arabidopsis plants exposed to mutagens, and the plasmids were introduced into Escherichia coli DH10B to isolate mutant clones. In this system, any form of inactivation mutation in the rpsL gene can be positively selected since it makes the E. coli cells resistant to streptomycin. Here we report that the system could detect the mutagenic effect of ethylmethanesulfonate (EMS). Further characterization of the mutants revealed that G:C to A:T transitions predominated among the EMS-induced mutations. This assay system is useful for the detection and analysis of mutations arising on chromosomal DNA in plants, and should be useful for evaluating analysis of the effects of environmental mutagens.     

人卵泡抑素基因短发夹RNA表达质粒的构建及其干扰效果的初步鉴定

目的:构建人卵泡抑素(FS)基因短发夹RNA(shRNA)真核表达质粒,并瞬时转染方式初步鉴定其干扰效果。方法:依据GenBank数据库提供的人FS基因mRNA核苷酸序列,利用Ambion网站上siRNA软件设计shRNA干扰靶序列,将该序列克隆到线性化的pLKO.1质粒载体上,构建pLKO.1-FS-shRNA重组质粒,并进行酶切和测序鉴定。确认质粒构建成功后,用脂质体(Lipofectamine TM 2000)将重组质粒瞬时转染3AO人卵巢癌细胞系,并用实时定量反转录PCR法检测重组质粒对FS基因的表达抑制效果。结果:构建的shRNA序列经DNA测序证实与设计序列完全一致;实时定量反转录PCR结果显示pLKO.1-FS-shRNA重组质粒瞬时转染的3AO人卵巢癌细胞后,细胞中的FS基因转录受到抑制,抑制率达59%。结论:成功构建了靶向人FS基因的shRNA干扰靶序列重组质粒(PLKO.1-FS-shRNA),转染后对人卵巢癌细胞系FS基因的表达具抑制效果,该实验为进一步研究FS基因的生物学功能奠定基础。     

耐辐射奇球菌recF和recO基因的克隆表达与功能验证

目的 构建耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans,Dr)recF和recO基因的原核表达重组子并在E.coli BL21(DE3)中表达,检测RecO和RecF蛋白能否提高Ecoli BL21(DE3)对紫外线辐射的抵抗能力.方法 采用PCR扩增Dr菌基因组中recF和recO基因片段,以质粒pET30b(+)为基础,构建重组质粒pET30b(+)-recF和pET30b(+)-recO,并转化到E.coliBL21(DE3)中,LPTG诱导重组RecF和RecO蛋白表达,表达产物采用SDS-PAGE鉴定;计算紫外辐照前后各组细菌生存率变化.结果 构建了pET30b(+)-recF和pET30b(+)-recO重组载体,经IPTG诱导后能在E.coli BL21(DE3)中表达RecF和RecO蛋白.结论 构建了原核表达重组质粒pET30b(+)-recF和pET30b(+)-recO,实现RecF和RecO在原核细胞中的表达,体外实验证明Rec0和RecF蛋白能提高E.coli BL21(DE3)对紫外线辐射的抵抗能力.

Abstract：

Objective To construct expressing recombinant of recF and recO from Deinococcus radiodurans Rland express the target protein in E.coli BL21(DE)3.Methods recF and recO gene were amplified by PCR from genomic DNA of Deinococcus radiodurans R1 and inserted into expression plasmid vector pET30b(+) to construct pET30b(+)-recF and pET30b(+)-recO.The recombinant plasmids were transformed into E.coli BL21(DE)3 and the recombinant proteins were expressed by the isopropyl-β-D-thingalactopyranoside(IPTG)and were analyzed with SDS-PAGE.The changes in the survival rate of bacteria in each group before and after UV-irradiation were calculated.Results The recombinant plasmid pET30b(+)-recO and pET30b(+)-recF was obtained and the recombinant protein could be highly expressed in E.coli BL21(DE)3.Conclusion This study has provided a foundation for further studies and applications of the recombinant RecF and RecO,and initial detection shows that recO and recF gene Can increase the resistant ability of E.coli.     

重组大鼠溶菌酶C端多肽的原核表达与纯化

目的 应用基因重组技术,构建pET30a（＋）与LY70的原核表达重组质粒.方法 采用PCR方法扩增LY70基因,经Nde I和Not I双酶切后插入相同酶切pET30a（＋）载体,转化DH5α感受态细胞并进行阳性克隆筛选,用限制性内切酶酶切和核酸序列检测方法鉴定重组质粒DNA,将其转入宿主菌Ecoli Rosetta （DE3）,用IPTG对重组质粒进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blot方法鉴定表达蛋白的分子质量及特异性,表达产物经Ni＋-NTA琼脂糖柱层析纯化.结果 成功构建了重组表达载体pET30a（＋）与LY70,并优化表达,表达产物主要以可溶性蛋白的形式存在.结论 原核细胞可以高效表达溶菌酶的C端多肽而不影响原核表达系统,不失为一种制备溶菌酶功能性多肽的有效手段.