去细胞猪主动脉瓣移植于犬腹主动脉内构建组织工程瓣

目的 探讨在犬腹主动脉内构建组织工程心脏瓣膜的实验方法。方法 将预种犬血管间质细胞和内皮细胞的去细胞猪主动脉瓣叶(猪瓣),移植于6条犬的腹主动脉内,于术后4,6,8和10周对移植瓣叶进行形态、组织结构及免疫组化染色观察。结果 (1)移植术后4周时瓣叶周边有多层细胞长入,新细胞外基质形成,原支架组织部分吸收。(2)10周末猪瓣组织完全吸收,为宿主细胞及新合成的细胞外基质取代。基质中间质细胞主要为成纤维细胞和肌纤维母细胞。细胞外基质成分主要为Ⅰ、Ⅲ型胶原和少量弹力纤维,并含有中性和酸性黏多糖。(3)内皮细胞覆盖于瓣叶表面。结论 (1)移植于犬腹主动脉内的去细胞猪瓣于移植术后10周末基本构成组织工程瓣叶;(2)腹主动脉内异位移植是一种可供选择的实验研究方法。     

去细胞猪主动脉瓣叶的获取和内皮细胞的种植

目的　探讨猪主动脉瓣叶去细胞后作为组织工程心脏瓣膜支架的可行性。　方法　经胰酶 - EDTA、表面活性剂和核酸酶处理 ,去除猪主动脉瓣叶的细胞成分 ,测定瓣叶去细胞前、后的生物力学特性 ,并在其表面种植新生牛主动脉内皮细胞 (BAECs) ;分别行大鼠皮下包埋实验。　结果　猪主动脉瓣叶中的细胞成分能完全去除 ,获得完整无细胞的纤维网状支架 ,断裂强度和断裂伸长率无明显变化 ;种植的 BAECs在去细胞瓣叶表面可形成一层连续的细胞层 ,其分泌前列环素 (PGI2 )的能力同直接种植在 2 4孔板中的比较 ,差异无统计学意义 (P>0 .0 5 )。　结论　猪主动脉瓣去细胞后获得的纤维支架可以用来构建组织工程瓣膜 ,适宜于血管内皮细胞的生长。     

人骨髓基质干细胞构建组织工程心脏瓣膜的研究

目的探讨人骨髓基质干细胞种植在去细胞猪主动脉瓣叶上体外构建组织工程心脏瓣膜的可行性。方法经1%TritonX100、0.01%胰酶0.02%EDTA、DNaseI及RNaseI处理制备去细胞猪主动脉瓣叶支架,测定瓣叶去细胞前、后的生物力学特性;人骨髓基质干细胞体外分离、培养、扩增后种植在去细胞瓣叶表面,观察细胞生长情况。结果猪主动脉瓣叶去细胞后获得完整无细胞的纤维网状支架,瓣叶去细胞前、后的断裂强度和断裂伸长率差异无统计学意义(P>0.05);体外培养的人骨髓基质干细胞(MSCs)在去细胞瓣叶表面形成一层基本连续的细胞层。结论去除细胞成分的猪主动脉瓣叶组织是一种良好的纤维支架,可以用于构建组织工程心脏瓣膜;人骨髓基质干细胞种植在去细胞猪主动脉瓣叶上构建组织工程心脏瓣膜是可行的。     

内毒素抑制人外周血淋巴细胞孤啡肽受体基因的表达

目的研究内毒素对人外周血淋巴细胞孤啡肽受体(ORL-1)基因表达的影响。方法以0、0．1、10和100ng／ml终浓度的内毒素刺激的人外周血淋巴细胞中提取的总RNA为模板，采用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参，逆转录聚合酶链反应技术半定量分析外周血淋巴细胞的ORL-1的mRNA水平，Southern印迹法证实聚合酶链反应产物的特异性。结果未受刺激时，正常人外周血淋巴细胞孤啡肽受体的mRNA的水平为1．060±0．390；100ng/ml的内毒素作用3小时，ORL-1基因表达显著抑制(P＜0．05)；10ng／ml的内毒素刺激作用6小时，ORL-1的mRNA水平明显下降(P＜0．05)；0．1ng／ml的内毒素刺激12小时，ORL-1的mRNA水平呈显著性下降(P＜0．05)；未受刺激作用的淋巴细胞24小时内，ORL-1的基因表达水平无明显变化(P＞0．05)。结论内毒素抑制人外周血淋巴细胞转录ORL-1的mRNA水平。淋巴细胞ORL-1基因的表达水平与细胞的功能状态有关。孤啡肽可能参与机体的免疫调节。     

环状RGDfK肽对肌成纤维细胞整合素αVβ3表达调控的实验研究

目的 探讨环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-脯氨酸-赖氨酸短肽(Cyclo-RGDfK)能否提高去细胞瓣对肌成纤维细胞(myofibroblast)的黏附性能,以及RGD肽对Integrin αVβ3基因表达的调控.方法 组织块培养法获取大鼠主动脉壁肌成纤维细胞(myofibroblast),免疫荧光染色检测波形蛋白(Vimentin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)分子在培养myofibroblast中的表达.将去细胞瓣随机分为3组(每组7个),A组:去细胞瓣未接受任何处理;B组:去细胞瓣与交联剂1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)反应36h;实验组:去细胞瓣与EDC反应36h后,再与Cyclo-RGDfK反应24h,使RGD肽共价结合于去细胞瓣.将第5代myofibroblast分别接种至各组瓣膜上.HE染色和扫描电子显微镜观察细胞黏附增殖状况,半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测Integrin αVβ3基因在各组的表达.结果 免疫荧光染色显示原代培养的myofibroblast生长良好,高表达Vimentin和α-SMA分子.HE染色和扫描电子显微镜显示myofibroblast在实验组的生长好于A组和B组,半定量PCR示Integrin αVβ3 mRNA在实验组的表达高于A组和B组,差异有统计学意义(P＜0.05),而A组与B组比较差异无统计学意义(P=0.900).结论 Cyclo-RGDfK促进myofibroblast在去细胞瓣上黏附,此效应可能与RGD肽上调Integrin αVβ3基因表达有关.     

RGD肽对猪去细胞心脏瓣膜表面修饰的研究

目的 检测促黏附分子RGD肽(精-甘-天冬氨酸)表面修饰去细胞瓣天然支架可行性.方法 应用酶和去污剂法制备猪去细胞主动脉瓣,固相法合成含RGD短肽GRGDSPC.实验组采用化学交联剂Sulfo-LC-SPDP使GRGDSPC肽与之结合,去细胞瓣直接混合短肽和单纯去细胞瓣两组作对照.X射线光电子能谱法(XPS)支架材料表面分析.结果 XPS法显示,对照组未检出硫元素,实验组检出硫元素电子结合能中间峰位在163.1～165.7eV,提示二硫键形成,证明Sulfo-LC-SPDP使GRGDSPC肽成功固定于去细胞瓣表面.结论 通过化学交联法实现RGD肽对去细胞瓣表面修饰,有望促进组织工程心脏瓣膜构建.     

脱细胞天然支架生物力学性能变化及预处理改善组织相容性的实验研究

目的观察脱细胞猪主动脉瓣的生物力学性能变化,探讨不同预处理改善天然支架组织相容性的效果。方法新鲜猪主动脉瓣经酶加去污剂法去除细胞,力学测试仪检测其最大负荷、最大应力、最大应变和弹性模量的变化,苏木精-伊红（HE）染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色和扫描电镜观察其病理形态学变化;将脱细胞瓣膜分别予磷酸缓冲液、多聚赖氨酸和未灭活胎牛血清包被处理,然后种植大鼠主动脉肌成纤维细胞,甲基噻唑基四唑试验检测细胞黏附率,HE染色和扫描电镜观察形态学变化。结果酶加去污剂法能完全脱去瓣膜细胞,基本维持胶原纤维的空间结构,但其最大负荷、最大应力及弹性模量下降,最大应变上升（P〈0．05）;胎牛血清预处理去细胞瓣能显著提高肌成纤维细胞的黏附率,促进细胞生长、分化和增殖,并在瓣膜表面形成连续的细胞层（F值=129．26,P=0．000）。结论酶加去污剂法可较完全去除猪主动脉瓣膜细胞并保持细胞外基质的三维结构,但其生物力学性能有所下降;胎牛血清预处理能改善脱细胞瓣天然支架的细胞黏附、生长和繁殖。     

反转录病毒载体介导猪MHCⅡ分子在猪骨髓细胞中的表达

目的构建猪MHC Ⅱ分子的反转录病毒表达载体，建立产生病毒颗粒的包装细胞株，体外转导小型猪骨髓细胞并观察目的基因的表达情况，为研究小型猪转导同种异体MHC Ⅱ分子对于肝脏移植特异性免疫耐受的诱导提供实验基础和实验材料。方法利用基因重组技术将目的基因SLA-DRB^dd、SLA-DQA^dd和SLA-DQB^dd克隆到反转录病毒载体pLNCX2上，通过脂质体转染包装细胞AmphoPack^TM-293细胞，从G418筛选阳性克隆细胞培养上清中获得了有感染性的病毒颗粒；并对体外培养的猪骨髓细胞进行了感染，采用Nothern杂交和逆转录．聚合酶链反应（RTPCR）等方法检测了目的基因在骨髓细胞中的表达。结果经过酶切和测序验证已成功构建了MHC Ⅱ分子的反转录病毒表达载体，在转染AmphoPack^TM-293细胞后可以产生有感染性的重组病毒颗粒，稳定的CFM-GFG418抗性率为6％～11％，RT结果显示抗性细胞中有目的基因的RNA转录产物存在，而转染空载体的对照组没有。结论重组有目的基因的逆转录病毒载体pLNCX2经过包装细胞AmphoPack^TM-293产生的病毒颗粒可以有效地将猪MHC Ⅱ分子转导入猪的骨髓细胞并获得长期稳定的表达。     

外周血肝癌多药耐药荧光定量检测及意义

目的　评价荧光定量聚合酶链式反应 (FQ PCR)检测原发性肝癌外周血有核细胞多药耐药 (MDR1)基因表达与肝癌细胞MDR1基因表达的相关性 ,建立原发性肝癌外周血MDR1基因临床检测方法。方法　选择 5 5例原发性肝癌病例 ,术前抽血提取有核细胞 ,采用FQ PCR方法检测MDR1基因表达 ;采用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)和流式细胞技术 (FCM)检测术后肿瘤标本MDR1mRNA和P 糖蛋白 (P gp)表达。结果　 5 5例原发性肝癌病例荧光定量PCR、RT PCR、FCM方法检测MDR1的阳性表达例数分别为 2 5、3 0、3 3 ;3种方法的检测结果明显相关 (P <0 .0 1)。结论　FQ PCR方法检测外周血MDR1基因表达的结果与肝癌细胞MDR1的表达明显相关 ,可用于原发性肝癌病例多药耐药性的临床检测。     

去细胞异体真皮、去细胞猪真皮和自体刃厚皮移植在临床中的应用

目的观察去细胞异体真皮或去细胞猪真皮加自体刃厚皮移植在深度烧伤和整形外科中的应用效果。方法采用去细胞异体真皮或我们研制的去细胞猪真皮加自体刃厚皮移植的方法,修复各种创面119例次,比较不同创面的植皮成活率,观察应用不同部位的皮肤覆盖去细胞异体真皮或去细胞猪真皮与植皮成活的关系,并对部分病例进行了组织学观察和随访。结果削痂、切痂和切瘢创面植皮成活率分别为(93．4％±3．1)％、(92．1±4．6)％和(94．5±3．8)％,三者间差异无显著意义;去细胞异体真皮加自体刃厚皮移植与去细胞猪真皮加自体刃厚皮移植,二者植皮成活率差异无显著意义。躯干、四肢自体刃厚皮覆盖的去细胞异体真皮或去细胞猪真皮,植皮成活率分别为(93．1±4．8)％、(89．0±6．2)％,而应用刃厚头皮或自体微粒皮加异体皮覆盖的去细胞异体真皮或去细胞猪真皮,植皮成活率明显下降(P<0．05或0．01)。组织学观察,术后19个月时表皮、真皮形态正常,胶原纤维排列规则,未见胶原纤维明显增生和瘢痕化,无皮肤附件。成活的复合移植皮肤,与邻近正常肤色近似,色素沉着轻,无明显皱缩,触之软,活动度好。结论去细胞异体真皮或去细胞猪真皮加自体刃厚皮移植修复深度烧伤创面或切瘢后创面不失为一种较理想的材料。     

新型复合组织工程瓣膜的构建和体外生物力学研究

目的 构建复合瓣膜进行体外生物力学和脉动流测试.方法 猪主动脉瓣脱细胞处理作为支架,用3-羟基丁酸与3-羟基己酸共聚酯涂层,构建复合瓣膜,用拉伸机进行体外生物力学研究,以新鲜和脱细胞猪瓣作为对照(每组12枚);用脉动流仪进行流体力学研究,以脱细胞猪瓣作为对照(每组6枚).结果 复合瓣膜抗拉强度(12.08±1.72)MPa,与新鲜猪瓣(8.38±0.52)MPa和脱细胞猪瓣(8.16±0.66)MPa比较,差异有统计学意义(P＜0.05);在心输出量2～7L/min时,复合瓣膜与脱细胞猪瓣血流动力学参数差异无统计学意义(P＞0.1).结论 复合瓣膜具有良好的生物力学、流体力学特性.     

猪睾丸Sertoli细胞的分离、培养及其免疫豁免相关细胞因子的检测

目的 探讨猪睾丸Sertoli细胞分离、培养的方法 ,并对其体外培养的状态及免疫豁免相关细胞因子的表达进行检测,为Sertoli细胞用于移植提供依据.方法 无菌条件下取10～15日龄的湖北白猪睾丸,剥离睾丸白膜及表面血管,剪碎后用2.0 g/L V型胶原酶以及2.5 g/L胰蛋白酶和0.5 g/L DNaseI消化(两步法)分离Sertoli细胞,于37℃、含体积分数为5%CO<,2>的培养箱中培养.采用倒置相差显微镜观察细胞形态,透射电镜进行超微结构鉴定,流式细胞仪检测细胞体外活率.逆转录聚合酶链反应检测Sertoli细胞sox9、FasL、转化生长因子β(TGF-β)及Clusterin的表达,四甲基偶氮唑盐(MTT)检测细胞的活性.结果 猪睾丸经分离、培养,所获得的Sertoli细胞纯度达90%以上,培养后的细胞凋亡率为(2.61±0.96)%,死亡率为(2.12±0.74)%;培养的Sertoli细胞稳定表达sox9、TGF-β、Clusterin,而FasL表达较弱.体外培养的Sertoli细胞可以保持良好活性达21 d.结论 采用V型胶原酶以及胰蛋白酶和DNaseI两步法消化分离可获得大量高纯度的Sertoli细胞,该细胞在培养过程中能够稳定表达FasL、TGF-β和Clusterin分子.     

小型猪火器伤时肠道细菌移位的检测

我们通过常规细菌培养、免疫组织化学和聚合酶链反应 (PCR )方法检测小型猪火器多发伤后血中及脏器中的细菌 ,对火器多发伤时检测肠道细菌移位的方法进行探讨。一、材料与方法1.实验动物及分组 :成年 (15± 5 )个月贵州Ⅲ系小型香猪 2 4只 ,体重 (2 5±5 )kg。动物随机分为 4组 (每组n =6) ,其中对照组 (C组 )模型制作术后不致伤 ;多发伤组 (M组 )模型制作术后 2d射击双侧大腿和颅顶骨 ,造成双侧股骨干骨折加颅骨切线伤 ;颅骨切线伤组 (H组 )射击致颅骨切线伤 ;骨折组 (L组 )射击致双侧股骨干骨折。2 .监测指标和方法 :(1)体循环血和门静…     

去细胞组织工程同种心脏瓣膜的免疫学特征

目的构建去细胞的组织工程同种心脏瓣膜,探讨其免疫学特性变化。方法取液氮保存的人同种主动脉带瓣管道,采用低渗液-去污剂(1％去氧胆酸,1％DOA)-核酸酶[20mg／L核糖核酸酶(RNase)和200 mg／L去氧核糖核酸酶(DNase)]去细胞法去除同种心脏瓣膜、管壁组织及肌肉中所有的细胞成分,保留完整的细胞外基质,构建去细胞的组织工程同种心脏瓣膜;采用免疫组织化学方法测定HLA-DR抗原在同种心脏瓣膜组织中的表达;行大鼠皮下移植试验,评价组织学变化及Van Kosaa银染色法定性分析、原子吸收光度计法定量分析组织的钙化程度。结果去细胞同种心脏瓣膜的白细胞抗原-DR(HLA-DR)表达较深低温液氮保存同种心脏瓣膜(HVA)显著下降;大鼠皮下移植8周后,去细胞同种心脏瓣膜组织中的炎性细胞浸润显著减少,定性分析表明去细胞组瓣叶和管壁组织中呈黑色颗粒的钙盐沉积较深低温液氮组显著下降,尤管壁组织更为显著;定量分析亦表明去细胞瓣叶和管壁组织的钙化程度显著下降(瓣叶:去细胞组0．83±0．17 mg／ g,深低温液氮组[(1．39±0．26)mg／g,P<0．05];管壁:去细胞组(2．35±2．58)mg／g,深低温液氮组[(42．66±7．46)mg／g,P<0．05)]。结论去细胞同种心脏瓣膜的免疫原性显著下降,有望减轻移植后免疫反应,延长同种心脏瓣膜的使用寿命。     

猪胚胎成纤维细胞αGal表达的鉴定

目的确定猪胚胎成纤维细胞是否合成α1,3半乳糖苷,为下一步进行基因工程改造的结果提供鉴定方法。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western免疫印迹法分别在转录和翻译水平确定猪胚胎成纤维细胞是否合成α1,3半乳糖苷。结果通过RT-PCR扩增,发现α1,3半乳糖苷转移酶基因在原代和传代培养的猪胚胎成纤维细胞内转录,Western免疫印迹证实,在原代和传代培养的猪胚胎成纤维细胞能合成含有α1,3半乳糖苷残基的糖蛋白。结论猪胚胎成纤维细胞可合成α1,3半乳糖苷;可采用PCR扩增和Western免疫印迹方法对经过基因工程改造的猪胚胎成纤维细胞是否表达α1,3半乳糖苷转移酶进行鉴定。     

Expression of hepatitis B virus genes in early embryonic cells originated from hamster ova and human spermatozoa transfected with the complete viral genome

目的:使去透明带金黄地鼠的卵母细胞与携带乙肝病毒 DNA(HBV DNA)的人类精子体外受精,检测乙肝病毒基因(S 基因与 C 基因)在早期胚胎细胞中的复制与表达。方法:通过异种体外受精,由人类精子将乙肝病毒基因导入去透明带地鼠卵母细胞中;用聚合酶链反应(PCR)检测单细胞和2-细胞胚胎细胞的基因组中是否有 S 基因和前 C/C 基因;用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)研究上述基因是否在胚胎细胞中表达。以全长 HBV DNA 制备探针,与胚胎细胞制片进行荧光原位杂交(FISH),观察胚胎细胞基因组中是否有 HBV DNA整合。结果:PCR、RT-PCR 和 FISH 分析均在待测样本中获得阳性结果。结论:以精子为载体、携带到卵内的 HBV 基因能够在早期胚胎细胞中复制和表达,该结果为 HBV 有可能通过男性生殖细胞垂直传递给子代提供了直接证据。     

孕妇外周血中胎儿细胞和DNA的分离及分析

近年来无创伤性产前遗传学诊断技术的研究进入到胎儿染色体和基因的诊断 ,利用母血中胎儿细胞及其遗传物质进行产前诊断。胎儿细胞中有核红细胞 (NRBC)在母体外周血中的数量较多 ,此类细胞含有胎儿的全部遗传信息 ,且生命周期较短 ,是理想的产前诊断的胎儿细胞 ,在此介绍几种从母血中分离胎儿有核红细胞的方法。业已证实 ,母体外周血中存在胎儿DNA ,且DNA的浓度随孕周而增高 ,这使得从母血中直接获取胎儿DNA来进行基因诊断成为可能。目前聚合酶链反应 (PCR)及荧光原位杂交 (FISH)技术是较为成熟的分析胎儿DNA的方法     

气-液面培养对角质形成细胞分化的影响

目的 研制角质形成细胞-胶原-猪去细胞真皮基质(PADM)组织工程皮肤,观察气-液面培养对角质形成细胞分化及细胞因子基因表达的影响.方法 将角质形成细胞种植在真皮基质胶原面进行气-液面培养和浸没式培养.采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,对比研究两种培养方法获得的细胞膜片bFGF基因表达差异.结果 气-液面培养获得的角质形成细胞层结构与正常皮肤相似,细胞分化良好.单纯浸没式培养角质形成细胞层较薄,分化较差.气一液面培养获得的细胞膜片bFGF mRNA表达量明显高于单纯浸没式培养(t=3.825,P<0.01).结论 气-液面培养可促进角质形成细胞的生长、分化及复层表皮结构形成,影响细胞因子的基因表达.     

膀胱癌患者外周血细胞角蛋白20mRNA检测及意义

目的　探讨膀胱癌患者外周血中特异性细胞角蛋白 2 0 (CK 2 0 )mRNA在诊断中的意义。　方法　膀胱癌患者 91例 ,半巢式逆转录聚合酶链反应检测其外周血有核细胞成分中CK 2 0mRNA含量 ,2 5例健康人作为对照。　结果　 91例患者中 37例 (41 % )外周血CK 2 0mRNA阳性表达 ,其中证实有转移的 2 0例中 1 7例 (85 % )阳性 ;对照组 2 5例均为阴性。外周血细胞CK 2 0mRNA的阳性率在有远处转移的病例中显著升高 (P <0 .0 1 )。　结论　检测膀胱癌患者外周血中CK 2 0mRNA对早期发现膀胱癌细胞的血行播散有重要参考价值     

髓样细胞表达触发受体1在重症急性胰腺炎中的表达和意义

目的探讨髓样细胞表达触发受体1(TREM-1)在重症急性胰腺炎(SAP)中的表达和意义。方法反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测轻型胰腺炎、重症急性胰腺炎患者和正常人外周血TREM-1 mRNA的表达,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测SAP外周血中可溶性TREM-1、α和TNF-IL-10的含量。结果 SAP患者外周血中TREM-1 mRNA的相对表达显著高于轻型胰腺炎和正常人对照组(P0.05);患者外周血中TREM-1与TNF-α和IL-10的含量均呈正相关,相关系数分别是0.951SAP(P0.05)和0.873(P0.05)。结论 TREM-1在SAP患者外周血中的呈高表达,与TNF-α和IL-10关系密切,具有重要的临床意义。