大鼠颈动脉损伤后内膜增生的计算机图像分析

目的　利用计算机图像处理分析系统对局部应用反义寡脱氧核苷酸( ODNs) 对大鼠颈动脉损伤后内膜增生抑制作用进行定量分析。方法　将大鼠随机分成6 组( 即反义组A、正义组B、错配组C、对照组D、脂质体组E、假手术组F) ,进行大鼠颈动脉损伤后内膜增生的形态参数测定。结果　A 组管腔面积大于B、C、D 及E 组( P< 0 .05) 且小于F 组( P< 0 .05) ;A 组的内膜面积、内膜/ 中膜面积比值、最大内膜厚度、内膜/ 中膜厚度比值、内膜覆盖率均明显小于B、C、D 及E组( P< 0 .01) ,而B、C、D 及E 组组间两两比较无显著性差异( P> 0 .05) 。结论　利用计算机图像处理从量化角度分析内膜增生的各种情况,进一步证实了血管紧张素Ⅱ1 型受体( AT1R) 的反义( ODNs) 对氮气干燥后大鼠颈动脉内膜增殖有抑制作用,且具有序列依赖性     

大鼠颈动脉损伤后内膜增生的计算机图像分析

目的 利用计算机图像处理分析系统对局部应用反义寡脱氧核苷靶（ＯＤＮｓ）对大鼠颈动脉损伤后内膜增生抑制作用进行定量分析方法 将大鼠随机分成６组（即反义组Ａ、正义组Ｂ、错配组Ｃ、对照组Ｄ、脂质体组Ｅ、假手术组Ｆ），进行大鼠颈动脉损伤后内膜增生的形态参数测定。结果 Ａ组管腔面积大于Ｂ、Ｃ、Ｄ及Ｅ组（Ｐ〈０．０５）且小于Ｆ组（Ｐ〈０．０５）；Ａ组的内膜面积、内膜／中膜面积比值最大内膜厚度、内膜／中膜厚率比     

应用c-myc反义寡核苷酸防治自体静脉移植物内膜增生的实验研究

目的:研究局部应用反义寡核苷酸c-myc对自体静脉移植物内膜增生的防治作用,为反义技术防治血管内膜增生的早期临床应用提供实验依据.方法:30只新西兰兔颈外静脉间置于同侧颈总动脉后随机分成对照组、蛋白胶组、正义组、反义组及错配组,以医用生物蛋白胶分别溶解反义、正义及错配的c-myc基因片段(330μg)后直接涂于静脉移植物外膜.术后28 d取材制片,显微镜进行形态观察,并用计算机图像分析系统测量和计算内膜厚度、中膜厚度及二者之比值,内膜面积、中膜面积及二者之比值,以q检验行统计学分析.结果:反义组增生内膜厚度较对照组降低36.77%,内膜面积降低48.22%,对照组、蛋白胶组、正义组及错配组间内膜厚度及内膜面积均无明显差异(P>0.05);各组间中膜厚度及中膜面积均无明显差异(P>0.05).结论:医用生物蛋白胶携载反义寡核苷酸c-myc局部用于静脉移植物外膜能显著防治其内膜增生,有效防止管腔狭窄.     

可溶性支架转染c-myc反义寡核苷酸预防兔静脉移植物再狭窄

目的探讨可溶性支架转染c-myc反义寡核苷酸是否可抑制静脉移植物内膜的增殖.方法25只健康纯种新西兰大耳白兔按体重随机分为对照组,支架组,正义组,反义组,错配组,将颈外静脉间置于同侧颈总动脉后用可溶性支架将反义,正义及错配的c-myc基因片段导入静脉移植物.术后28 d取静脉桥标本,测定内膜、中膜厚度.结果反义组静脉桥的内膜厚度为(43.77±5.89) μm,显著低于对照组、支架组、正义组及错配组((80.00±1.34) μm,(76.06±4.24) μm,(74.80±9.64) μm,(79.62±7.92) μm,P<0.01);反义组内膜与中膜比值为0.68±0.20,明显低于对照组、支架组、正义组及错配组(1.42±0.18,1.35±0.20,1.34±0.26,1.41±0.24,P<0.01).结论运用可溶性支架转染反义c-myc基因可明显抑制静脉移植物内膜的增殖.     

可溶性支架转反义PCNA寡核苷酸预防静脉移植物再狭窄

目的 :研究可溶性支架转反义PCNA寡核苷酸是否具有抑制静脉移植物内膜增殖的效果。方法 :2 5只健康纯种新西兰大耳白兔按体重随机分对照组 ,支架组 ,正义组 ,反义组 ,错配组 ,将颈外静脉间置于同侧颈总动脉后用可溶性支架将反义 ,正义及错配的基因片段导入静脉移植物。术后 2 8d检测各组内膜、中膜的厚度。结果 :①反义组静脉桥的内膜厚度为 42 .72± 3 .792 μm ,显著低于对照组、支架组、正义组及错配组 ( 79.0 0± 1.2 2 5μm ,75.0 4± 3 .2 42 μm ,74.77± 8.53 5μm ,78.61± 7.816μm ,P <0 .0 1)。②反义组内膜与中膜比值为 0 .68± 8.70 1,明显低于对照组、支架组、正义组及错配组 ( 1.3 2± 0 .0 66,1.3 5± 0 .198,1.3 3± 0 .2 58,1.3 9± 0 .2 0 0 ,P <0 .0 1)。结论 :反义PCNA基因可明显抑制内膜的增殖 ,有预防移植血管再狭窄的作用     

反义寡脱氧核苷酸对内皮细胞缺氧再复氧损伤组织因子表达的影响

目的研究反义寡脱氧核苷酸对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)缺氧再复氧损伤后组织因子(TF)基因转录和表达的影响。方法培养的HUVEC随机等分成为正常对照组、缺氧再复氧组、反义寡脱氧核苷酸转染组(AS/TF组)、正义寡脱氧核苷酸转染组(S/TF组)和错配寡脱氧核苷酸转染组(Sc/TF组)。设计合成针对人TF的反义寡脱氧核苷酸(AS/TF),同时设计TF的正义寡脱氧核苷酸(S/TF)的错配寡脱氧核苷酸(Sc/TF)作为对照。用SuperFectTransfectionReagent(SF)作载体,将AS/TF、S/TF和Sc/TF分别转染AS/TF组、S/TF组和Sc/TF组HUVEC,正常对照组和缺氧再复氧组HUVEC只加SF,不转染任何寡核苷酸。将缺氧再复氧组、AS/TF组、S/TF组和Sc/TF组HUVEC培养24h后,充入氮气,缺氧条件下培养2h,正常条件下培养1h,完成缺氧再复氧模型的制作。收集各组HUVEC,用发色底物法检测HUVEC表面TF的活性,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测HUVEC中的TF抗原(TF:Ag)。并用膨胀裂解法分离细胞核,进行细胞核连缀反应(Run-onreaction)后,Bio-dot狭线印迹杂交检测HUVEC中的TFmRNA。结果与未经缺氧再复氧的正常对照组HUVEC相比,经过缺氧再复氧的HUVEC表面TF活性明显增强(P<0.001),细胞裂解液中的TF:Ag也显著增多(P<0.001),AS/TF组HUVEC的TF活性和TF:Ag的增加幅度低于缺氧再复氧组、S/TF组以及Sc/TF组(P<0.05-0.01)。体外细胞核连缀反应后,Bio-dot狭线印迹杂交显示,HUVEC缺氧再复氧后TF基因的转录增强,AS/TF组HUVECTFmRNA的转录弱于缺氧再复氧组、S/TF组和Sc/TF组。结论HUVEC缺氧再复氧后,TF基因的转录和表达均显著增强,针对TF的反义寡脱氧核苷酸能够明显抑制HUVEC缺氧再复氧损伤后TF基因的转录和表达。提示TF反义寡脱氧核苷酸对于因TF水平升高所致的血栓性疾病可能有潜在的治疗作用。     

反义c-myc寡脱氧核苷酸对大鼠腹主动脉损伤后内膜增生的影响

目的观察大鼠腹主动脉损伤后内膜增生的影响,为采用反义ｃｍｙｃ战略防治再狭窄的早期临床试验奠定基础。方法将反义ｃｍｙｃ反义寡脱氧核苷酸（ＯＤＮ）通过ｐｌｕｒｏｎｉｃｇｅｌ缓释系统和Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ转染导入系统,将其作用于大鼠腹主动脉损伤后的血管外膜,饲养三周后,处死动物,对所取的血管节段进行组织切片和弹力纤维染色,在显微镜下进行形态观察和采用图像分析系统进行图像分析,计算出内膜／中膜（Ｉ／Ｍ）面积之比和Ｉ／Ｍ厚度之比,并进行统计学分析。结果通过形态观察和Ｉ／Ｍ面积和Ｉ／Ｍ厚度之比,发现反义ｃｍｙｃＯＤＮ明显抑制了内膜增生,而且随着反义ｃｍｙｃＯＤＮ剂量的增加,其对内膜增生的抑制作用更加明显,而正义ｃｍｙｃＯＤＮ和错配ｃｍｙｃＯＤＮ与对照组相比,对内膜增生无影响。结论反义ｃｍｙｃＯＤＮ以剂量依赖性和序列特异性方式抑制了新生内膜的形成。为采用反义ｃｍｙｃ途径防治再狭窄的早期临床试验奠定了基础     

局部应用反义核酸对大鼠颈动脉肌内膜增殖的抑制作用

观察经凝胶球囊局部应用反义ｃ－ｍｙｂ对氮气干燥内皮剥脱术后大鼠颈动脉肌内膜增殖的抑制作用。方法４０只大鼠随机分为对照、反义、正义和错配组，于内皮剥脱后经凝胶球囊局部导入不同核酸片段。术后１４日取材制片；采用计算机图像分析法测量管腔面积、内／中膜面积、厚度比值。以ｑ检验行统计学分析。结果反义组管腔面积（０．２９±０．０１ｍｍ２）大于正义、错配组（０．１７±０．０５ｍｍ２，ｑ＝４．１７２９，０．１８±０．０５ｍｍ２，ｑ＝３．７４８９，ｐ＜０．０５），小于对照组（０．４０±０．１４，ｑ＝３．７７８２，ｐ＜０．０５）。其内／中膜面积、厚度比值（０．４５±０．２４，０．５７±０．２４）均低于正义与错配组（１．２６±０．２５，ｑ＝９．８９１３，１．１６±０．３８，ｑ＝８．４２５２；２．１５±０．８５，ｑ＝８．６８５０；１．８５±０．７９，ｑ＝６．８３８９，ｐ＜０．０１）。结论凝胶球囊局部应用反义ｃ－ｍｙｂ能显著抑制血管损伤后肌内膜增殖，有效防止管腔狭窄。     

乙酰肝素酶反义寡核苷酸对人乳腺癌细胞株MDA435侵袭力的抑制作用

目的：探讨乙酰肝素酶（HPSE）反义寡脱氧核苷酸对人乳腺癌细胞株MDA435侵袭力的抑制作用。方法：设计合成互补于HPSE mRNA起始密码区的硫代反义寡脱氧核苷酸AS－ODN及相应的无义对照寡脱氧核苷酸NS－ODN,以阳离子脂质体Lipofectin包埋后转染MDA435细胞,以逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）检测转染后HPSE mRNA表达的变化,以Western印迹检测HPSE蛋白表达的变化,以定量Matrigel侵袭实验检测MDA435细胞侵袭力的变化。结果：与正常对照组、脂质体对照组和NS－ODN相应浓度组相比,AS－ODN各浓度组对HPSE mRNA和蛋白的表达及细胞侵袭力均有明显抑制作用（P＜0．01）,其抑制效应在不同浓度组间差别显著P＜0．01）。AS－ODN在终浓度为0．1μmol/L,0.2μmol/L和0．4μmol/L时对MDA435细胞的侵袭力抑制率分别为34．0％、57．8％和79．7％。结论：HPSE反义寡脱氧核苷酸通过下调HPSE mRNA在蛋白的表达可显著抑制人乳腺癌细胞株MDA435的侵袭力,并呈剂量依赖性。     

转录因子NF-kB对粘附分子及血管新生内膜形成的影响

目的以调节多种增殖因子的核转录因子NF -kB的反义和诱骗性寡核苷酸为干预药物 ,探讨它们单独或联合作用对大鼠颈动脉球囊损伤后血管增殖反应及粘附分子表达的影响。　方法SD大鼠随机分为七组 ,制作血管球囊损伤模型 ;相应时间点处死动物进行检测。　结果模型组、正义组、Scramble组的血管内膜面积、中膜面积、内膜 /中膜在第 5d增加 ,14d达到高峰 ;反义组、诱骗组、反义组 +诱骗组干预后 ,血管上述病理指标明显改善 (P<0 .0 5 )。血管细胞间粘附分子 (VCAM - 1)mRNA表达在血管损伤后 6h即可检测到 ,3、5、7d后持续表达增加 ,14d后表达降低 ;免疫组化显示VCAM - 1蛋白质表达在 14d达到高峰。反义组、诱骗组、反义组 +诱骗组治疗后 ,与模型组、正义组、scramble组相比 ,VCAM - 1mRNA表达和蛋白合成在各时相点均降低 (P <0 .0 5 )。Westernblot检测核蛋白抽提物 ,显示核因子NF -kBp6 5在血管损伤后 6h有一定蛋白表达 ,1d后蛋白表达明显增加 ,至 7d达高峰 ,14d后蛋白表达略降低。反义组、诱骗组、反义组 +诱骗组干预后 ,各时相点蛋白质表达均减弱 (P <0 .0 5 )。　结论转录因子NF -kB调控VCAM - 1基因表达和蛋白质合成 ;球囊损伤后血管壁细胞增殖在不同时相点有动态变化 ;脂质体介导局部转染反义、诱骗性寡     

应用c—mtc反义寡核苷酸防治自体静脉移植物内膜增生的实 …

目的：研究局部应用反义寡核苷酸c-myc对自体静脉移植物内膜增生的防治作用,为反义技 术防治血管人膜增生的早期临床应用提供实验依据。方法：３０只新西兰兔颈外静脉间置于同侧颈总动脉后随机分厉对照组、蛋白胶组、正义组、反义组及错配组,以医用生物蛋白胶分别溶解反义、正义及错配的c-myc基因片段（３３０ug）后直接涂于静脉移植物外膜。术 后２８d取材制片,显微镜进行形态观察,并用刘算机图像分析系统测量和计算内膜厚度及     

反义c-myc寡脱氧核苷酸对血管平滑肌细胞增殖、迁移和凋亡的影响

为研究硫代磷酸修饰的反义c-myc寡脱氧核苷酸(ODN)对血管平滑肌细胞(SMC)的增殖、迁移及凋亡的影响。应用脂质体分别介导硫代磷酸修饰的反义c-mycODN、正义c-mycODN和错配c-mycODN进入体外培养的大鼠主动脉SMC内,观察其对SMC细胞c-myc表达、增殖、迁移和凋亡的影响。结果:①反义ODN降低c-myc蛋白的表达。②反义c-mycODN抑制SMC增殖、迁移,并诱导SMC凋亡。而正义ODN及错配ODN则无上述作用。结果提示:应用反义技术抑制c-myc表达在防治经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)术后再狭窄中具有潜在作用。     

解毒化瘀方对兔颈动脉球囊损伤后内膜增殖抑制作用的研究

目的通过建立兔颈动脉球囊损伤模型,应用解毒化瘀方灌胃治疗,观察解毒化瘀方对新生内膜增殖抑制的效果。方法将20只新西兰大白兔随机分为实验组和对照组,建立右侧颈动脉球囊损伤模型,实验组和对照组分别给予中药汤剂解毒化瘀方及生理盐水灌胃。28 d后取颈动脉标本,比较两组新生内膜厚度,新生内膜面积/中膜面积比值,以及行增殖细胞核抗原(PCNA)染色比较平滑肌细胞增殖程度。结果实验组新生内膜厚度、新生内膜面积/中膜面积分别明显小于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。实验组新生内膜及中膜PCNA染色阳性细胞比例均明显低于对照组,两组比较差异有统计学意义(P0.05)。结论解毒化瘀方能明显抑制兔颈动脉球囊损伤后血管平滑肌细胞增殖效应,抑制新生内膜的形成,减轻血管内再狭窄的程度。     

原位杂交技术检测增殖细胞核抗原反义寡脱氧核苷酸对BIU-87细胞体外增殖的影响

运用原位杂交技术检测脂质体介导增殖细胞核抗原(PCNA)反义寡脱氧核苷酸抑制人膀胱癌细胞BIU-87PCNA mRNA的表达水平.结果表明脂质体介导PCNA反义寡脱氧核苷酸处理组中BIU-87细胞PCNA mRNA的表达水平明显低于对照组.结果提示脂质体介导PCNA反义寡脱氧核苷酸可抑制人膀胱癌细胞BIU-87体外增殖活性,其抑制作用可通过阻断PCNA蛋白表达来实现.     

MMP-2反义寡脱氧核苷酸对人膀胱癌 BIU-87细胞株侵袭能力影响的初步研究

目的应用反义核酸技术,探讨阳离子脂质体介导的MMP-2反义寡脱氧核苷酸对膀胱癌细胞侵袭能力的影响。方法人工设计合成一段硫代修饰型互补于MMP-2的反义寡脱氧核苷酸序列(antisenes oligodeoxynucleotide,ASODN),并设计与其碱基组成相同,但碱基顺序随机排列的无义寡脱氧核苷酸序列(nonsense oligodeoxynucleotide,NS-ODN)作为对照。以阳离子脂质体介导将不同浓度的ASODN及NS-ODN转染至膀胱癌细胞系BIU-87细胞中,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测转染前后BI-U-87细胞中MMP-2mRNA表达;以四甲基偶氮唑蓝(MTT)试验检测细胞的增殖能力;采用MTT比色法与transwell小室侵袭试验相结合的方法测定肿瘤细胞的体外侵袭力。结果转染MMP-2ASODN可以显著降低BIU-87细胞中的MMP-2mRNA表达。MMP-2ASODN处理细胞24h,于1.0μmol/L的MMP-2ASODN浓度条件下即可显著抑制BIU-87细胞的体外侵袭,而且这种抑制作用随ASODN浓度的增加而增强。结论以MMP-2反义寡脱氧核苷酸阻遏MMP-2在膀胱癌BIU-87细胞株中表达可以成功地抑制BI-U-87细胞侵袭能力,提示应用反义核酸技术等方法抑制MMP-2活性可能可以应用于临床治疗膀胱癌。     

转录因子NF-kB对粘附分子及血管新生内膜形成的影响

目的以调节多种增殖因子的核转录因子NF-kB的反义和诱骗性寡核苷酸为干预药物,探讨它们单独或联合作用对大鼠颈动脉球囊损伤后血管增殖反应及粘附分子表达的影响. 方法SD大鼠随机分为七组,制作血管球囊损伤模型;相应时间点处死动物进行检测. 结果模型组、正义组、Scramble组的血管内膜面积、中膜面积、内膜/中膜在第5d增加,14d达到高峰;反义组、诱骗组、反义组+诱骗组干预后,血管上述病理指标明显改善(P<0.05).血管细胞间粘附分子(VCAM-1)mRNA表达在血管损伤后6h即可检测到,3、5、7d后持续表达增加,14d后表达降低;免疫组化显示VCAM-1蛋白质表达在14d达到高峰.反义组、诱骗组、反义组+诱骗组治疗后,与模型组、正义组、scramble组相比,VCAM-1 mRNA表达和蛋白合成在各时相点均降低(P<0.05).Western blot检测核蛋白抽提物,显示核因子NF-kB p65在血管损伤后6h有一定蛋白表达,1d后蛋白表达明显增加,至7d达高峰,14d后蛋白表达略降低.反义组、诱骗组、反义组+诱骗组干预后,各时相点蛋白质表达均减弱(P<0.05). 结论转录因子NF-kB调控VCAM-1基因表达和蛋白质合成;球囊损伤后血管壁细胞增殖在不同时相点有动态变化;脂质体介导局部转染反义、诱骗性寡核苷酸可抑制NF-kB激活对下游基因的调控,两者联合作用效果更为显著.     

原位杂交技术检测增殖细胞核抗原反义寡脱氧核苷酸对BIU—87细胞体外增殖的影响

运用原位杂交技术检测脂质体介导增殖细胞核抗原（PCNA）反义寡脱氧苷酸抑制人膀胱癌细胞BIU－87 PCNA mRNA的表达水平。结果表明脂质体介导PCNA反义寡脱氧核苷酸处理组中BIU－87细胞PCNA mRNA的表达水平明显低于对照组。结果提示脂质体介导PCNA反义寡脱氧核苷酸可抑制人膀胱癌细胞BIU－87体外增殖活性,其抑制作用可通过阻断PCNA蛋白表达来实现。     

反义EGFR寡核苷酸对血管紧张素Ⅱ促VSMC增殖的影响

目的探讨脂质体介导的反义表皮生长因子受体寡核苷酸基因转染对血管紧张素Ⅱ促大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响．方法用反义表皮生长因子受体寡核苷酸脂质体复合物转染Sprague—Dawley大鼠血管平滑肌细胞，通过RT—PCR、Western—Bloting分别检测转染后EGFRmRNA及蛋白的表达情况，用^3H—Tdr掺入率实验检测经反义表皮生长因子受体寡核苷酸转染再用血管紧张素Ⅱ刺激的血管平滑肌细胞的增殖情况，结果反义表皮生长因子受体寡核苷酸转染大鼠血管平滑肌细胞后，EGFRmRNA及蛋白的表达较正义组及对照组明显减少（P〈0．05）；用血管紧张素Ⅱ刺激后，反义组细胞的^3H—Tdr掺入较正义组及对照组明显降低，经方差分析两者有显著差异（P〈0．05），结论脂质体介导的反义表皮生长因子受体寡核苷酸转染减弱了血管紧张素Ⅱ的促血管平滑肌细胞增殖效应，证明了表皮生长因子受体在血管紧张素Ⅱ促血管平滑肌细胞增殖中起重要作用．     

脂质体-c-raf-1反义寡核苷酸治疗人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤

目的:探讨c-raf-1反义寡脱氧核苷酸(ASSODN)对人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的治疗作用.方法:将15只裸鼠建立人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型,然后随机分成3组予以不同条件处理:对照组(腹腔注射转染液和脂质体),正义治疗组(腹腔注射脂质体-c-raf-1-SODN),反义治疗组(腹腔注射脂质体-c-raf-1-ASODN).治疗期间定期观测裸鼠体重并测量肿瘤体积,计算抑瘤率及肿瘤缩小率.结果:反义治疗组与正义治疗组的抑瘤率分别为68.1%和6.8%,反义治疗组肿瘤缩小率为16.7%,与正义治疗组相比较有明显的差别.各组裸鼠体重变化无明显差别.结论:脂质体-c-raf-1-ASODN对人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤有一定的治疗价值,可能成为日后基因治疗的重要方向.     

反义c-myc寡脱氧核苷酸对家兔髂总动脉损伤后内膜增生的影响

目的：观察反义c-myc寡脱氧核苷酸(ASODN)对家兔髂总动脉损伤后内膜增生的影响，探讨其防治再狭窄的潜在作用。方法：通过pluronic gel缓释系统和Lipofeclin转染导入系统，将c-myc ASODN作用于家兔髂总动脉损伤后的血管外膜，3周后对所取的血管节段进行组织切片和苏木精-伊红染色，在显微镜下进行形态学观察，并采用图像分析系统进行图像分析，计算出内膜，中膜(I/M)面积比和I／M厚度比，并进行统计学处理。结果：c-myc ASODN可明显抑制内膜增生，而正义c-myc ODN对内膜增生无影响。结论：c-myc ASODN以序列特异性方式抑制了新生内膜的形成。