胶原/羟基磷灰石骨软骨一体化支架的生物学特性研究

[目的]对体外条件下胶原/羟基磷灰石一体化复合材料的生物学特性进行评价,探讨其作为骨软骨组织工程支架的可行性。[方法]以胶原和羟基磷灰石为原料,研制出由胶原逐层过渡到羟基磷灰石为主的一体化支架材料,其软骨层主要成分为胶原,骨层主要成分为羟基磷灰石。通过扫描电镜观察材料内部结构及孔径大小,液体位移法测定材料的孔隙率。将材料与兔骨髓基质细胞复合培养,MTT法测定细胞的生长曲线,扫描电镜观察细胞在材料上的生长粘附情况。[结果]胶原/羟基磷灰石一体化复合支架具有疏松多孔结构,其中软骨层孔径大小(90±15)μm,骨层孔径大小(120±20)μm,孔隙率(75±5.0)%。细胞在材料上生长良好。[结论]胶原/羟基磷灰石一体化复合材料具有适宜的孔隙结构和良好的生物相容性,可用作骨软骨组织工程支架材料。     

软骨细胞外基质/壳聚糖复合多孔支架和骨髓间充质干细胞构建组织工程软骨

[目的]探讨软骨细胞外基质和壳聚糖制备复合多孔支架,同时并对小鼠骨髓间充质干细胞构建组织工程软骨的可行性进行观察.[方法]以猪关节软骨细胞外基质和壳聚糖为原料,采用冷冻干燥法制备软骨细胞外基质/壳聚糖复合多孔支架.通过扣描电镜观察材料内部结构及孔径大小,液体位移法测定材料的孔隙率,MTT方法检测支架浸提液毒性.将小鼠的骨髓间充质干细胞(BMSCs)分离培养并用TGF-β1成软骨诱导后,与材料复合培养,扫描电镜观察细胞在材料上的生长粘附情况.[结果]软骨细胞外基质/壳聚精复合支架具有疏松多孔结构,孔径大小(159±36)μm,孔隙率为90.5%±2.3%,复合支架中的软骨细胞外基质成分甲苯胺蓝染色、番红O染色均呈阳性,MTT结果显示支架无细胞毒性.诱导的骨髓间充质干细胞在支架表面生长良好.[结论]软骨细胞外基质/壳聚糖复合材料具有合适的孔径和孔隙率,生物相容性良好,是组织工程软骨的良好支架载体.     

胶原-透明质酸支架的制备及其与软骨细胞复合培养的实验研究

目的制备胶原-透明质酸支架,评价其与兔髁状突软骨细胞的生物相容性,探讨其应用于关节软骨组织工程的可行性。方法冷冻干燥法制备胶原-透明质酸复合多孔海绵支架材料,将其与碳化二亚胺[1-ethyl-3-（3-dimethyl aminopropyl）carbodiimide,EDC]进行化学交联。分别采用体积法和体外酶解实验测定支架材料孔隙率和降解率,扫描电镜观察交联前后支架材料的形态变化。取3周龄新西兰兔髁状突软骨细胞,体外培养5d后,甲苯胺蓝染色,倒置相差显微镜下观察行细胞鉴定。取消化后第2代软骨细胞接种至支架材料复合培养,倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。复合培养1、3、5、7和10d后,PBS液清洗3次,置入24孔板并以0.25%胰酶和0.1%EDTA消化细胞,采集细胞进行细胞计数并绘制细胞生长曲线。另取部分样本继续培养5d,行组织学和扫描电镜观察。结果胶原-透明质酸支架材料经化学交联后,具有合适的三维多孔结构,孔隙率为83.7%,孔径100-120μm;交联后抗酶解能力显著增加。髁状突软骨细胞在其表面和内部贴附良好,形成细胞-材料复合体,细胞增殖实验显示,复合培养1d,材料中细胞数为3.7×104/支架,10d后增至8.2×104/支架。电镜观察见细胞周围有基质分泌。结论EDC交联后的胶原-透明质酸支架具有良好空间结构和生物相容性,可作为支架材料用于髁状突软骨组织工程的研究。     

一体化层状梯度修复体用于骨软骨组织工程的实验研究

[目的]探索胶原／壳聚糖／纳米β-磷酸三钙一体化层状梯度修复体在组织工程中用作骨软骨缺损修复的可行性。[方法]以Ⅰ型胶原、壳聚糖、纳米β-磷酸三钙（β-TCP）为基本原料，采用无毒交联并通过冷冻干燥法成型；扫描电镜观察，测定支架材料的孔径、孔隙率以及交通孔情况；分离扩增兔骨髓间充质干细胞（BMSC），将BMSC接种于材料上，扫描电镜观察细胞在材料上的黏附状态，MTT法测定细胞在材料上的生长曲线；以软骨诱导液体外诱导细胞-支架复合物向软骨分化，2周后植入自体股部肌袋，6周取材，HE、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化鉴定诱导分化效果。[结果]材料疏松多孔，孔径大于100μm，孔隙率大于95％。细胞在材料上黏附状态良好，并且增殖迅速。BMSC-材料复合体经体外三维诱导后可在自体异位向软骨分化。[结论]Ⅰ型胶原／壳聚糖／纳米TCP一体化层状梯度修复体具有良好的孔隙结构和生物相容性，有望成为一种新型的组织工程支架材料用于骨软骨缺损修复。     

明胶-硫酸软骨素-透明质酸钠作为组织工程软骨支架的实验研究

目的探索明胶-硫酸软骨素-透明质酸钠多孔支架的制备方法和其作为组织工程软骨支架的可行性。方法光镜和扫描电镜观察-20℃、-80℃及液氮条件下冷冻抽真空干燥制备的明胶-硫酸软骨素-透明质酸钠支架的孔径、孔隙率、交通孔和密度;测定不同条件制备的支架材料与正常软骨的压缩载荷-形变曲线;分离、扩增兔骨髓基质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs),接种于不同条件制备的支架材料上培养,MTT检测MSCs在支架上的黏附率及多孔支架对细胞增殖功能的影响。结果在-20℃、-80℃及液氮条件下制备的支架材料具有疏松多孔结构,孔径依次为300±45μm、230±30μm和45±10μm,孔隙率为81%、79%和56%,密度为9.41±0.25μg/mm3、11.50±0.36μg/mm3和29.50±0.61μg/mm3;-80℃和液氮条件下制备的支架材料,力学强度接近于正常软骨;MTT测得细胞在-20℃、-80℃及液氮条件下制备的支架材料,黏附率分别为85.0%、87.5%和56.3%;可轻度促进MSCs增殖。结论-80℃条件下抽真空干燥制备的明胶-硫酸软骨素-透明质酸钠多孔支架,具有良好的孔径、孔隙率和抗压缩载荷能力,与MSCs具有较好的相容性,是软骨组织工程中的一种新型仿生支架材料。     

细胞复合β-磷酸三钙生物陶瓷修复软骨缺损的实验研究

[目的]通过将骨髓间充质干细胞（MCSc）诱导的具有软骨细胞、成骨细胞表型的细胞接种到三维多孔β-磷酸三钙（β-TCP）生物陶瓷支架材料上，体外构建骨软骨复合体，探讨以β-TCP为载体建造组织工程化软骨修复骨软骨缺损的可行性。[方法]将β-TCP多孔陶瓷加工成圆柱状，并将其作为构建人工软骨的细胞支架。在支架材料上分别接种从犬骨髓干细胞培养成的具有软骨细胞、成骨细胞表型的细胞，将细胞-支架复合体共同培养1周后，移植到犬关节软骨缺损处。植入后12、16周末取材，进行大体观察、组织学及组织化学等观察。[结果]复合体体内移植后，在犬关节软骨缺损处有新生软骨形成，形成的软骨基本保持了支架材料原有形态。[结论]β-TCP多孔陶瓷可作为支架材料，复合细胞后具有修复软骨缺损的作用。     

软骨PLGA-Ⅱ型胶原支架复合体修复兔膝关节骨软骨损伤

目的探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导的软骨细胞与聚乙醇酸-乳酸共聚物(PLGA)-Ⅱ型胶原支架通过管帽结构复合构建组织工程软骨复合体修复兔膝关节骨软骨损伤的效果及各界面耦合情况。方法BMSCs经软骨诱导液诱导成软骨细胞后接种于PLGA-Ⅱ型胶原支架的底层,支架表层戴管帽。将该细胞-支架复合物置入软骨条件培养液中培养2周,扫描电镜观察。将45只新西兰大白兔随机分为A、B、C 3组,每组15只,并于股骨髁处造模。分别于缺损处植入戴管帽结构复合的软骨支架复合体(A组)、PLGA-Ⅱ型胶原支架(B组)、不植入任何材料(C组)。于第4周和第12周取材行大体观察和组织学分析。结果 A组和B组缺损处均有软骨生成;C组缺损明显,只有纤维组织生长。A组软骨缺损部分软骨细胞修复,成骨区部分骨样细胞修复;两者耦合处犬牙交错,修复缺损程度及成骨区和成软骨区界面耦合情况明显优于B、C组。软骨组织学评分A组优于B、C组(P0.05)。结论 BMSCs诱导分化成的软骨细胞与PLGA-Ⅱ型胶原支架经过管帽结构构建成的软骨PLGA-Ⅱ型胶原支架复合体可有效修复兔膝关节骨软骨损伤,新生软骨、骨与宿主软骨、骨及新生软骨与软骨下骨各界面耦合良好。     

柱状分层的胶原-羟基磷灰石复合支架负载软骨细胞体外培养

目的 观察具有柱状分层结构的胶原-羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）复合支架对软骨细胞的吸附作用及对软骨细胞生物学性状的影响，评价其作为软骨组织工程支架的可行性及价值。方法 以胶原复合HA逐层制备胶原-HA复合支架，体外培养新西兰大白兔关节软骨细胞并扩增，吸附于多孔胶原-HA复合支架材料上进行三维立体培养3周，通过倒置相差显微镜、组织学、扫描电镜及免疫组织化学检测支架对软骨细胞的表型、增殖及功能的影响。结果 胶原-HA复合支架为柱状，支架表层为胶原。平均孔径为147μm，孔隙率89％；中层为多孔胶原-HA复合；底层为HA，平均孔径为85μm，孔隙率85％。胶原-HA复合支架亲水性好，软骨细胞吸附于支架表面24h后，增殖并逐渐顺孔隙迁徙至支架内部，在孔壁贴附良好，表型维持稳定，分泌细胞外基质，Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性。结论 具有柱状分层结构的胶原-HA复合支架其细胞相容性良好，较胶原纤维具有更强的力学性能，有望成为一种比较理想的软骨组织工程支架材料。     

多孔CPC组织工程肋骨支架制备及BMSCs在其表面增殖黏附的实验研究

目的 通过形态学观察、细胞黏附和细胞增殖实验观察多孔CPC材料作为组织工程肋骨支架的可行性. 方法 取幼猪骨髓分离培养BMSCs并传代,另自制5 mm×5 mm×5 mm大小的多孔CPC材料,micro-CT观察孔径、孔隙率及羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)含量,并与人正常松质骨作对比.取24孔培养板,于孔内置入多孔CPC材料1块,共15块,调整第1代BMSCs浓度为6×10s个/mL,将细胞悬液150 μL滴加到多孔CPC材料上,置于孵育箱中复合培养4、12、24 h后,收集细胞并计数,计算细胞黏附率:行倒置相差显微镜观察、MTT法检测多孔CPC材料表面BMSCs的生长情况:扫描电镜观察接种BMSCs 7 d的多孔CPC材料,并与单纯多孔CPC材料和正常人松质骨对比. 结果 BMSCs与多孔CPC材料复合培养4、12、24 h的细胞黏附率分别为28.00%±0.98%、46.70%4±1.14%和48.50%±1.18%.MTT法检测细胞与材料复合培养1、2、3、4、5、6 d的吸光度(A)值分别为1.103 ±0.214、1.557 ±0.322、1.920 ±0.178、2.564 ±0.226、2.951 ±0.415和3.831 ±0.328,呈明显上升趋势.倒置相差显微镜下可见细胞生长旺盛,贴壁良好,未出现毒性反应.micro-CT检查示多孔CPC材料的孔径均衡,且互相连通,HA含量为(1 101.222 8 ±0.618 4)mg/ccm,孔隙率为70.26%±0.45%;人正常松质骨HA含量为(1 072.552 3 ±0.744 2)mg/ccm,孔隙率为72.82%±0.51%;两组比较差异无统计学意义(P>0.05).扫描电镜观察单纯多孔CPC材料孔径与正常人松质骨孔径大小、结构相似,且互相连通;BMSCs在多孔CPC材料表面排列有序,细胞呈片状,部分呈簇状,细胞形态呈多边形,细胞间可见较多细胞间质. 结论 多孔CPC材料结构和成分均接近正常人松质骨,BMSCs在其表面生长良好,适合作为组织工程肋骨支架材料,但其对细胞的黏附性有待进一步改善.     

脂肪间充质干细胞复合壳聚糖-胶原-硫酸软骨素多孔支架体外成软骨能力的实验研究

目的 制备壳聚糖-胶原-硫酸软骨素三维支架,并与大鼠脂肪间充质干细胞复合培养,探讨其作为软骨组织工程支架的可行性.方法 冷冻干燥法制备壳聚糖-胶原-硫酸软骨素复合多孔海绵支架材料,采用体积法和称重法测定支架的孔隙率和吸水性,扫描电镜观察支架材料的形态结构.分离培养大鼠脂肪间充质干细胞,流式细胞学检测大鼠脂肪间充质干细胞的表面标志CD29、CD34、CD44、CD45,将传至3代的细胞,以2×106/ml的密度接种于自制的壳聚糖-胶原-硫酸软骨素三维支架上.实验组为含TGF-β1的培养基,对照组无TGF-β1,培养3周后,通过免疫组织化学,RT-PCR及westenblot方法对诱导后的细胞进行鉴定.结果 制备的壳聚糖-胶原-硫酸软骨素三维支架具有合适的三维多孔结构,孔隙率为(92.23±1.68)%,孔径为100～130 μm.复合培养3周后,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色成阳性,RT-PCR结果表明有蛋白聚糖和Ⅱ型胶原mRNA的表达,westenblot检测出Ⅱ型胶原蛋白的表达.结论 壳聚糖-胶原-硫酸软骨素复合支架材料可为脂肪间充质干细胞生长分化及组织形成提供一个良好的环境, 在软骨组织工程的支架材料领域有较广泛的应用前景.     

骨形态发生蛋白-2活性多肽修饰的重组胶原矿化骨对骨髓基质干细胞生物学行为的影响

目的 探讨骨形态发生蛋白-2(BMP-2)活件多肽修饰的重组胶原矿化骨复合材料对骨髓基质干细胞(BMSCs)增殖、黏附及分化等生物学行为的影响. 方法制备重组胶原矿化骨支架材料,将BMP-2活性多肽通过交联剂共价结合到材料上,扫描电镜观察支架材料表面微观形貌;取第3代BMSCs接种到材料上,以未结合多肽的重组胶原矿化骨作为对照,采用MTT法检测BMSCs在材料表面的增殖;沉淀法检测BMSCs在材料表面的黏附率;扣描电镜观察比较BMSCs在材料表面的生长形态;通过检测细胞中的碱性磷酸酶活性及钙含量,观察BMSCs在材料表面的分化情况. 结果扫描电镜结果显示:支架材料旱多孔状;X射线光电子能谱法证实BMP-2活性多肽成功共价结合到材料表面;BMP-2活性多肽修饰的重组胶原矿化骨复合材料表面BMSCs的黏附和向成骨细胞方向分化能力均高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05),而BMSCs的增殖能力与对照组相比,差异无统计学意义(P＞0.05). 结论BMP-2活性多肽可以显著改善重组胶原矿化骨复合材料的细胞相容性和生物活性,经BMP-2活性多肽修饰的重组胶原矿化骨复合材料是一种理想的骨组织工程支架材料.     

皮质骨Ⅰ型胶原的提取及胶原-明胶支架材料的制备

[目的] 探索一种较理想的皮质骨Ⅰ型胶原的提取方法并制备胶原-明胶支架材料.[方法] 以牛皮质骨为原料,经低温液氮粉碎、梯度脱水、脱脂、脱钙处理成为脱钙骨基质粉.通过酶溶解法处理脱钙骨基质粉,经溶解、离心、透析、冻干等步骤获得皮质骨胶原,SDS-PAGE电泳、氨基酸分析等方法鉴定其特征;再以胶原、明胶通过冷冻干燥技术制备神经支架材料,扫描电镜观察其内部结构.[结果] 所得胶原经SDS-PAGE电泳、氨基酸分析等方法鉴定符合Ⅰ型胶原特征;制备的支架材料外观呈圆柱状,内部为孔径均匀平行排列的微管结构,具有仿生效果.[结论] 皮质骨中能够获得纯度较高的Ⅰ型胶原,可用于胶原材料的制作.     

软骨脱细胞基质复合脂肪源性干细胞构建软骨组织的实验研究

[目的] 探讨软骨脱细胞基质支架材料的制备,及其体外复合脂肪源性干细胞构建软骨组织的技术方法.[方法] 成年新西兰大白兔脂肪源性干细胞获得,培养,扩增.成年新西兰大白兔新鲜软骨,低温冻干12 h,后经曲拉通、DNA、RNA酶等处理制备成为软骨脱细胞基质支架材料,终浓度为2×107/L的脂肪干细胞种植于软骨脱细胞基质中于软骨细胞方向诱导培养基中培养2周,构建软骨组织.新鲜制备的软骨脱细胞基质及构建的软骨组织分别行组织学、免疫组织化学及透射电镜检测.[结果] 实验制备的软骨脱细胞基质支架材料内无细胞结构存在,仅残留空白软骨陷窝.具有合适的孔隙率和孔径大小;复合脂肪源性干细胞后细胞向材料内部迁移,粘附,生长良好.部分载体内细胞Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性.[结论] 软骨脱细胞基质可作为支架材料应用于软骨组织工程,复合脂肪源性干细胞培养可成功构建软骨组织.     

明胶-硫酸软骨素-透明质酸钠载体制备及复合骨髓基质干细胞成软骨的实验研究

目的探索明胶-硫酸软骨素-透明质酸钠多孔载体作为新型组织工程软骨载体的可行性。方法观察-80℃冷冻抽真空干燥制备的明胶-硫酸软骨素-透明质酸钠载体的孔径、孔隙率、交通孔和密度;分离、扩增兔骨髓基质干细胞(MSCs),MTT检测MSCs在载体上的黏附率及多孔载体对细胞增殖功能的影响;兔MSCs经转化生长因子β1(TGF-β1)诱导7d后免疫组化检测Ⅱ型胶原、S-100蛋白表达;诱导后的MSCs与载体复合后植入裸鼠肌袋内,分别于术后2、4周取材进行组织学观察。结果载体孔径为230±30μm,孔隙率为79%,密度为11.50±0.36(μg/mm3);细胞在载体上黏附率87.5%;载体可轻度促进MSCs增殖;经TGF-β1诱导7d后MSCsⅡ型胶原、S-100蛋白免疫组化染色阳性;诱导后的MSCs在体内生长增殖良好,4周时可见新生软骨组织形成。结论该载体具有良好的孔径、孔隙率,与MSCs具有较好的相容性,是软骨组织工程中的一种新型仿生载体。     

胶原-透明质酸-硫酸软骨素构建组织工程软骨纳米支架的实验研究

目的:探讨胶原-透明质酸-硫酸软骨素复合构建软骨组织工程三维纳米支架的可行性。方法:2012年12月至2014年6月,在川北医学院组织工程与干细胞研究所将胶原-透明质酸-硫酸软骨素溶于三氟乙醇和水混合溶剂中制成静电纺丝溶液,制备组织工程软骨纳米支架材料。扫描电镜观察其表面形貌,测定其纳米纤维直径、吸水率、表面接触角和降...     

胶原杂化去抗原松质骨载体复合自体间充质干细胞修复骨软骨缺损

目的制备胶原杂化去抗原松质骨载体并复合自体间充质干细胞修复关节骨软骨缺损。方法脱脂、脱蛋白和脱钙的方法来制备去抗原松质骨载体，酸解-酶解法制备胶原进而杂化松质骨载体。扩增间充质干细胞，接种到胶原杂化松质骨载体，植入左膝关节（实验侧），右膝关节植入没有复合细胞的胶原杂化去抗原松质骨载体（对照侧），在第6、12、24、48周时结合Pineda评分观察实验侧和对照侧的骨软骨缺损的组织修复情况。结果实验侧自12周时出现初步的软骨表型，24周时最为明显，48周有部分退变；软骨下骨部分逐渐恢复。对照侧软骨缺损一直以纤维组织充填，软骨下骨有部分恢复。上述各时间点实验侧和对照侧的Pineda评分为16．600±0．966。17．600±0．699（6周）；6．600±0．843、14．800±0．789（12周）；3．300±0．483、13．600±0．843（24周）；3．500±0．527、14．100±0．876（48周），差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论胶原杂化的去抗原松质骨载体复合自体间充质干细胞能够修复关节的骨软骨缺损。     

大鼠骨髓间充质干细胞复合n-HA/PLA支架异位成骨的实验研究

[目的]研究大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)复合纳米羟基磷灰石/聚乳酸(n-HA/PLA)支架材料体内异位成骨情况.[方法]取SD大鼠股骨胫骨骨髓,进行贴壁培养BMSCs,将第3代BMSCs接种到n-HA/PLA支架材料上,加入成骨诱导液,3d后置人大鼠体内,设为实验组;将单纯支架材料置入组为对照组.4、8、12周时取材进行大体和组织学观察.[结果]8、12周时实验组可见类骨质成分形成,并且支架材料维持置入时形状,对照组无类骨质形成.[结论]BMSCs复合n-HA/PLA构建组织工程骨有很好的异位成骨能力,且能在体内维持良好塑型.     

双层壳聚糖与HAP复合支架的初步研究

目的 探讨双层壳聚糖(chitosan,CS)/HAP复合支架作为骨软骨组织工程支架的可行性,并结合兔自体BMSCs修复骨软骨缺损. 方法采用冻干法和烧结法制作双层CS/HAP复合支架,检测其理化特性.取日本大耳白兔骨髓4～6mL,全骨髓培养法分离纯化BMSCs,并鉴定.调整第2代BMSCs细胞密度为2×107个/mL,应用纤维蛋白胶种植技术,接种至双层CS/HAP复合支架,体外构建细胞一支架复合物.取36只日本大耳白兔,于右侧膝关节股骨下端外侧髁负重区,作一直径4mm、深3 mm的圆柱形缺损,制备兔膝关节骨软骨缺损模型.根据缺损区植入物的不同,分为A、B、C 3组(n=12).A组:植入细胞-支架复合物;B组:植入双层CS/HAP复合支架;C组:不植入任何材料,作为窄白对照组.术后6、12周取材,行大体及组织学观察,采用改良Wakitani法评分. 结果 双层CS/HAP支架CS层孔隙率为76.00%±5.01%,孔径为200～400 μm,平均300 μm,孔洞相通;HAP层孔隙率为72.00%±4.23%,孔径为200～500 μm,半均350μm,孔洞相通,结合部结合好.全骨髓法培养BMSCs,第7天可见集落形成,14 d传代;免疫组织化学检测示CD44( )和CD45(-).大体观察和组织学检测显示,A组基本修复软骨缺损,骨缺损修复不良,有骨小梁长入;B、C组骨、软骨缺损修复不良,组织学检测以纤维组织或无新生组织形成,软骨及骨缺损均明显存在.术后6、12周,A组改良Wakitani评分分别为(5.17± 1.17)分和(3.20±0.75)分,均优于B、C组,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 双层CS/HAP复合支架可作为骨软骨组织工程支架,复合BMSCs可修复兔关节软骨与骨缺损,重建关节解剖结构.     

新型脱细胞软骨基质三维多孔支架的制备

目的 探讨脱细胞软骨基质三维多孔支架的制备方法以及将其应用于关节软骨组织工程的可行性. 方法 取天然人软骨粉碎后,采用梯度离心法取100 nm～5μm软骨微丝,脱细胞处理后制备为质量体积比为3%的悬液,采用冷冻冻干法制备脱细胞软骨基质三维多孔支架.254nm紫外线和碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺对支架进行交联.冷冻冻干后,对支架材料进行组织学及扫描电镜观察,测定支架孔径和孔隙率、吸水率,并采用MTT法分析支架浸提液毒性.分离培养犬BMSCs,用TGF-β1成软骨诱导后种植至支架,倒置显微镜、电镜观察细胞在支架上的生长、分化情况. 结果 组织学观察显示,三维多孔支架中无软骨细胞碎片残留,甲苯胺蓝染色、番红O染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色均呈阳性.扫描电镜显示支架内孔洞相互连通,孔径为(155±34)μm,孔隙率为91.3%±2.0%,吸水率为2 451%±155%.MTT法显示不同浓度支架浸提液与对照DMEM培养液吸光度值比较,差异无统计学意义(P＞0.05),支架无细胞毒性.倒置显微镜观察,细胞在支架上黏附良好;扫描电镜下细胞在支架上均匀分布,细胞呈圆形或椭圆形,并有基质分泌. 结论 制备的脱细胞软骨基质三维多孔支架去细胞彻底,保留了软骨ECM主要成分,无毒,具备合适的孔径和孔隙率,生物相容性良好,是软骨组织工程良好的支架载体.     

脱细胞软骨基质来源的多孔支架复合山羊髓核细胞体内初步构建组织工程髓核的实验研究

[目的]探讨脱细胞软骨基质多孔支架复合PKH26标记的山羊髓核细胞体内异位构建组织工程髓核的可行性.[方法]制备脱细胞软骨基质来源的多孔支架,扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)观察、天狼星红染色、HE染色观察、MTT毒性检测;分离山羊髓核细胞,通过倒置显微镜观察、番红O染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色进行鉴定;将PKH26标记的山羊髓核细胞接种支架上,体外培养3d后进行LIVE/DEAD活性染色,将细胞支架复合物置入裸鼠皮下,培养6周,病理切片,荧光显微镜下观察,进行番红O、Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组化染色.[结果]扫描电镜观察支架孔隙相连通且分布均匀,天狼星红染色支架呈黄绿相间色,HE支架淡染,MTT检测细胞增殖曲线无统计学差异(P＞0.05);P1代髓核细胞呈软骨样细胞形态,番红O染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色均阳性,PKH26标记后的细胞呈红色荧光;体外LIVE/DEAD染色细胞呈绿色荧光,体内培养6周后,带红色荧光的细胞填满支架孔隙,番红O、Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,Ⅰ型胶原免疫组化染色弱阳性.[结论]以脱细胞软骨基质多孔支架复合山羊髓核细胞在体内能够形成组织工程髓核样组织.