Obestatin抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖与分化

目的:观察obestatin对3T3-L1前脂肪细胞增殖分化的影响.方法:应用不同浓度的obestatin (10-8 、10-9 、10-10、10-11、10-12 mmol/L)和10-10 mmol/L ghrelin干预体外培养的3T3-L1前脂肪细胞,MTT法观察其对细胞增殖的影响,并与空白对照组比较;分别应用10-10 mmol/L obestatin和ghrelin全程干预3T3-L1前脂肪细胞分化成熟过程(分化第1～10日),采用油红O染色法鉴定脂肪细胞分化并测定分化成熟脂肪细胞的脂肪含量,RT-PCR法检测分化过程中及成熟脂肪细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ2(PPARγ2) mRNA的表达水平,并与对照组(加常规诱导剂)比较.结果:与空白对照组相比,不同浓度obestatin组细胞数量均明显降低(P＜0.05);10-10mmol/L obestatin连续作用10 d的3T3-L1前脂肪细胞与对照组相比,脂肪产量明显减少(P＜0.05);脂肪细胞分化过程中PPARγ2基因表达逐渐增多;在成熟脂肪细胞中,与对照组相比,obestatin组PPARγ2基因表达显著降低(P＜0.05).Ghrelin的作用与之完全相反.结论:Obestatin抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖和分化.     

脂肪细胞去分化及构建组织工程化脂肪的实验研究

目的 探讨成熟脂肪细胞去分化及去分化脂肪细胞作为种子细胞构建组织工程化脂肪组织的可行性.方法 取健康女性脂肪抽吸术的抽吸物,使用酶消化法获取成熟脂肪细胞.采用天花板贴壁法培养.取第3代细胞进行实验.体外实验:成脂、成软骨和成骨诱导培养,并分别采用油红"O"染色、阿尔辛蓝染色和茜素红染色法鉴定.体内实验:实验组(n=6):取第3代细胞使用荧光染料Dil标记,与纤维蛋白胶混合后注射于裸鼠背部一侧皮下,8周后,从大体观察、组织学、油红"O"染色及荧光显微镜观察新生物形成情况;对照组(n=6):以空白的纤维蛋白胶注射于同一裸鼠背部另一侧皮下,于同一时间点进行检测.结果 成熟脂肪细胞呈单房圆形,经天花板贴壁法培养后变为长梭形成纤维细胞状,即去分化脂肪细胞.去分化脂肪细胞在定向诱导培养下能够分别成脂、成软骨及成骨分化.体内实验中实验组8周后在裸鼠背部皮下有新生组织块形成,经检测后证实其为成熟脂肪块井来源于植入的去分化脂肪细胞,对照组无新生组织形成,纤维蛋白胶被降解吸收.结论 成熟脂肪细胞可通过体外培养实现去分化,去分化脂肪细胞具有成脂、成软骨和成骨等多向分化能力,以去分化脂肪细胞为种子细胞可在裸鼠皮下构建出脂肪组织.     

缺氧对成熟脂肪细胞去分化影响的实验研究

目的 研究缺氧环境下成熟脂肪细胞体外培养的形态学变化,探讨缺氧环境对成熟脂肪细胞去分化的影响.方法 从成人吸脂术后抽吸物提取脂肪组织来源的干细胞,诱导为成熟脂肪细胞,在缺血缺氧的环境下培养.观察各时间段细胞的形态变化.结果 由脂肪组织来源的干细胞诱导而成的成熟脂肪细胞,在缺氧环境培养数日后,细胞从圆形变为可持续分裂的成纤维细胞状细胞.结论 成熟的脂肪细胞在一定条件下可以去分化为成纤维细胞状细胞.     

TNF-α抑制成熟3T3-L1脂肪细胞分泌RBP4

目的:观察肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对体外培养的成熟3T3-L1脂肪细胞分泌视黄醛结合蛋白4(Rtinol BindingProtein 4,RBP4)的影响.方法:体外培养3T3-L1细胞,待细胞完全融合后两天进行诱导分化为成熟脂肪细胞,应用不同浓度的重组TNF-α干预,采用放射免疫分析法检测干预后不同时间成熟脂肪细胞RBP4的分泌量.结果:(1)不同浓度TNF-α(0.2、1.0、5.0、10ng/ml)对脂肪细胞RBP4的分泌均有抑制作用,其抑制效应呈剂量依赖性:随着TNF-α浓度的增加,RBP4水平降低越加明显.(2)各实验组随着干预时间延长,RBP4虽有降低之趋势,但组内各时间点差异无统计学差异.(3)二元回归分析提示TNF-α对RBP4有影响.结论:TNF-α能抑制成熟脂肪细胞RBP4的分泌,其抑制效应有剂量依赖性,而与干预时间无关.     

染料木苷对3T3-L1脂肪细胞分化以及AMPK磷酸化的影响

目的观察染料木苷(Genistin,GIN)对3T3-L1前脂肪细胞细胞分化以及分化过程中腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)磷酸化程度的影响。方法用激素鸡尾酒法诱导3T3-L1前脂肪细胞分化,用MTT法观察GIN对细胞生存率的影响,以油红O染色法镜下观察3T3-L1前脂肪细胞分化的情况,并通过比色分析法检测GIN对细胞内脂滴堆积量的影响;用Western blotting方法分别检测对照组和给药组细胞分化过程中细胞中AMPK,P-AMPK(Thr172)蛋白表达量,借以计算AMPK磷酸化比率。结果分化诱导后,对照组脂肪细胞呈典型的成熟脂肪细胞表型,形成"戒指环"结构,经100μM GIN干预后,脂滴数量减少,体积减小,通过比色分析法量化后显示100μM GIN可减少胞内脂质的堆积(P<0.05)。与对照组相比,给药组从第4天开始上调p-AMPK(Thr172)/AMPK比率,并持续到第10天(P<0.05)。结论 GIN可通过激活AMPK抑制3T3-L1脂肪细胞分化。     

重组蛋白转导域-神经肽Y融合蛋白对体外培养大鼠脂肪细胞的影响

目的 探讨重组蛋白转导域-神经肽Y融合蛋白对体外培养大鼠脂肪细胞的影响.方法 采用剪切消化法分离大鼠前脂肪细胞,培养液中添加重组PTD-NPY融合蛋白,检测前脂肪细胞和成熟脂肪细胞的形态学变化、细胞中甘油三酯含量和甘油磷酸脱氢酶(GPDH)活性.结果 重组PTD-NPY融合蛋白处理大鼠前脂肪细胞72 h,细胞体积增大,细胞数量增加,细胞甘油三酯含量和GPDH活性升高;重组PTD-NPY融合蛋白处理成熟脂肪细胞48h后,细胞体积明显增大,细胞内脂肪滴数量增加并融合成较大的脂滴,甘油三酯含量和GPDH活性均显著升高.结论 重组PTD-NPY融合蛋白明显促进前脂肪细胞的分化,促进脂肪细胞中甘油三酯的合成与沉积.为重组PTD-NPY融合蛋白在动物生产及人类疾病治疗中的实际应用奠定理论基础.     

去分化脂肪细胞多向分化潜能与应用

去分化脂肪细胞(DFAT cells)来源于成熟脂肪细胞,且具有多向分化潜能,其特征类似于干细胞的一种细胞.在体外可通过天花板培养法提取出DFAT细胞,经过诱导后,DFAT细胞可向脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、内皮细胞、肌细胞、神经细胞等分化.因此,DFAT细胞是一种在组织工程和干细胞治疗中很好的潜在资源,从而广泛应用于多种疾病及组织损伤修复的研究当中.     

罗格列酮和白细胞介素-6对3T3-L1脂肪细胞chemerin mRNA表达的影响

目的 观察罗格列酮和白细胞介素-6(IL-6)对3T3-L1脂肪细胞chemerin mRNA表达的影响.方法 体外培养3T3-L1前体脂肪细胞并诱导其分化成熟,分别以不同浓度的罗格列酮和(或)IL-6干预,在不同的时间段提取细胞总RNA,采用RT-PCR技术检测细胞中chemerin mRNA的表达水平.结果 IL-6作用于分化成熟的3T3-L1脂肪细胞能下调chemerin mRNA的表达,且用罗格列酮预处理或与IL-6共同作能够改善IL-6对chemerin RNA的抑制作用.结论 IL-6对chemerin mRNA表达的负调控可能是其引起胰岛素抵抗和糖脂代谢紊乱的机制之一,chemerin可能是噻唑烷二酮(TZD)类药物改善胰岛素敏感性的靶基因.     

甲状腺相关眼病患者眼眶前脂肪细胞的培养及分化

[目的]研究甲状腺相关眼病患者(TAO)眼眶组织中是否存在前脂肪细胞,在一定条件下能否分化为成熟脂肪细胞,探讨脂肪细胞在TAO发病中的作用.[方法]选用TAO患者眼眶中的脂肪颗粒,共8例(8只眼),采用组织块培养法培养细胞,观察细胞形态;细胞免疫组织化学方法检测前脂肪细胞因子-1的表达,初步验证前脂肪细胞的存在;诱导细胞向成熟脂肪细胞分化,油红O染色观察细胞形态及细胞内脂滴形成情况;RT-PCR检测分化过程中转录因子过氧化物酶体增殖体激活受体γ(PPARγ)表达的改变.[结果]原代培养细胞为梭形,增殖旺盛;免疫组化显示前脂肪细胞因子-1表达阳性;细胞可分化为成熟脂肪细胞,并伴有PPARγ基因表达的增强.[结论]TAO患者眼眶组织中存在着功能活跃的前脂肪细胞;进一步验证了脂肪细胞数量的增加在TAO发病中的重要作用.     

平目汤含药血清对人Graves眼病眼眶脂肪细胞增殖及凋亡的影响

目的:研究平目汤含药血清对前脂肪细胞及成熟脂肪细胞的作用,探讨其治疗Graves眼病的机制。方法:采用组织块法将人Graves眼病眼眶前脂肪细胞原代培养并传代,选用间接免疫荧光技术鉴定;用平目汤药液灌胃SD大鼠制备平目汤含药血清,并配成低(5%)、中(10%)、高(20%)三个剂量组;油红O染色观察前脂肪细胞的诱导分化作用;MTT法检测平目汤对前脂肪细胞增殖的影响;流式细胞术检测平目汤对成熟脂肪细胞凋亡率的影响。结果:(1)通过组织块法成功培养出梭形细胞,间接免疫荧光检测为前脂肪细胞。(2)成功诱导前脂肪细胞分化,油红O染色证实为成熟脂肪细胞。(3)平目汤各组均可显著抑制前脂肪细胞的分化,与空白对照组及地塞米松组比较差异明显。(4)平目汤各组均可下调前脂肪细胞增殖活性,以平目汤中剂量组、干预96 h效果最佳,组间比较差异有统计学意义(P0.05)。(5)平目汤各组成熟脂肪细胞凋亡率明显高于空白对照组(P0.05),以平目汤中剂量组效果最佳。结论:平目汤含药血清可抑制人Graves眼病眼眶前脂肪细胞增殖、促进眼眶成熟脂肪细胞凋亡、减少眼眶脂肪细胞的数量,从而减少眼眶脂肪容积、改善Graves突眼症状。     

Resistin基因在3T3-L1前体脂肪细胞诱导分化过程中表达水平的变化

目的：观察Resistin基因在3T3-L1脂肪细胞诱导分化过程中不同时段表达水平的变化。探讨Resistin基因与脂肪细胞分化、脂质积聚之间的关系。方法：体外培养3T3-L1前体脂肪细胞，在诱导其向成熟脂肪细胞分化的不同时段（第0～10天）．采用RT-PCR技术检测脂肪细胞中Resistin基因mRNA的表达水平。结果：①Resistin基因在3T3-L1前体脂肪细胞诱导分化初期（第0～2天）不表达，分化第3天开始表达，分化第4～6天Resistin基因的表达显著上调，分化第6～10天Resistin基因的表达保持在较高水平并趋于稳定；②Resistin基因的表达水平除在诱导分化第3～4天、第6～10天内差异无显著性（P〉0．05）外，其余各时段间表达水平差异均有显著性（P〈0.01）。结论：Resistin基因可能参与了脂肪细胞分化的中晚期过程，在3T3-LI脂肪细胞分化过程中表达逐渐上调，其表达变化与脂肪细胞分化、脂质积聚过程相一致。     

TNF-α与PGC-1α影响成熟脂肪细胞分泌RBP4的研究

目的观察过氧化物酶增殖体激活受体辅激动子1α（PGC-1α）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及两者联合对体外培养的成熟3T3-L1脂肪细胞分泌视黄醇结合蛋白4（RBP4）的影响。方法体外培养3T3-L1细胞,待细胞完全融合后两天,诱导分化为成熟脂肪细胞,使用重组PGC-1α腺病毒,对照病毒,以及重组TNF-α（10ng/ml）,TNF-α联合PGC-1α腺病毒干预,采用放射免疫分析法检测24小时后成熟脂肪细胞RBP4的分泌量。结果①各干预组均能导致成熟脂肪细胞RBP4分泌的降低。②对照病毒组和PGC-1α腺病毒组引起RBP4的降低,两组间差别无统计学意义。③TNF-α组和TNF-α联合PGC-1α腺病毒组两组减少脂肪细胞分泌RBP4,差别无统计学意义。④两含有TNF-α组和两病毒组对RBP4的影响有统计学差异。结论PGC-1α对成熟脂肪细胞分泌RBP4无影响,TNF-α能抑制成熟脂肪细胞RBP4的分泌,两者对RBP4分泌的影响无相互作用。     

人绒毛膜促性腺激素对3T3-L1脂肪细胞过氧化物酶增殖体激活受体γ及脂联素mRNA表达的影响

目的:探讨人绒毛膜促性腺激素(HCG)对3T3-L1脂肪细胞过氧化物酶增殖体激活受体γ(PPARγ)及脂联素mRNA表达的影响.方法:分别用50、500和5000 U/L HCG干预未分化脂肪细胞2、4和6 d,未用HCG干预为空白对照组,PT-PCR测定PPARγ mRNA的表达;用诱导分化液(1 μmol/L地塞米松+0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤+10 ng/L胰岛素)诱导3T3-L1脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞,油红O染色鉴定后用5000 U/L HCG干预成熟脂肪细胞6、12和24 h,未用HCG干预为空白对照组,用RT-PCR测定PPARγ及脂联素mRAN的表达情况.结果:不同剂量HCG干预未分化3T3-L1脂肪细胞,与空白对照组相比,不同剂量干预组未分化脂肪细胞PPARγ mRNA的表达量均增加,差异有统计学意义(F=19.823、21.352和23.519,P均<0.001);不同剂量HCG干预组组间比较,5000 U/L剂量干预组PPARγ的表达量较50和500 U/L剂量组增加,差异均有统计学意义(P均<0.05):50和500 U/L剂量组比较,PPARγ mRNA的表达量差异无统计学意义(P>0.05).5000 U/L HCG干预已分化3T3-L1脂肪细胞后,空白对照组、干预6、12和24 h组相比,脂肪细胞PPARγ mRNA的表达差异有统计学意义(F=26.907,P<0.001),脂联素mRNA的表达差异无统计学意义(F=0.066,P=0.976).结论:HCG可能促进313-L1脂肪细胞的分化,但对脂联素的分泌无影响.     

TNF-α对未分化及成熟3T3-L1脂肪细胞中TSG-6基因表达的调节作用

目的：探讨TNF-α对未分化及成熟3T3-L1脂肪细胞中TSG-6基因(tumor necrosis factor alpha-stimulated gene-6)表达水平的调节作用.方法：体外培养3T3-L1脂肪细胞．在3T3-L1细胞生长至完全融合后2天(第0天)或细胞诱导分化的第10天,应用重组TNF-α(0．1、1．0、10．0ng／ml)干预未分化(第0天)或已分化成熟(第10天)的脂肪细胞,采刖RT-PCR技术检测干预后不同时间(0、0．5、2．0、6、0、12、0、24．0h)脂肪细胞中TSG-6基因的表达水平。结果：①不同浓度TNF-α对未分化脂肪细胞中TSG-6基因的表达水平均具抑制作用。TNF-α浓度0.1ng/ml时,TSG-6基因表达水平2h内下降67．30%,24h时下降76．05%;TNF-α浓度1．0ng／ml时,TSG-6基因表达水平0．5h内下降52.79％,24h时下降99.20％：TNF-α浓度10．0ng／ml时,TSG-6基因表达水平0．5h内下降96．14％,其表达几乎被完全抑制：②不同浓度TNF-α均能显著抑制成熟脂肪细胞中TSG-6基因的表达。TNF-α浓度0.1ng／ml时,TSG-6基因表达水平6h内下降33．73％,12h内下降97.39％;TNF-α浓度1.0ng／ml时,TSG-6基因表达水平6h内下降78．68%,并持续至24h;TNF-α浓度10.0ng／ml时,TSG-6基因表达水平2h内下降96．27％．TSG-6基因的表达几乎被完全抑制。结论：TNF-α对脂肪细胞中TSG-6基因表达具有抑制作用．其抑制效应总体趋势上呈现剂量和时间依赖性特征．     

PPARγ配体罗格列酮和GW9662对3T3-L1脂肪细胞内脏脂肪素mRNA表达的影响

目的观察PPARγ配体罗格列酮和GW9662对3T3-L1脂肪细胞内脏脂肪素(visfatin)mRNA表达的影响,观察GW9662能否拮抗罗格列酮对visfatin的作用,以探讨PPARγ与visfatin的关系。方法体外培养3T3-L1前脂肪细胞并诱导其分化成熟,分别以不同浓度的罗格列酮和GW9662干预,在不同的时间段提取细胞总RNA,用RT-PCR技术检测visfatin mRNA的表达水平,以确定二者单独作用时的最佳剂量及时间。再将分化成熟的3T3-L1脂肪细胞随机分为4组:对照组:不加任何干预剂;罗格列酮组:单独加入罗格列酮;GW9662组:单独加入GW9662;罗格列酮+GW9662组:同时加入罗格列酮和GW9662共同作用;以上各组药物均使用最佳剂量,作用最佳时间后观察visfatin mRNA的表达。结果罗格列酮或GW9662单独干预分化成熟的3T3-L1脂肪细胞,visfatin mRNA的表达水平均低于空白对照组,且当罗格列酮浓度达10μmol/L或以上、GW9662浓度达5μmol/L或以上时,其表达差异有统计学意义。用罗格列酮+GW9662共同干预分化成熟的3T3-L1脂肪细胞,vi...     

改进的“天花板”组织块培养法与消化培养法培养前脂肪细胞的对比研究

目的:对比改进的天花板组织块培养法与消化培养法培养前脂肪细胞的优劣。方法:两种方法获得的前脂肪细胞,培养3天,显微镜下检测自分化情况,MTT、流式细胞仪检测其增殖情况和细胞周期。培养9天,绘制生长曲线。使用含胰岛素、甲状腺素T3和转铁蛋白(ITT)的无血清培养基诱导获得的前脂肪细胞5天,拍照测细胞直径,油红染色法检测其分化情况。结果:改进的天花板组织块培养法培养的第一代自分化存在,但是发生自分化的细胞很少。增殖和分化结果均无显著性差异。但是此法在同等情况下获得细胞较多,所需经费较少。结论:与消化培养法相比较而言,改进的天花板组织块培养法是一种更加简单、经济的获得大鼠前脂肪细胞的方法。     

白细胞介素-6和罗格列酮对3T3-L1脂肪细胞Vaspin mRNA表达的影响

目的 观察罗格列酮和白细胞介素-6(IL-6)对3T3L-1脂肪细胞Vaspin mRNA表达的影响.方法 体外培养3T3L-1前体脂肪细胞并诱导其分化成熟,分别以不同浓度的罗格列酮和(或)IL-6干预,在不同时间段提取细胞总RNA,采用RT-PCR技术检测细胞中Vaspin mRNA的表达水平.结果 IL-6和罗格列酮分别作用于分化成熟的3T3L-1脂肪细胞,IL-6对Vaspin mRNA的表达无影响,而罗格列酮能上调Vaspin mRNA的表达,用IL-6和罗格列酮共同作用于细胞,则罗格列酮对Vaspin mRNA表达的上调作用未受到显著影响.结论 IL-6对Vaspin mRNA表达无明显的调控作用,表明Vaspin基因可能不是IL-6致胰岛素抵抗的位点.罗格列酮能上调Vaspin mRNA的表达,说明Vaspin可能是噻唑烷二酮(TZD)类药物改善胰岛素敏感性的靶基因.     

附子多糖对胰岛素抵抗脂肪细胞模型GLUT4蛋白表达和转位的影响

目的研究附子多糖对胰岛素抵抗脂肪细胞模型葡萄糖转运4(GLUT4)蛋白表达和转位的影响。方法将3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为成熟的脂肪细胞,用高糖和高胰岛素联合诱导培养脂肪细胞,造成胰岛素抵抗脂肪细胞模型,实验设对照(CON)组、模型(MOD)组、附子多糖(FPS)组、罗格列酮(ROS)组,干预培养24 h,收集细胞,提取全细胞蛋白及细胞外膜蛋白,SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳后,通过Western blot方法检测各组全细胞蛋白及细胞外膜蛋白中GLUT4的含量。结果各组对GLUT4表达差异无统计学意义(P0.05)。模型组转位显著降低,仅为正常脂肪细胞的30.4%,以模型组转位量为基值,各组分别与之相比计算GLUT4蛋白的相对定量,附子多糖组、罗格列酮组分别使GLUT4蛋白转位增加164%、301%,与模型组比较差异有统计学意义(P0.01),附子多糖组显著低于罗格列酮组(P0.01)。结论附子多糖对胰岛素抵抗脂肪细胞模型全细胞GLUT4蛋白表达无影响,但可促进其转位,其促进胰岛素抵抗脂肪细胞对葡萄糖的摄取可能与这一机理有关。     

小鼠前脂肪细胞分化过程中STAU1介导Foxp1 mRNA降解机制初探

目的 探究小鼠前脂肪细胞分化过程中STAU1对Foxp1 mRNA转录后的调控作用。方法 培养3T3-L1前脂肪细胞，采用鸡尾酒法诱导其分化为成熟脂肪细胞，分别收取第0天和第4天样本进行RNA测序筛选出差异倍数(FC)>2的转录因子；提取第0、1、2、3、4天细胞总RNA进行实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)实验验证。RBPDB数据库预测Foxp1的RNA结合蛋白。转染空载体质粒和STAU1过表达质粒后将细胞分为对照组和STAU1过表达组，提取第0、12、24、36、48小时细胞总RNA。利用RT-qPCR及Western-Blot实验检测两组3T3-L1细胞STAU1过表达效率、分化过程中Foxp1的mRNA和蛋白质表达水平。10只雄性2～3周龄C57BL/6小鼠的腹股沟白色脂肪组织(inguinal white adipose tissue, iWAT)分离培养的血管基质部分(Stromal vascular fraction, SVF)细胞，鸡尾酒法诱导分化，感染慢病毒，利用免疫荧光实验检测SVF细胞中Foxp1的蛋白质表达水平，用catRAPID软件进行预测。R...     

甲状腺相关眼病患者眼眶前脂肪细胞的培养及分化

【目的】研究甲状腺相关眼病患者(TAO)眼眶组织中是否存在前脂肪细胞，在一定条件下能否分化为成熟脂肪细胞，探讨脂肪细胞在TAO发病中的作用。【方法】选用TAO患者眼眶中的脂肪颗粒，共8例(8只眼)，采用组织块培养法培养细胞，观察细胞形态；细胞免疫组织化学方法检测前脂肪细胞因子-1的表达，初步验证前脂肪细胞的存在；诱导细胞向成熟脂肪细胞分化，油红O染色观察细胞形态及细胞内脂滴形成情况；RT-PCR检测分化过程中转录因子过氧化物酶体增殖体激活受体γ(PPARγ)表达的改变。【结果】原代培养细胞为梭形，增殖旺盛；免疫组化显示前脂肪细胞因子-1表达阳性；细胞可分化为成熟脂肪细胞，并伴有PPARγ基因表达的增强。【结论】TAO患者眼眶组织中存在着功能活跃的前脂肪细胞；进一步验证了脂肪细胞数量的增加在TAO发病中的重要作用。