用于HIV诊断的Oligo基因芯片研制

目的研制快速筛查诊断HIV病毒的Oligo芯片.方法以HIV-1B亚型U26942全基因组序列为靶序列,利用 DNA Club、Oligo 6.0、BLAST、Alignment等生物信息学软件,设计高度特异、长度均一、具近似熔解温度(Tm)的Oligo探针,并制备成Oligo芯片.B(U26942)、C(U46016)、F(AF075703)、G(AF061640)四种亚型质粒分别经RD-梯度PCR与随机特异性引物PCR,经荧光标记后与芯片杂交,扫描芯片后进行统计学分析.结果与结论获得22条60 mer探针,Oligo芯片特异性、敏感性及稳定性好,为进一步应用提供了条件.     

EBV病毒全基因组cDNA探针的设计与制备

目的 设计和克隆所有EB病毒(EBV)已知和预计的编码基因作为cDNA探针用于构建EBV微阵列,以促进研究EBV在其相关疾病中的发病学作用。方法 cDNA探针首先由Oligo6.0,Blast和Primer Primier软件设计和筛选全EBV基因组探针,它们的长度被定在300~600 mer并且具有高度特异性。从B95-8细胞和NPC组织的基因组DNA和RNA中,通过PCR和RT-PCR方法扩增这些探针,之后克隆入T/A克隆载体。所有的探针被测序鉴定。结果 除LF1和LF3基因在B95-8细胞的EBV基因组中不存在外,其余85个基因片段(BWRF1基因有7个重复阅读框架)和两个EBERs基因被成功克隆。结论 EBVcDNA探针的设计和克隆为制备EBV微阵列和进一步研究EBV基因组在其相关疾病中的作用奠定了基础。     

两株诺瓦克样病毒新亚型的鉴定

目的 对在广州检出的人类杯状病毒(HuCVs)毒株进行分子生物学鉴定,以确定其是否为新亚型。方法 选择检出的HuCVs进行克隆、转化和序列分析,使用PHYLIP进行核酸序列同源性比较,经Treeview1.5绘制进化树。结果 206份病毒性腹泻标本检出HuCVs18份,检出率为8.74%(18/206),经序列分析证实均为NVs GⅡ毒株。任选其中6株进行PCR产物的克隆和测序,与GenBank中的参考株比较并绘制遗传进化树,其中HuCV/NVGⅡ003/2003/CHN(32282)、HuCV/NVGⅡ004/2003/CHN(32283)与基因文库中病毒的最高同源性分别为83%和87%。结论 广州存在其他国家或地区没有报道过的诺瓦克样病毒新亚型毒株。     

B19微小病毒70-mer寡核苷酸探针的设计

目的　设计B19微小病毒诊断基因芯片的寡核苷酸探针。方法　以微小病毒B19为例 ,利用BLAST软件对其序列进行比对并获得特异序列 ;利用软件Oligo 6设计特异性高、Tm值接近、长度均一的寡核苷酸探针。 结果　获得 12条 70 mer寡核苷酸探针 ,用于芯片打印及病毒检测。结论　利用BLAST系统和生物学软件Oligo 6可简便而有效地设计诊断芯片探针     

人尿酸转运蛋白基因的克隆与序列分析

目的 获得编码人尿酸转运蛋白(humanuricacidtransporter,hUAT)的全长基因。方法 从人肾小管上皮细胞株(HK-2)中提取总RNA,根据Genbank中hUAT基因序列设计特异性引物,然后通过RT-PCR法扩增目的片段。所得目的片段酶切后与载体pEGFP-C1连接,经酶切及序列分析鉴定。结果 成功扩增出980 bp的hUAT全长基因,克隆到pEGFP-C1载体后酶切分析结果与预期一致,序列分析结果与Genbank上公布的hUAT序列完全一致。结论 成功克隆出hUAT基因,序列分析结果完全正确,为对该基因进一步研究奠定了基础。     

卡托普利对糖尿病性心肌病大鼠心肌组织能量代谢和炎症反应的影响

目的 探讨卡托普利保护心肌组织的作用机制。方法 (1)将糖尿病性心肌病大鼠分为对照组和治疗组,治疗组每天给予卡托普利1.5 mg/kg·b.w.,口服15 w;(2)从动物心肌组织中抽提mRNA,经逆转录分别用Cy3、Cy5荧光标记,获得两组动物来源的cDNA探针;(3)cDNA探针与基因表达谱芯片杂交,结果由扫描仪扫描并用软件进行分析统计。结果 (1)脂肪酸b氧化相关基因、线粒体电子质子偶联和氧化磷酸化相关基因、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)依赖的白三烯B4羟基脱氢酶基因在治疗组中表达明显上调。(2)二甲基精氨酸水解酶基因在干预治疗组中表达明显下调。结论 卡托普利可能通过改善病变心肌的能量供应、抑制炎症反应对糖尿病性心肌病心肌组织起保护作用。     

cyclin E基因siRNA抑制K562细胞生长的研究

目的 应用RNAi技术,研究cyclinE基因小干扰RNA(siRNA)对K562细胞生长的抑制作用。方法 针对cyclinEmRNA设计siRNA序列,经PCR方法体外扩增,得到含有U6启动子以及siRNA序列的PCR产物,以LipofectamineTM2000脂质体法转染K562细胞,分别设置为干扰组、阴性对照组以及空白对照组,转染48h后进行细胞计数、RT-PCR及通过PI染色进行流式细胞仪检测,观察其干扰效果。结果 干扰组与阴性对照组和空白对照组相比,活细胞计数减少约80%,G₁期细胞百分比增高30%,细胞基本停止增殖。干扰组cyclinEmRNA表达明显减弱,相对阴性对照组及空白对照组,干扰组mRNA表达下降70%。阴性对照组与空白对照组无显著性差异。结论 应用RNAi技术可以有效地干扰cyclinE基因的表达,并进一步抑制细胞的生长,但对于干扰的长期有效性尚无实验结论,需通过长效表达载体实验验证。     

与海洛因有完全交叉反应的抗吗啡单抗的制备

目的 制备吗啡的单克隆抗体(mAb)并鉴定抗体的特性。方法 6-琥珀酰化吗啡与Bluecarrier(BC)载体蛋白交联制备6-琥珀酰化吗啡酯(M-6-S-BC),用其免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤,经筛选和3次克隆化,从制备的腹水中纯化单克隆抗体。结果 获得4株杂交瘤细胞G1、G3、H4和B1,其分泌单抗的亚型均为IgG1型。经ELISA鉴定,该单克隆抗体可结合游离的吗啡、海洛因及可待因,而且对海洛因的结合优于吗啡,该单抗不与非阿片类药物结合。结论 所制备的吗啡单克隆抗体可特异性结合吗啡等阿片类药,将为建立体外吗啡及海洛因的非同位素检测方法奠定基础。     

一株鸭乙型肝炎病毒DHBV全基因的克隆和序列分析

目的 从本地樱桃谷鸭血清中克隆鸭乙型肝炎病毒(DHBV)DNA,并进行序列分析。方法 用PCR扩增DHBV全基因,连接至T载体上,挑选克隆进行测序分析,与GenBank中16株DHBV全基因组进行同源性比较,并进行分子进化树分析。结果 24-18与16株DHBV基因组比较,核苷酸同源性介于89.4%~99.3%之间,各开放阅读框氨基酸同源性比较显示差异显著地方位于P区。结论 24-18属于DHBV西方基因型中的一个亚型。     

抗人晚期糖基化终产物受体胞外段不同表位单克隆抗体的制备

目的 制备抗人晚期糖基化终产物受体(RAGE)胞外段单克隆抗体。方法 用纯化人重组RAGE胞外段(氨基酸序列23~342)免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与NS-1融合制备杂交瘤,经筛选和两次克隆化,从制备的腹水中纯化单克隆抗体。结果和结论 获得两株杂交瘤细胞B2.2和E10,其分泌单抗的亚型均为IgG2b。经ELISA、Western blot和流式细胞仪鉴定,证明两株单抗均可结合重组RAGE及表达于细胞表面的RAGE,且两株抗体识别的位点为远隔表位,所建立的双夹心法可用于检测可溶性重组RAGE。这两株抗体将为研究RAGE相关疾病提供有效的工具。     

HIV基因芯片的初步研究

目的：建立HIV基因检测芯片的分析技术，方法：分离HIV 1U26942基因限制性显示片段作探针，应用PixSys 5500点样仪将探针打印在氨基包被的玻片上制作基因芯片，然后与随机引物荧光标记的HIV样品进行杂交，以分析限制性显示基因片段的杂交动力学，经杂交后清洗和干燥，扫描芯片进行检测。结果：对基因检测芯片的制作与检测的实验条件进行了初步研究并筛选了12个限制性显示基因探针。结论：建立的检测芯片的实验方法可行且较特异。     

HIV基因芯片的初步研究

目的建立HIV基因检测芯片的分析技术。方法分离HIV1U26942基因限制性显示片段作探针,应用PixSys 5500点样仪将探针打印在氨基包被的玻片上制作基因芯片。然后与随机引物荧光标记的HIV样品进行杂交,以分析限制性显示基因片段的杂交动力学。经杂交后清洗和干燥,扫描芯片进行检测。结果对基因检测芯片的制作与检测的实验条件进行了初步研究并筛选了12个限制性显示基因探针。结论建立的检测芯片的实验方法可行且较特异。     

东莞市艾滋病病毒1型的分子流行病学研究

目的了解东莞市不同人群中艾滋病病毒(HIV)各亚型毒株的流行情况和传播规律。方法采集东莞市经蛋白印迹法确认的24名HIV感染者的外周抗凝血,分离单核细胞、提取核酸后用套式聚合酶链反应扩增HIV-1膜蛋白(env)基因C2-V3区的核酸片段,进行序列测定,鉴定病毒亚型。用威斯康星GCG软件进行共享序列、基因离散率的计算和毒株的聚类分析。结果在24份阳性标本中,有13份标本PCR扩增阳性,亚型分析结果表明东莞市存在HIV-1B和CRF01-AE两种亚型。结论HIV-1B和CRF01-AE可能是东莞市艾滋病病毒流行的主要亚型。     

1997～2002年山东省HIV-1流行株env基因序列测定和亚型分析

①目的对1997～2002年间山东地区HIV-1各亚型分离株进行基因分型，了解各亚型的分布及其与传播途径的相互关系。②方法采集1997～2002年间山东省38例HIV-1感染者的抗凝全血标本，用巢式PCR技术扩增外周血单个核细胞中HIV-1前病毒env基因C2～V3区，并对C2～V3区的核苷酸序列进行测定和分析。⑧结果山东省38例HIV-1分离株中存在亚型和重组毒株4种（A、B、C、A／E）。其中A亚型5株，B亚型22株（其中包括泰国B亚型11株），C亚型10株，A／E重组毒株1株。各亚型内的离散率有差异，A、B、c亚型内基因离散率分别为1．5％、8．6％和1．9％。在性乱人群和静脉吸毒人群中以A亚型和C亚型为主；在职业献血和不安全血制品使用者中以B亚型为主。④结论1997～2002年间山东省HIV-1流行特点为A、B、c亚型共存，伴有重组毒株；传播途径复杂，基因变异较大，B亚型仍然为主要流行株。     

辽宁省99例人类免疫缺陷病毒1感染者gag-pol区基因序列分析

目的 研究辽宁省人类免疫缺陷病毒／艾滋病（HIV／AIDS）患者gag-pol区的基因序列特征。方法采集辽宁省99例HIV-1感染者外周静脉血,提取前病毒DNA,经巢式PCR方法扩增gag—pol区2．6kb片段,与HIVS序列数据库中亚型参考序列共同构建系统进化树以区分亚型,并计算gag—pol区不同编码区域的基因离散率和Ks／Ka比值。结果 在辽宁省99例HIV-1感染者中发现A、B’、B、C、G5种亚型,循环重组型CRF01_AE、CRF03_AB、CRF06_cpx、CRF07_BC、CRF08_BC5种循环重组型和循环重组型间的重组ICR07／08。以B’亚型最多见,其次为CRF01_AE。在gag—pol区内,p17区、p2-p6区基因离散率高于p24区、蛋白酶及逆转录酶编码区。但B亚型p24区基因离散率处于较高水平。CRF07_BC和CRF08_BC在gag-pol各区基因离散率及同义替换、错义替换普遍处于较低水平。各亚型毒株的p2-p6区的Ks／Ka值最低,其均值〈1,而CRF01_AE毒株RT区的Ks／Ka值高达10．45。结论 辽宁省流行的HIV-1 gag—pol区亚型十分复杂。p24、蛋白酶及逆转录酶编码区是更为保守的区域。B亚型毒株的p24区承受较大的正向选择压力,CRF01_AE毒株RT区承受了较大的负向选择压力。CRF07_BC和CRF08_BC传入辽宁省的时间较短,奠基者效应明显。     

荧光原位杂交检测人类免疫缺陷病毒-1 DNA对感染者外周血淋巴细胞染色体的整合

目的：探讨荧光原位杂交（FISH）检测人类免疫缺陷病毒（HIV-1）前病毒DNA对外周血淋巴细胞（PBL）染色体整合的可行性与效率。方法：收集3例HIV-1感染者,常规制备其PBL染色体,采用FISH方法,以生物素标记的HIV-1gag及HIV-1pol的cDNA作为探针,检测HIV前病毒在其中的整合。结果：观察了172套来源于3位感染者PBL的染色体,6套有阳性荧光信号。结论：FISH可用于检测HIV前病毒DNA对患者PBL染色体整合,且是一种灵敏、可靠的方法。     

沈阳市1份人类免疫缺陷病毒的基因序列分析

目的 :对 2 0 0 4年我院门诊检出的 1例艾滋病感染者体内的HIV 1病毒进行基因序列分析和亚型鉴定。方法 :从HIV 1感染者的全血标本中提取脱氧核糖核酸 (DNA)作为PCR扩增的模板 ,套式引物扩增HIV 1前病毒DNA的p17与p2 4交界部分的基因片断并进行测序。所测定序列与各亚型国际参考株及亚洲流行参考序列进行比较 ,确定被检标本的亚型 ,并进行基因序列分析。结果 :该患HIV 1病毒属于B’亚型毒株 ,经输供血途径感染。该毒株与泰国B’亚型参考株B TH 92 92TH0 14的基因距离最为接近。结论 :在沈阳市有效地控制艾滋病经输供血途径传播应引起我们高度的重视     

利用寡核苷酸芯片快速检测结核分枝杆菌利福平耐药rpoB基因突变

目的:开发快速检测结核分枝杆菌利福平耐药rpoB寡核苷酸突变的基因芯片。方法:根据结核杆菌rpoB基因序列设计探针和引物并制备基因芯片,从临床痰标本中提取结核菌的基因组DNA,PCR扩增含有rpoB基因突变位点的特异DNA片段,荧光标记后与芯片上的特异性寡核苷酸探针进行杂交,同时与DNA测序法比较。结果:22株临床痰标本有18株可用寡核苷酸芯片检测出来,正确率可达82%;患者痰液中少量DNA足够进行芯片检测,无须细菌培养。结论:利用寡核苷酸芯片检测结核菌对利福平的耐药性具有较高的准确性和敏感性,可以应用于临床耐药性诊断。     

Subtype and sequence analysis of HIV-1 strains in Heilongjiang Province

Background Human immunodeficiency virus (HIV-1) is divided into two types, HIV-1 (groups M, N and O) and HIV-2. Heilongjiang Province located in the northeast of China, and the feature of the subtype distribution and sequence characteristics of HIV-1 strains prevalent in Heilongjiang Province is still uncertain. The aim of this study was to investigate the subtype distribution and genetic characteristics of HIV-1 strains in one hospital in Heilongjiang Province. Methods HIV-1 env gene was amplified by nested-PCR from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) obtained from 19 HIV-1 seropositive individuals in Heilongjiang Province. The C2-V3 region was sequenced. Aligned the nucleotide sequence of 19 samples with CLUSTAL W (BioEdit) software, results were acquired and used for phylogenetic tree analysis after artificial adjustment. Reference sequence, downloaded from Los Alamos HIV Sequence Database, was used to identify the subtype of obtained sequence. Genetic distance between sequences was assessed using the software MEGA 3.1 Kimura 2-parameter, and the Phylogenetic tree was reestablished with Neighbor-Joining method.Results Phylogenetic tree analysis showed that 19 Heilongjiang strains clustered closely to subtype B strain from Thailand and were far from other international subtype reference strains. Statistical test showed no significant discrepancy between the genetic distance of interclass and intra-class (P>0.05). The analysis of V3 loop amino sequence of 19 Heilongjiang B strains revealed that V3 tip motif of 10 samples (52.63%) was GPGQ, and of 4 samples (21.53%) was GPGR.Conclusions The subtype of 19 HIV-1 seropositive individuals in Heilongjiang Province is B’, and it is introduced from He’nan Province. V3 tip motifs of the HIV-1 isolates are mainly GPGQ and GPGR.