黄连内生真菌抑乙酰胆碱酯酶活性菌株的筛选及鉴定

目的 从黄连(Coptis chinensis)植株内分离筛选具有较高乙酰胆碱酯酶抑制活性的内生真菌，并对筛选出的强抑制活性菌株进行菌种分类及鉴定，为阿尔茨海默病新药的研发提供潜在的菌种资源。方法 采用改良Ellman法对黄连植株内分离获得的内生真菌菌株进行乙酰胆碱酯酶抑制活性测定，对筛选的活性较强菌株，根据菌株的形态学特征结合分子生物学方法进行菌种鉴定。结果 在黄连根、茎和叶部共分离获得24株内生真菌，有9株对乙酰胆碱酯酶有抑制活性。活性菌株中SCLH12抑制活性较强，经初步鉴定该菌株为枝孢菌属的Cladosporium tenuissimum。结论 从黄连根部筛选分离出乙酰胆碱酯酶抑制活性菌株，其中菌株SCLH12(Cladosporium tenuissimum)具有较强乙酰胆碱酯酶抑制活性，可为开发新的乙酰胆碱酯酶抑制剂(AChEI)奠定基础。     

茅尾海桐花树根际土壤来源几丁质降解菌株多样性及抗植物真菌活性的研究

摘要：目的 以胶体几丁质为唯一碳源的培养基,从广西茅尾海红树林桐花树根际土壤中分离几丁质降解菌株,并应用复 筛培养基筛选产几丁质酶菌株,结合平板对峙法挖掘能高效抑制植物病原真菌生长的活性菌株,为红树林来源微生物农用生物 防治药物的研发奠定基础。方法 采用平板稀释涂布法和划线法分离纯化菌株,并应用复筛培养基通过透明圈观察法检测菌株 几丁质酶活;采用Chelex-100法提取菌株基因组DNA,通过PCR扩增菌株的16S rRNA基因序列,上传至EzBioCloud数据库进行 在线比对;采用平板对峙法筛选抗植物病原真菌的活性菌株;采用PKS和NRPS基因的扩增引物分别检测基因组聚酮合酶基因与 非核糖体肽合成酶基因。结果 从桐花树根际土壤中分离获得28株几丁质降解菌,隶属于10目10科17属;其中5株几丁质降解 菌对4种植物病原真菌均显示出抑菌活性,抑菌活性阳性率为17.86%;并在17株几丁质降解菌中检测到抗生素生物合成基因。 结论 广西茅尾海红树林桐花树根际土壤来源的细菌及放线菌是重要的几丁质酶菌种资源,它们在抗植物病原真菌方面表现出 良好的应用潜力,在新型绿色海洋生物农药、新颖结构海洋药物及其他高赋值产品开发和利用方面具有应用前景。     

乙酰胆碱酯酶活性筛选模型对蛇足石杉内生真菌的筛选研究

目的建立乙酰胆碱酯酶活性筛选模型,并筛选对乙酰胆碱酯酶有抑制活性的蛇足石杉内生真菌菌株;方法通过建立并优化乙酰胆碱酯酶活性筛选模型相关条件,建立乙酰胆碱酯酶活性筛选模型,然后将60株从蛇足石杉分离到的内生真菌用该模型筛选;结果从中筛选到19株对乙酰胆碱酯酶抑制率超过50%的蛇足石杉内生真菌。结论乙酰胆碱脂酶筛选模型可作为寻找具有乙酰胆碱酯酶抑制作用的药用资源的有效手段。     

水仙内生真菌乙酰胆碱酯酶抑制活性菌株的筛选及鉴定

目的 从药用植物水仙中分离、筛选对乙酰胆碱酯酶(AChE)具较高抑制活性的菌株并确定其分类归属.方法 采用组织切块法对水仙内生真菌进行分离纯化,纯化后的菌株发酵培养,用乙酸乙酯萃取发酵液,以改良的Ellman方法进行AChE抑制活性的筛选,对获得的阳性菌株SX-S101进行形态学观察,用分子生物学方法鉴定其分类地位.结果 从水仙的根、鳞茎中共分离到18株内生真菌,活性检测筛选出3株对AChE具较强抑制作用的菌株,其IC50分别为0.4562、0.3897、0.4122 g·L-1;对SX-S101进行分类鉴定,确定其为子囊菌纲(Ascomycetes) 喙枝孢属(Rhinocladiella)菌株Rhinocladiella sp.LA60.结论 首次从水仙内生真菌中筛选出了1株AChE抑制活性较高的菌株Rhinocladiella sp.LA60,为后续开发阿尔采末症治疗药物提供依据.     

两株红树林根际土壤放线菌的鉴定和抗菌活性研究

目的对分离自广西北仑河口红树林根际土壤的两株放线菌(B200、B205)进行抗菌活性研究及鉴定。方法观察两株放线菌的形态特征;通过PCR扩增、测定并比对16S rRNA基因序列,采用邻接法构建系统发育树并进行分析;通过液体发酵、萃取等方法,分别获得发酵液水相、发酵液酯相和菌丝丙酮浸提液三类样品;样品通过纸片扩散法进行抗菌活性测定。结果从红树林根际土壤分离的两株放线菌,其发酵液具有较强的广谱抗菌活性,菌株的16S rRNA基因序列对比结果显示,菌株B200和B205分别与有效发表菌株Agromyces subbeticus DSM16689~T的相似率为98.01%和Micromonospora rosaria DSM 803~T的相似率为99.73%,菌株B200可能为壤霉菌属潜在新种,B205初步鉴定是小单孢菌Micromonospora rosaria DSM 803~T的变种。结论分离自广西北仑河口红树林根际土壤的两株放线菌其次级代谢产物有较强抗菌活性,具有从中发现新抗生素的潜力。     

半红树植物海芒果内生与根际细菌多样性及抗农用真菌活性研究

摘要：勘探半红树植物海芒果内生和根际细菌多样性,挖掘具有高效广谱抗农用真菌活性菌株。以7种植物病原真菌为指示菌,采用平板对峙法对海芒果组织和根际中分离到的细菌进行抑菌活性筛选,并对活性菌株的基因组DNA进行聚酮合酶(PKS)基因与非核糖体肽合成酶(NRPSs)基因的扩增及检测。从海芒果组织和根际中共分离到454株细菌,隶属于35属71种,从中筛选出15株细菌在至少1个抗菌活性检测中显示阳性,总阳性率为21.13%,其中6株细菌对多种指示菌均有抑制活性;且15株活性菌株的基因组DNA均扩增出至少1种次级代谢产物合成基因。综上所述,广西山口红树林自然保护区内半红树植物海芒果内生和根际细菌具有丰富物种多样性、抗农用真菌活性及合成聚酮类和非核糖体肽类化合物的潜能。     

中国东海及东太平洋海山区来源抗菌活性海洋微生物的筛选研究

摘要：目的 研究中国东海及东太平洋区域来源微生物的抗菌活性,意在筛选具有良好抗菌活性的海洋微生物,并初步研究活性菌株代谢产物的结构,为探求新型抗生素提供基础。方法 以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌为指示菌株,采用牛津杯法进行抗菌活性微生物初筛和复筛。通过HPLC-DAD结合TLC对活性突出的4株真菌及1株细菌进行活性提取物指纹图谱分析。对广谱抗菌活性菌株WBX-38进行菌种鉴定及活性代谢产物分离纯化,利用核磁共振和质谱等手段对活性化合物进行结构鉴定。采用微量稀释法测定活性化合物的最小抑菌浓度（MIC）。结果与结论 从中国东海及东太平洋来源样品中共筛选90株海洋来源菌株,获得抗菌活性菌株16株,4株为海洋细菌,12株为海洋真菌。通过HPLC-DAD结合TLC分析,发现5株活性菌株均具有独特的色谱行为。海洋真菌WBX-38通过菌种鉴定,确认为海洋来源曲霉（Aspergillus sp.）。从其发酵液提取物中分离获得1个活性化合物5-hydroxymethylfuran-3-carboxylic acid,该化合物对3种指示菌均具有一定生长抑制活性。     

泰山白首乌根际土壤真菌分离纯化及抗菌活性研究

摘要：目的 从泰山白首乌根际土壤中分离筛选优良真菌菌株,并从中分离鉴定具有抗菌活性的活性化合物。方法 采用梯度 稀释平板划线法,从泰山白首乌根际泥样中分离真菌;以活性为导向,采用正/反相硅胶及半制备高效液相色谱方法对次级代谢产物进 行单体化合物分离纯化,通过质谱和核磁共振等波谱方法确证活性化合物结构。结果 从采集的3个样品中共分离得到83株真菌,其 中筛选获得具有抑金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌活性的菌株7株,并从黑曲霉SDFMU-45菌株的次级代谢产物中分离鉴定两个萘并吡喃 酮类化合物 rubrofusarin B(1)和fonsecin B(2)。结论 对化合物1和2进行了抑菌活性测试,结果显示化合物1和2对金黄色葡萄球菌标准 菌株的MIC值分别为250和187μg/mL,对大肠埃希菌标准菌株的MIC值分别为2.89和620μg/mL。     

海洋真菌Aspergillus sp. SCS-KFD03化学成分研究

目的 对海洋真菌Aspergillus sp. SCS-KFD03的发酵液中化学成分进行分离鉴定,并测定其生物活性。 方法 采用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱和高效液相色谱等技术进行分离纯化,运用各种波谱方法对分离所得化合物进行结构鉴定,并测定化合物乙酰胆碱酯酶和α-糖苷酶抑制活性。结果 分离鉴定了9个化合物,经鉴定为phomaligol A1（1）、5-（乙酰氧基甲基）呋喃-3-酸（2）、 phomapyrone C（3）、4-羟基异苯并呋喃-1(3H)-酮（4）、penicillivinacine（5）、22(E)-5α,8α-epidioxyergosta-6,22-dien-3β-ol（6）、lucidal（7）、dankasterone A（8）、bis-(2-methylheptyl)-phthalate（9）,其中化合物4为新天然产物。化合物5、6、7和9具有较弱的乙酰胆碱酯酶抑制的活性,化合物5具有强于阳性药阿卡波糖的α-糖苷酶抑制活性,8和9的α-糖苷酶抑制活性与阳性药相当。结论 化合物1~9均为首次从海洋曲霉属真菌Aspergillus sp. SCS-KFD03中分离得到,部分化合物具有乙酰胆碱酯酶和α-糖苷酶的抑制活性。     

红树林放线菌抗沃柑病原真菌的研究

摘要：目的 分离鉴定沃柑叶斑病害中的病原真菌,并从广西红树林来源放线菌中筛选高效抑制病原真菌的菌株,为开展沃柑真菌病害的防治奠定基础。方法 采用组织分离法对病原真菌进行分离和纯化培养,通过形态学、ITS基因序列分析及构建系统发育树相结合的方法对病原真菌进行鉴定,并按照柯赫氏法则对健康沃柑叶片进行回接验证。采用平板对峙法对24株红树林放线菌进行抑菌活性初筛,并检测活性菌株发酵产物的抗菌活性及防病害效果。通过antiSMASH对目标菌株的基因组序列进行分析,预测其合成次级代谢产物的能力。结果 从沃柑叶斑病害中分离出4种植物病原真菌,其中大豆茎点霉(Boeremia exigua)和腐皮镰刀菌(Fusarium solani)可导致沃柑叶片出现叶斑病症;从24株放线菌中筛选到1株链霉菌M2020,其对4种病原真菌C1~C4表现出很好的抑菌活性,且其发酵产物在沃柑真菌病害(真菌C4侵染)防治试验中效果显著;菌株M2020基因组中含有38个负责聚酮类、非核糖体多肽类和萜烯类等次级代谢产物生物合成的基因簇。结论 致使沃柑出现叶斑病症的病原真菌至少有大豆茎点霉和腐皮镰刀菌,链霉菌M2020具有防治沃柑叶斑病害的潜力。     

乌头根腐病根际拮抗细菌筛选与鉴定

目的：筛选一株对乌头根腐病病原镰刀菌具有拮抗效果的根际细菌。方法：以四川省绵阳市江油乌头栽培基地的健康乌头根际土壤和实验室保留的三株乌头根腐病病原镰刀菌：茄腐镰刀菌(Fusarium solani)、尖孢镰刀菌(F. oxysporum)和层出镰刀菌(F. proliferatum)为供试材料,利用平板对峙方法筛选对三株病原镰刀菌具有拮抗活性的根际细菌,并利用16S rDNA分子鉴定方法确定筛选菌株的属种。结果：从根际土壤中筛选得到对三株病原镰刀菌均有拮抗活性,且活性较强的根际细菌仅有6株,其中A3-18菌株对三株病原镰刀菌的抑制率分别为54.21±2.14、68.35±1.27和53.05±2.45,均大于50%,故挑选A3-18菌株作后续实验分析,发现随着时间增长,A3-18菌株抑制效果也逐步增强,对尖孢镰刀菌的抑制效果尤为显著。A3-18菌株经16S rDNA分子鉴定确定为芽孢杆菌属Bacillus spp.菌株。结论：经平板对峙及分子鉴定,确定对三株乌头根腐病病原镰刀菌具有较好拮抗活性的根际细菌为芽孢杆菌属菌株。     

闽浙马尾杉内生真菌分离纯化及产石杉碱甲菌株LC-MS／MS筛选

目的通过组织块分离法从闽浙马尾杉中分离内生真菌,利用LC-MS／MS筛选产石杉碱甲的内生真菌。方法将采集到的新鲜植物闽浙马尾杉进行表面灭菌消毒及将植物的根际土壤稀释,接种于含有3％的链霉素的PDA平板培养基上,挑取尖端菌丝进行分离、纯化和保藏;通过石杉碱甲菌株LC-MS／MS法对分离到的内生真菌进行快速的筛选,筛选出产石杉碱甲的内生真菌。结论通过组织块及稀释平板法从闽浙马尾杉植物中分离到306株内生真菌,其中根（G）8株,茎（J）65株,叶（Y）173株,茎尖（M）60株。通过LC-MS／MS筛选法共筛选到产石杉碱甲菌株15株,其中根（c）o株,茎（J）2株,叶（Y）11株,茎尖（M）2株。     

微生物来源的乙酰胆碱酯酶抑制剂F99-909A的研究

研究利用丁酰硫代胆碱和二硫二硝基苯甲酸为底物和显色剂，建立一种精确、快速的高通量筛选微生物代谢产物来源的乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂的体外筛选模型。利用此方法从2300株真菌中筛选到一株阳性菌株F99-909．该菌株的发酵液经有机溶剂提取、ODS柱层析及HPLC制备分离，得到一个活性化合物F99-909A，该化合物对乙酰胆碱酯酶的IC50为9．5μmol／L。通过对该化合物的紫外、红外、质谱、核磁等理化分析，得知该化合物与已知化合物radiclonic acid结构相同。但该化合物对Ache的抑制活性至今未见报道。     

海洋微生物产抑真菌、抑肿瘤次生代谢产物的初步研究

从海洋环境中分离得到402株海洋真菌，1032株海洋细菌，利用稻瘟霉96孔板筛选模型对其无细胞滤液进行生物活性筛选，经过初筛和复筛得到活性强的菌株45株，其中海洋真菌13株、海洋细菌32株。选择了3株活性最强的海洋细菌测试了其菌株产生活性物质的遗传和热稳定性，并选择出适宜的人工培养基。     

一株红树林链霉菌所产抑菌活性化合物的分离及其生物合成基因簇的研究

摘要：目的 分离鉴定一株红树林来源具有拮抗真菌活性的链霉菌MCCG 2008,分析其对植物病原真菌香蕉尖孢镰刀 菌热带4号小种(Fusarium oxysporum f.sp. cubense tropical race 4)、苹果链格孢菌(Alternaria alstroemeriae)、珍珠李葡萄座腔菌 (Botryosphaeria dothidea)和芒果炭疽菌(Colletotrichum fructicola)的抑制作用,对其所产的抑菌活性化合物进行了分离纯化,并 通过基因扩增测序分析与活性化合物生产相关的生物合成基因簇,为进一步调控活性化合物的生产以及结构优化提供依据。方 法 通过形态观察、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析对MCCG 2008进行初步鉴定;通过发酵液原液、发酵液乙酸乙酯粗 提取物和菌丝体丙酮浸提物针对不同植物病原真菌进行了活性测试与效用组成分析;采用液液萃取和柱色谱分离该菌株所产生 的具有抑菌活性的次级代谢产物,通过高效液相色谱质谱联用仪和核磁共振仪对活性化合物结构进行解析;设计引物使用PCR 扩增该菌中与活性化合物生物合成相关的基因。结果 菌株MCCG 2008可形成茂盛的气生菌丝,并产生黄色的可扩散色素, 16S rRNA基因序列系统发育分析显示菌株MCCG 2008与微小链霉菌Streptomyces parvulus NBRC 13193T的相似度为100%;在拮 抗活性试验中,菌株MCCG 2008对珍珠李葡萄座腔菌的抑制活性最强,抑制率为48.0%,其发酵液乙酸乙酯粗提物和菌丝体丙 酮浸提物仅对香蕉尖孢镰刀菌热带4号小种有抑制活性;质谱(MS)和核磁(1H NMR)数据分析表明从菌株MCCG 2008的发酵液中 分离得到的活性化合物为放线菌素D;以放线菌素D生产菌为参照,通过序列比对发现MCCG 2008中的同源序列,并通过PCR 扩增获得菌株MCCG 2008基因组中与放线菌素D生物合成相关的基因。结论 分离自广西红树林根际土壤的链霉菌MCCG 2008 初步鉴定为微小链霉菌,其具有拮抗植物病原真菌的生防潜力,所产的活性化合物为放线菌素D。     

广西北仑河口红树林植物根际淤泥放线菌的分离、鉴定、多样性及抗菌活性研究

从红树林根际淤泥中分离鉴定放线菌并进行多样性分析及抗菌活性研究,为新抗生素的发现提供药用放线菌资源。方法 用6种分离培养基,利用涂布平板法分离放线菌;通过PCR扩增获得菌株16S rRNA基因并进行同源性比对,分析放线菌多样性;发酵液经处理分别形成发酵液酯相、发酵液水相和菌丝丙酮浸提液3类样品;纸片扩散法进行抗菌活性测试。结果 从5份红树林植物根际淤泥样品中分离纯化得到56株放线菌,分布于7个目7个科12个属,优势菌属为小单孢菌属和红球菌属;菌株L9T122、L1T1Jb1的16S rRNA基因序列与有效发表菌株Agromyces bracchium IFO 16238T(AB023359)、Streptomyces radiopugnans R97T(DQ912930)的相似率最高,分别为97.49%和97.07%,为潜在壤霉菌属和链霉菌属新种;抗菌活性检测结果表明,在20株放线菌中,15株具有抗菌活性,总阳性率为75.00%。其中L2T1Gb21、L9T122对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌均有较强的抑菌作用。结论 广西北仑河口红树林植物根际土壤中含有较为丰富的放线菌资源,菌株L2T1Gb21、L9T122有较强的抗菌活性,具有开发抗菌新药的潜力。     

变叶海棠内生真菌的分离,鉴定及活性测定

目的分离鉴定变叶海棠中内生真菌,并检验其抗病原真菌,抗肿瘤,抑制蛋白酶活性。方法传统形态学和现代分子生物学方法鉴定菌种,采用杯碟法,MTT法,和BRpNA法测试真菌活性。结果内生真菌按形态学归为26类,其中Non-sporulating(27.0%),Alternaria(18.0%),Cladosporlum(12.8%),Pestalotlopsis(7.6%),Fusarlum(6.2%),Aspergillus(6.2%),Cunninghamella(4.7%)是主要群落。通过对ITS rDNA测序,确定了有活性Non-sporulating的种属。活性测试结果显示15.6%的菌株对至少一种植物病原菌有活性,1.4%和2.4%的菌株分别具有细胞毒和蛋白酶抑制活性。结论变叶海棠内生真菌有很大的利用价值,本研究对其进行了首次系统的分离、鉴定和活性筛选工作。     

具有抗氧化活性的北五味子内生真菌的筛选及鉴定

目的:对具有抗氧化活性的北五味子内生真菌进行筛选及鉴定。方法:利用组织分离法,从野生北五味子的根、茎、叶及果实中分离内生真菌,分别采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除法及羟自由基清除法筛选具有抗氧化活性的内生真菌;并对菌株的总DNA进行提取,利用通用引物ITS1和ITS4对菌株18S r DNA ITS序列进行扩增和测序,将测序结果进行同源性比对分析,确定活性菌株的分类地位。结果:从北五味子中共分离得到23株内生真菌。其中,从根部分离出的编号为GSR-12的菌株表现出较强的抗氧化活性,其DPPH自由基清除率和羟自由基清除率分别为87.96%和82.31%;经比对分析后鉴定GSR-12为粉红粘帚霉(Clonostachys rosea)。结论:分离自野生北五味子根部的1株粉红粘帚霉具有较强的抗氧化活性。     

微生物来源的乙酰胆碱酯酶抑制剂N98-1021A的研究

本研究分别以丁酰硫代胆碱和二硫二硝基苯甲酸为底物和显色剂 ,建立了一种准确、快速的高通量筛选微生物代谢产物来源的抑制剂的体外筛选模型。利用此方法从 2 14 1株放线菌中筛选到一株阳性菌株N98 10 2 1,该菌株的发酵液经有机溶剂提取、ODS柱层析及HPLC制备分离 ,得到一个活性化合物N98 10 2 1A ,该化合物对乙酰胆碱酯酶的IC50 为 2 0 μmol/L ,经酶抑制动力学分析 ,该化合物为乙酰胆碱酯酶的非竞争性可逆抑制剂。通过对该化合物的紫外、红外、质谱、核磁等理化分析 ,得知该化合物与terferol结构相同。但该化合物对乙酰胆碱脂酶的抑制活性至今未见报道。     

海洋植物秋茄根中二萜类化合物及其抗妇科肿瘤活性的研究

目的分析秋茄根中的二萜化学成分并检测这些化合物的体外抗妇科肿瘤活性。方法利用多种色谱技术对秋茄根的不同提取物进行分离纯化,通过理化性质和现代波谱学技术对纯化后的二萜化合物结构进行鉴定,进一步利用MTT法检测它们的体外抗妇科肿瘤活性。结果从秋茄根的石油醚和乙酸乙酯部位分离得到3个二萜类化合物,鉴定为ent-8,15R-epoxypimaran-16-ol(Ⅰ)i、sopimar-7-en-15,16-diol(Ⅱ)和isopimar-8(14)-15,16-diol(Ⅲ)。对上述3个二萜类化合物的体外抗妇科肿瘤活性筛选结果显示,化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ具有明显的体外抗妇科肿瘤作用。结论来自于秋茄根的3个二萜类化合物具有明显的抑制妇科肿瘤细胞增殖活性。