Clec14a基因调控斑马鱼胚胎血管发育*

目的：探索Clec14a在斑马鱼胚胎期的表达及其在血管发育过程中的功能,探讨该基因调控血管发育机制。方法：通过胚胎整体原位杂交技术,观察Clec14a基因在斑马鱼胚胎期的表达情况;在转基因斑马鱼系Tg（kdrl:mCherry）和Tg（fli1a:nGFP）中,显微注射吗啉修饰的反义寡核苷酸（morpholinoantisense oligos）下调Clec14a基因表达,同时在转基因斑马鱼系Tg（kdrl:mCherry）中注射Clec14a-mRNA调控Clec14a基因表达,利用激光共聚焦显微镜观察分析斑马鱼节间血管（intersegment vessel,ISV）表型,统计分析内皮细胞迁移速度和数目的变化,并应用qRT-PCR技术检测下调后该基因mRNA表达情况。结果：在受精后24 h、48 h和72 h,Clec14a基因在斑马鱼脑、心脏、血管系统中有表达;Clec14a基因表达下调导致ISV发育缺陷,内皮细胞数目减少,抑制其迁移速度。结论：下调Clec14a基因表达能够通过抑制内皮细胞增殖和内皮细胞迁移调控斑马鱼胚胎血管发育。     

rpl15在斑马鱼胚胎中的表达形式探究

目的 探究rpl15基因在野生型斑马鱼胚胎中的表达形式.方法 利用NCBI和Ensemble数据库进行rpl15基因的共线性分析和Rpl15蛋白质序列相似性分析,使用MEGA X软件绘制进化树;构建pCS2+-rpl15重组质粒,再利用T3聚合酶制备地高辛标记的rpl15反义RNA探针,用全胚胎原位杂交检测rpl15基...     

利用斑马鱼胚胎进行发育毒理学研究的进展

斑马鱼作为一种水生模式动物,其取材方便、发育迅速、通体透明、体外可以发育、易于观察与操作的特点使之展现出独有的研究优势,目前已经广泛应用于发育毒理学研究领域。作者就斑马鱼胚胎用于血管、心脏和神经发育的毒理学研究现状和进展进行综述。     

HOXC4基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达

目的 探讨HOXC4基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的作用机制,从而为进一步研究其在造血发育中的功能奠定基础.方法 提取斑马鱼总RNA,利用RT-PCR克隆得到HOXC4基因片段,将克隆得到的基因片段和载体pCS2+用限制性内切酶BamHⅠ和Xho Ⅰ双酶切后,把基因片段插入pCS2+中,重组质粒经双酶切及测序鉴定后,采用T3 RNA聚合酶体外转录体系制备地高辛标记的HOXC4基因反义mRNA探针,然后行全胚胎原位杂交.结果 构建HOXC4-pCS2+重组质粒,获得地高辛标记的反义mRNA探针并且完成其在野生型斑马鱼中的全胚胎原位杂交,显示HOXC4基因在Tuebingen野生型斑马鱼神经系统高表达.结论 得到HOXC4基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的基本表达情况,为进一步研究该基因在造血发育过程中的功能奠定了基础.     

视黄酸影响斑马鱼胚胎心脏房室分化

目的观察外源性视黄酸对斑马鱼心脏前后轴发育即心脏房室分化的影响。方法采用化学遗传学方法在斑马鱼胚胎发育至12.5hpf(hours post fertilization)给予5×10-8mol/L和10-7mol/L外源性视黄酸处理1.5h。应用胚胎整体原位杂交观察视黄酸对心脏特异基因vmhc,amhc,nkx2.5和nppa表达的影响。结果vmhc,amhc探针的整体原位杂交结果显示视黄酸处理会导致斑马鱼胚胎心脏的前后轴发育异常,表现为vmhc表达细胞的范围缩小,amhc表达细胞的范围明显增大。视黄酸可以明显增强nppa在心脏的表达。视黄酸对心脏房室分化的影响在48hpf后表现得明显。结论5×10-8mol/L和10-7mol/L视黄酸在12.5hpf处理斑马鱼胚胎对斑马鱼心脏早期发生没有影响。斑马鱼发育过程中,视黄酸对心脏的房室分化过程起着重要的调控作用,视黄酸支持心房的分化和发育,同时抑制心室发育。     

斑马鱼在发育毒理学中的应用

生殖发育健康直接关系到优生优育以及国家未来的兴衰,目前生殖发育毒性的临床前安全性检测大部分使用大鼠、家兔等哺乳动物,但是利用哺乳动物进行试验存在诸多缺陷,例如,所需动物数量多,实验周期长,难以同时对大量物质     

COX基因在斑马鱼胚胎早期发育过程中的表达

目的克隆斑马鱼COX-1、COX-2a基因,研究其在斑马鱼胚胎早期发育中的表达情况。方法提取24 h斑马鱼胚胎的总RNA,制备DIG标记的COX-1、COX-2a RNA反义探针,整胚原位杂交研究COX-1、COX-2a在斑马鱼胚胎早期发育过程中的表达。结果 COX-1在囊胚期和原肠胚期为弥散性表达,18 h集中表达在后部躯干,到24 h,COX-1在输尿管和远端脊索处有表达,24～36 h,头部表达量高,48 hCOX-1的表达弱。COX-2a在原肠胚期前不表达,在10.8 h开始表达,位于前端神经外胚层,在26 h,COX-2a在前脑、小脑和后脑有特异性表达。结论明确了COX-1、COX-2a基因在斑马鱼胚胎发育过程中的表达模式,为研究该基因功能提供了一定的理论基础。     

氯丙嗪在斑马鱼胚胎和早期幼鱼发育过程中的神经毒性作用

目的 采用模式动物斑马鱼作为研究对象,观察氯丙嗪(chlorpromazine,CPZ)暴露对胚胎和幼鱼早期神经发育的影响.方法 在一般毒性评价的基础上,通过整体胚胎细胞凋亡检测和脑组织病理学检查,了解CPZ对神经发育的器质性改变;采用神经行为学方法,包括幼鱼触动逃避反应、自发运动以及惊恐逃避反射等,研究氯丙嗪暴露所致的神经发育功能性障碍.结果斑马鱼胚胎受精后6 h(6 hpf)～72 hpf暴露于CPZ(≥5 mg/L)可引起胚胎和幼鱼死亡、致畸和幼鱼孵化延迟,并呈浓度和时间依赖性;采用吖啶橙染色检测36 hpf整体胚胎凋亡细胞,发现凋亡细胞主要集中在胚胎中脑、后脑、丘脑以及中后脑连接区、脊索和尾部等处;脑组织病理学检测发现,7dpf幼鱼颅腔增大、脑体积减小、脑细胞缩小且细胞间隙增宽.6～72 hpf CPZ(≥0.0625 mg/L)暴露后,幼鱼神经行为学研究发现,CPZ(≥0.125 mg/L)可引起3dpf幼鱼触觉运动能力下降;CPZ(≥0 5 mg/L)可浓度依赖性地抑制幼鱼自发运动,并出现僵直不动、震颤或快速刻板式转圈运动等行为改变;光惊恐实验中,暗环境下各暴露组幼鱼对突发强光刺激均表现为惊跳逃避,并且暗-光交替期运动加速度变化与对照组无显著差异;在撤除光源后,1mg/L和2 mg/L暴露组幼鱼暗适应时程缩短,而0.125 mg/L和0.25 mg/L暴露组暗适应时程延长,提示CPZ对外界刺激引发的幼鱼活跃游动有抑制和促进双重毒性作用.结论 CPZ暴露对斑马鱼胚胎和幼鱼具有明显的神经发育毒性作用.模式动物斑马鱼作为一种高通量筛选模型在外源性化合物神经发育毒性评价中具有较好的应用前景.     

下调rpl15基因的表达抑制斑马鱼早期造血的发育

目的 探究核糖体蛋白L15(ribosomal protein 115,rpl15)基因表达下调对斑马鱼早期造血发育的影响.方法 设计并合成rpl15吗啉代反义寡核苷酸(morphilino antisense oligo,MO),通过显微注射到单细胞期斑马鱼(0～0.75 hpf)的受精卵中来下调rpl15的表达,通...     

Rap1基因在斑马鱼胚胎早期发育过程中的时空表达谱研究

目的：选择斑马鱼作为实验动物模型,研究Rap1基因在胚胎早期发育过程中的时空表达规律。方法从斑马鱼胚胎cDNA中克隆Rap1基因片段,将Rap1基因片段和pCS2＋质粒进行体外连接重组,重组质粒经双酶切、菌落聚合酶链反应（PCR）及测序鉴定正确后,经T3RNA体外转录体系合成DIG标记的Rap1基因反义mRNA探针,采用整胚原位杂交方法检测Rap1在斑马鱼胚胎早期发育过程的表达情况。结果在斑马鱼胚胎0．75 hpf的细胞分裂连接处、3．70 hpf和6．00 hpf的动物极、12．00～72．00 hpf的脊索神经部位均可见Rap1基因的阳性杂交信号。结论 Rap1基因在斑马鱼脊索神经系统的早期发育过程中可能起到重要的调控作用。     

Pak1对胚胎血管发育的作用及初步机制

目的 研究p21活化激酶1（p21-activated kinase 1,Pak1）对胚胎血管发育的影响,并初步探讨其相关作用机制。方法 以组成激活型Pak1（constitutively active Pak1,caPak1）的重组过表达质粒PCS2-caPak1为模板,用SP6 RNA聚合酶体外合成caPak1 mRNA,用显微注射法将其注入斑马鱼单细胞期胚胎,观察胚胎发育和表型变化,用透射电镜进一步确认胚胎血管的超微结构。用脂质体转染法将PCS2-caPak1转入人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）,用MTT法检测细胞活力,并用流式细胞术分析HUVEC凋亡情况。结果 斑马鱼胚胎发育至受精后30～36 h时,可见过表达组斑马鱼出现头部出血表型,出血比例约25%～30%,透射电镜下可见血管内皮细胞结构破坏;细胞水平过表达Pak1后,细胞变圆并出现部分脱落,MTT检测发现细胞存活减少（P<0.01）,流式细胞术分析发现内皮细胞凋亡增加（P<0.01）。结论 过表达Pak1可能通过增加内皮细胞凋亡影响胚胎血管发育。     

斑马鱼模式生物在发育生物学实验教学中的应用

实验课程在辅助课堂理论教学、训练学生的动手操作能力和培养科研兴趣具有重要作用。实验设计利用组织冷冻切片和DNA DAPI染色技术,观察模式生物斑马鱼胚胎在发育过程中视网膜分层、晶状体纤维细胞去核和视神经形成的形态变化特征。为使实验更具普遍适用性,文章从实验原理、教学目的、教学重点与难点、教学设计与安排和实验结果分析与讨论几个方面进行详细阐述,以达到高校发育生物学实验教学内容创新的目的。     

Polycomb家族基因Nspcl在斑马鱼早期发育的表达

目的 探讨Polycomb家族基因Nspel在模式生物斑马鱼发育早期的表达模式.方法 根据GenBank中斑马鱼Nspcl的cDNA序列设计Nspcl原位杂交探针片断,并制备地高辛标记的探针.收取单细胞期、双细胞期、胚芽期及不同时间点的体节期斑马鱼胚胎,用制备好的探针作原位杂交,显微镜下拍照,获得信号适当的杂交结果.结果 在斑马鱼体节期前,Nspcl在全身表达;从体节期开始,其表达逐渐表现出特异性,主要在头部的神经系统中表达.结论 Nspcl在模式生物斑马鱼的早期发育、尤其是神经系统发育的过程中可能扮演重要角色.     

胚胎的血管发育及其调控机制

胚胎血管系统的形成过程可分为血管发生和血管生成这两个不同的阶段，其进程受多种刺激和抑制信号的调控，这些信号必须协调作用，以确保血管发育的每个阶段得以正常进行。本概述了血管的起源以及血管发育的过程，并介绍了影响血管发育进程的一些主要因素。     

硼砂对斑马鱼发育的影响

目的以野生型和肝脏转基因T3斑马鱼为研究对象,探究硼砂对斑马鱼的发育毒性。方法不同浓度的硼砂分别处理斑马鱼胚胎,以受精后小时(hpf)为时间段,每24h观察并统计野生型斑马鱼的自主活动次数、孵化率、心率、畸形率、死亡率以及肝脏发育面积。结果斑马鱼胚胎24hpf,随硼砂浓度升高,硼砂各浓度处理组自主活动次数逐渐降低,0.6mg/ml硼砂组与空白对照组差异具有统计学差异(P <0.01)。与空白对照组相比,斑马鱼胚胎72hpf和96hpf,硼砂各浓度处理组斑马鱼心率显著降低(P <0.01); 96hpf,0.9mg/ml硼砂组的畸形率显著性升高(P <0.01); 96hpf和120hpf,0.9mg/ml硼砂组的死亡率显著性升高(P <0.01); 120hpf和144hpf,0.9mg/ml硼砂组斑马鱼幼鱼的肝脏面积显著减小(P <0.01)。结论高浓度的硼砂对斑马鱼具有发育毒性。     

ripply1在斑马鱼早期胚胎背腹发育中的作用

目的 探究ripply1基因在斑马鱼早期背腹轴发生过程中的作用。方法 利用斑马鱼整封原位杂交技术揭示ripply1基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达模式,通过显微注射技术在胚胎1细胞期注射ripply1的mRNA来高表达Ripply1蛋白并在后期观察胚胎背腹标记基因的变化及胚胎形态变化。利用Tol2转基因技术构建ripply1启动子驱动的GFP转基因鱼。结果 原位杂交结果显示ripply1基因在斑马鱼原肠早期胚盾期特异表达在胚盾处,即预定的背部。高表达ripply1后,在胚盾期背部标记基因表达范围扩大,腹部标记基因表达减弱,受精后24小时胚胎表现出严重的背部化表型：头部增大,腹部卵黄延伸减弱,尾部躯干及尾部区域减少,有的甚至形成了第二个体轴。得到的转基因鱼揭示ripply1母源表达,并且转录起始位点上游1200个碱基驱动的GFP能模拟内源基因的表达图式。结论 ripply1可能参与斑马鱼胚胎早期背腹轴的发生。     

西洋参水煎液对斑马鱼血管生长的干预作用

目的:观察西洋参水煎液对斑马鱼血管生长的作用。方法:以转基因斑马鱼(Fli1:EGFP)为研究对象。(1)正常血管模型。将斑马鱼分为对照组和西洋参不同浓度(1、3、10、30、100μg/ml)组,每组24条,分别给予培养液或相应浓度的西洋参水煎液,干预48 h后荧光显微镜下观察斑马鱼肠下血管,测量血管直径,并测定平均交叉数和平均出芽数。(2)血管损伤模型。将斑马鱼分为对照组、模型组、西洋参不同浓度(1、3、10、30、100μg/ml)组,每组24条。除对照组外,其他各组加入0.2μmol/L血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(VRI);培养24 h后,西洋参组给予相应浓度的西洋参水煎液,对照组和模型组给予培养液,干预24 h后镜下观察脊背节间完整血管与缺陷血管的个数。结果:(1)正常血管模型。与对照组相比,西洋参30μg/ml组斑马鱼肠下血管的平均交叉数明显增多(P0.05),1、30μg/ml组的平均出芽数明显增多(P0.05,P0.01),10μg/ml组的血管直径明显增大(P0.05);与西洋参100μg/ml组相比,30μg/ml组的平均交叉数显著增多(P0.01),1μg/ml组的平均出芽数明显增多(P0.05)。(2)血管损伤模型。与对照组相比,模型组和西洋参各浓度组斑马鱼的完整血管数明显减少(P0.01),缺陷血管数明显增多(P0.01);与模型组相比,西洋参10、30、100μg/ml组的完整血管数明显增多(P0.05,P0.01),西洋参各浓度组的缺陷血管数均显著减少(P0.01)。结论:西洋参水煎液可在一定程度促进斑马鱼血管生长。