人胶质瘤细胞及组织中miRNA-221、miRNA-222表达变化及意义

目的观察人胶质瘤细胞及组织中miRNA-221、miRNA-222的表达变化,探讨其与肿瘤放射敏感性的相关性。方法根据Trizol试剂盒说明书,从体外培养的人胶质瘤细胞系U87、U251、A172、LN229和60例胶质瘤组织(手术切除获得)中提取其总RNA,采用RT-PCR法测定miRNA-221及miRNA-222,以正常脑组织为对照。60例胶质瘤患者术后均予以放疗,治疗后MRI检查随访,分析胶质瘤患者的放疗疗效。采用克隆形成实验测算X线照射后(照射剂量为2 Gy)的胶质瘤细胞存活率(SF),以胃黏膜上皮细胞(ges)为对照。结果与对照组织及细胞相比,胶质瘤组织及细胞中miRNA-221、miRNA-222呈高表达(P<0.05),其中高度恶性胶质瘤组织中miRNA-221、miRNA-222均明显高于低度恶性者(P<0.05)。X线照射后胶质瘤细胞SF明显高于ges(P均<0.05),胶质瘤各细胞中miRNA-221、miRNA-222表达量与X线照射后胶质瘤SF呈正相关(r=0.673、0.696,P均<0.01)。胶质瘤组织中miRNA-221、miRNA-222高表达的患者较低表达者生存时间短(P均<0.05)。结论人胶质瘤细胞及组织中miRNA-221、miRNA-222均呈高表达。miRNA-221、miRNA-222表达量与胶质瘤细胞的放射抗性呈正相关关系,胶质瘤组织中miRNA-221、miRNA-222表达量与患者生存时间呈负相关关系。     

siRNA靶向干扰APE1基因对脑胶质瘤细胞增殖凋亡及放疗敏感性的影响

目的观察小干扰RNA(siRNA)干扰脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(APE1)基因表达对脑胶质瘤细胞增殖与凋亡及其对放射治疗敏感性的影响。方法将含有APE1siRNA的表达质粒分别稳定转染人脑胶质瘤细胞U251细胞系和U87细胞系,并用G418筛选阳性克隆,应用Western blot杂交检测APE1的表达变化,MTT法及AO/EB染色观察脑胶质瘤细胞的增殖与凋亡情况,给予不同放射剂量照射后应用MTT法绘制细胞存活曲线。结果转染后,Western blot检测显示APE1siRNA组的APE1表达较阴性对照组及空载体组降低;MTT法显示APE1siRNA组中的细胞生长受抑明显;AO/EB染色显示APE1siRNA组的凋亡率较阴性对照组及空载体组高;MTT法显示APE1siRNA组照射后对放疗的敏感性增加。结论 APE1siRNA靶向干扰了APE1蛋白的表达,对脑胶质瘤细胞具有抑制增殖和促进凋亡的作用,还可以提高对放疗的敏感性。     

脑胶质瘤干细胞的体外培养与生物学特性观察

目的体外培养人脑胶质瘤干细胞并观察其生物学特性。方法应用无血清培养技术,从手术中获取的人脑胶质瘤组织培养得到肿瘤干细胞,诱导其分化后与原肿瘤组织细胞进行比较。应用细胞免疫荧光技术鉴定肿瘤干细胞表面标志物。结果分别在间变性星形细胞瘤和胶质母细胞瘤中培养得到悬浮生长的肿瘤干细胞球,其能在体外自我更新、增殖,形成新的克隆性细胞球,保持连续稳定的传代,能表达神经干细胞表面标志物CD 133。在含血清培养基中能够分化为与原肿瘤组织相似的贴壁生长的细胞。结论人脑胶质瘤中存在一定量的肿瘤干细胞,能够自我更新增殖、诱导分化、表达干细胞标志物CD 133。为探讨脑胶质瘤的发病机制奠定了基础。     

胃癌干细胞的分离鉴定以及干细胞特性研究

背景:肿瘤干细胞(CSCs)已成为当前肿瘤研究的热点之一,开展相关研究的首要问题是CSCs的分离和鉴定,悬浮培养法是分离CSCs的重要方法。目的:分离、鉴定胃癌干细胞(GCSCs)并评价其干细胞特性。方法:人胃癌细胞株MKN45、MGC803、SGC7901以含表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的无血清培养基悬浮培养。对培养得到的第三代肿瘤球,以集落形成实验检测其克隆形成能力,免疫荧光法检测GCSCs标记物,细胞划痕实验和Transwell小室细胞侵袭实验检测其迁移、侵袭能力,CCK-8实验检测其对顺铂的耐药性。结果:培养得到的肿瘤球高表达干细胞标记物CD44、CD54,低表达胃壁细胞标记物H+/K+-ATPase,克隆形成能力、划痕愈合速度和Transwell小室穿膜细胞数明显大于或多于普通胃癌细胞,差异有统计学意义(P0.05)。顺铂对肿瘤球的50%抑制浓度明显高于普通胃癌细胞。结论:应用无血清培养基悬浮培养法能成功获得GCSCs富集的肿瘤球;肿瘤球具有较强的自我更新、增殖、迁移、侵袭能力和多向分化潜能,对化疗药物更易产生耐药性。     

人脑胶质瘤干细胞的培养及分离方法

目的探讨人脑胶质瘤干细胞的培养和分离方法。方法取脑胶质瘤手术标本,制成单细胞悬液用无血清培养基培养,加入表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）进行诱导分化;用免疫组化法检测巢蛋白（Nestin）和胶质原性纤维酸蛋白（GFAP）;用免疫磁珠分选系统进行细胞分离,流式细胞仪检测分化前后CD133阳性细胞的比率。结果培养出悬浮生长的人脑胶质瘤干细胞球,Nestin表达呈阳性,分化后GFAP表达呈阳性;分离前CDm阳性细胞百分比为4．66％±0．55％,分离后为87．21％±6．17％,P〈0．05。结论无血清培养法、免疫磁珠分选系统可成功培养和分离人脑胶质瘤干细胞。     

靶向EGFR基因的shRNA对胰腺癌细胞放疗敏感性的增强作用

目的 探讨表皮生长因子受体(EGFR)基因对胰腺癌细胞放疗敏感性的增强作用.方法 构建针对EGFR基因序列特异性shRNA的表达载体,用脂质体转染胰腺癌PANC-1细胞,G418筛选建立稳定克隆,采用RT-PCR、Western印迹检测EGFR基因的抑制情况.采用不同剂量X线照射瘤细胞后,用MTT法检测细胞凋亡率,集落形成实验检测细胞集落形成能力,观察胰腺癌细胞对放疗的敏感性.结果 靶向EGFR的序列特异性shRNA可明显抑制EGFR基因的表达,EGFR mRNA和蛋白的抑制率分别为76.3%和71.4%;细胞凋亡增加(P<0.01),克隆形成率减少(P<0.01).结论 体外实验证实靶向EGFR的序列特异性shRNA可明显提高胰腺癌的放疗敏感性.     

miR-34c-3p调控脑胶质瘤细胞增殖、分化、凋亡的机制研究

目的探讨miR-34c-3p调控脑胶质瘤U87细胞增殖、分化、凋亡的机制。方法用脂质体分别将miR-34c-3p mimics和miR-34c-3p inhibitors转入U87细胞中,用RT-PCR检测转染效果;用MTT检测转染miR-34c-3p对U87细胞增殖的影响;用平板克隆法检测转染miR-34c-3p对U87细胞分化的影响;用流式细胞仪检测转染miR-34c-3p对U87细胞凋亡的影响;通过Pic Tar、miRanda和Target Scan靶基因预测库预测miR-34c-3p的靶基因,用双荧光素酶表达系统进行靶基因鉴定,RT-PCR检测转染miR-34c-3p对靶基因mRNA表达的影响,Western-blot检测转染miR-34c-3p对靶基因蛋白表达的影响。结果 miR-34c-3p在U87细胞中的表达显著低于正常胶质细胞,转染miR-34c-3p mimics后,U87细胞miR-34c-3p mRNA的表达上调,细胞存活率降低,细胞形成克隆的能力下降,细胞凋亡率升高,与对照组相比均具有显著性差异;转染miR-34c-3p inhibitors后,U87细胞miR-34c-3p mRNA表达量下降,细胞存活率显著升高,细胞形成克隆的能力上升,细胞凋亡率下降,与对照组相比差异均具有显著性。靶基因库预测Notch2是miR-34c-3p的靶基因,转染miR-34c-3p mimics后,Notch2的mRNA表达和蛋白表达下降,转染miR-34c-3p inhibitors后,Notch2的mRNA表达和蛋白表达上升,共转染miR-34c-3p mimics和wt Notch2后荧光素酶活性显著降低,与对照组相比均具有显著性差异。结论 miR-34c-3p通过靶基因Notch2抑制脑胶质瘤U87细胞的增殖、分化,促进细胞凋亡。     

内质网应激对γ射线照射诱导肿瘤细胞死亡的影响

目的探讨内质网应激反应下肿瘤细胞对辐射敏感性的影响。方法将人宫颈癌HeLa细胞置于^60Co设备行γ射线照射;采用反转录PCR方法检测内质网应激反应标志分子X盒结合蛋白1（XBP1）mRNA剪切;细胞克隆形成试验检测内质网应激反应剂二硫苏糖醇（DTT）作用后对HeLa细胞的生存变化。结果DTT作用后XBP1 mRNA出现剪切;克隆形成试验发现HeLa细胞存活率明显提高。结论在内质网应激反应下,增加肿瘤细胞的辐射抵抗性。     

胶质瘤干细胞的内皮分化和管腔形成能力

目的探讨胶质瘤干细胞内皮分化和形成管腔的能力。方法以含有10%胎牛血清的DMEM培养液培养U87人脑胶质母细胞瘤细胞,再用免疫磁珠法结合"悬浮克隆球形成法"分离胶质瘤干细胞,先行形态学观察,然后采用免疫荧光方法检测CD133、Nestin和GFAP表达,鉴定胶质瘤干细胞。将分离所得的胶质瘤干细胞在添加20μg/ml血管内皮生长因子(VEGF),1μg/ml FGF和2μg/ml胰岛素样生长因子(IGF)的10%DMEM培养基中诱导培养,分别取培养3 d和7 d的细胞进行Western印迹检测内皮特定蛋白的表达。同时将诱导培养7 d的细胞接种于涂有Matrigel的24孔板中,12 h和24 h后于倒置显微镜下观察并采集图像。结果免疫磁珠法结合"悬浮克隆球形成法"分离出的胶质瘤细胞团呈现明显的CD133和Nestin免疫荧光染色,但GFAP未显示荧光染色;Western印迹检测发现被诱导的胶质瘤干细胞随着时间延长,CD133的表达逐渐减弱直至消失,而CD31和v WF表达由弱到强;Matrigel结果显示被诱导7 d的胶质瘤干细胞明显形成了完整的管腔。结论胶质瘤干细胞在内皮细胞生长条件下,可以分化为内皮样细胞并且具有形成管腔的能力。     

靶向乳腺癌干细胞DC瘤苗的核酸抗原制备

摘要 目的：应用无血清培养基细胞球培养法富集MCF-7乳腺癌干细胞,制备乳腺癌干细胞mRNA核酸抗原,为制备靶向乳腺癌干细胞树突细胞瘤苗奠定基础。方法：应用无血清培养基悬浮培养法富集MCF-7乳腺癌细胞,经单克隆形成、表面标志检测、NOD-SCID小鼠成瘤等实验对其肿瘤干细胞特性进行鉴定后,利用T7 mMESSAGE mMACHINE试剂盒进行mRNA体外扩增。结果：乳腺癌细胞MCF-7在无血清培养基中可形成悬浮状细胞球,其中具有CD44+CD24-表面标志的细胞约占90.16%。该细胞亚群具有较贴壁细胞更强的克隆形成能力和低剂量体内成瘤能力。细胞总RNA经体外扩增获得的mRNA,可作为核酸抗原。结论：应用无血清悬浮细胞球培养法可以获得高含量乳腺癌干细胞。通过体外扩增方法获得该细胞亚群的mRNA,可作为肿瘤核酸抗原,为下一步制备靶向乳腺癌干细胞的树突细胞瘤苗奠定了基础。     

无血清悬浮法培养结肠癌HT29细胞系及肿瘤干细胞样亚群筛选

目的:研究无血清培养基悬浮培养人结肠癌细胞系HT29,筛选并鉴定HT29结肠癌细胞系中肿瘤干细胞相关亚群。方法:通过无血清培养基筛选结肠癌细胞系肿瘤干细胞相关亚群。应用克隆形成实验、表面标志检测、双苯酰亚胺(Hoechst)33342染色检测来确定培养细胞中肿瘤干细胞比例及其培养后的肿瘤干细胞含量变化。结果:结肠癌细胞系HT29中约50%的肿瘤细胞在无血清培养基中能够存活、增殖,形成自由飘浮的细胞球。细胞球可连续传代,若重新接种于含血清培养基中可重新贴壁分化,分化后细胞与培养储存的HT29细胞形态无明显差异。流式细胞仪检测表面标志,HT29细胞系中CD44+细胞含量为(44.18±2.18)%,而细胞球中CD44+细胞含量为(83.41±11.21)%;双苯酰亚胺33342染色检测提示HT29中侧群(sidepopulation,SP)细胞含量为(3.82±0.08)%,而细胞球中含量明显增高。结论:结肠癌细胞系HT29可在含生长因子的无血清培养基中悬浮生长,并维持细胞系。该细胞系中含有一定比例的具有增殖和自我更新能力的结肠癌干细胞样细胞亚群。表面标志以及双苯酰亚胺33342检测差异提示细胞球中仅部分细胞具有干细胞的功能。     

表皮生长因子及其受体对结肠癌干细胞的增殖调控

背景：肿瘤干细胞是肿瘤组织中一小部分具有自我更新、多向分化以及高度增殖能力的肿瘤细胞。研究发现表皮生长因子（EGF）可促进肿瘤干细胞增殖。目的：探讨EGF及其受体（EGFR）在结肠癌干细胞增殖调控中的作用。方法：结肠癌细胞株HT29、HCTll6培养于无血清培养基中,以EGF、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、胰岛素样生长因子（IGF）分别干预细胞。MTT11法检测EGFR抑制剂吉非替尼对结肠癌细胞球细胞的增殖抑制作用,体外实验检测EGFR抑制剂吉非替尼、PDl53035对细胞球形成的抑制作用,流式细胞术检测细胞凋亡。体内实验检测结肠癌细胞球和细胞株的成瘤能力,real、timePCR检测两者干细胞标记LGR5、Musashi-1和分化标记CK20表达。结果：EGF组HCT116细胞形成的细胞球数量显著高于空白对照、bFGF、IGF组（P〈0．05）。吉非替尼能抑制HCT116细胞球细胞增殖和细胞球形成,并诱导细胞凋亡,作用呈浓度依赖性。HCT116细胞球成瘤时间较细胞株显著缩短,移植瘤体积显著增大（P〈0．05）。LGR5、Musashi-1在细胞球中的表达显著高于细胞株,而CK20在细胞株中的表达显著高于细胞球（P〈0．05）。结论：EGF对结肠癌细胞株HCTll6、HT29形成细胞球具有促进作用。EGFR抑制剂可抑制结肠痛细胞球增殖并诱导细胞凋亡,相关作用可能与调控LGR5、Musashi-1和CK20表i大有关。     

Sphere-forming cell subpopulations with cancer stem cell properties in human hepatoma cell lines

Background

Cancer stem cells (CSCs) are regarded as the cause of tumor formation and recurrence. The isolation and identification of CSCs could help to develop novel therapeutic strategies specifically targeting CSCs.

Methods

Human hepatoma cell lines were plated in stem cell conditioned culture system allowed for sphere forming. To evaluate the stemness characteristics of spheres, the self-renewal, proliferation, chemoresistance, tumorigenicity of the PLC/PRF/5 sphere-forming cells, and the expression levels of stem cell related proteins in the PLC/PRF/5 sphere-forming cells were assessed, comparing with the parental cells. The stem cell RT-PCR array was performed to further explore the biological properties of liver CSCs.

Results

The PLC/PRF/5, MHCC97H and HepG2 cells could form clonal nonadherent 3-D spheres and be serially passaged. The PLC/PRF/5 sphere-forming cells possessed a key criteria that define CSCs: persistent self-renewal, extensive proliferation, drug resistance, overexpression of liver CSCs related proteins (Oct3/4, OV6, EpCAM, CD133 and CD44). Even 500 sphere-forming cells were able to form tumors in NOD/SCID mice, and the tumor initiating capability was not decreased when spheres were passaged. Besides, downstream proteins DTX1 and Ep300 of the CSL (CBF1 in humans, Suppressor of hairless in Drosophila and LAG1 in C. elegans) -independent Notch signaling pathway were highly expressed in the spheres, and a gamma-secretase inhibitor MRK003 could significantly inhibit the sphere formation ability.

Conclusions

Nonadherent tumor spheres from hepatoma cell lines cultured in stem cell conditioned medium possess liver CSC properties, and the CSL-independent Notch signaling pathway may play a role in liver CSCs.     

脐血干细胞与骨髓干细胞联合移植治疗大鼠急性肝衰竭实验研究

目的：观察脐血干细胞和自体骨髓干细胞共同移植治疗D-半乳糖苷所致急性肝衰竭大鼠的疗效。方法采集大鼠脐血和骨髓中单个核细胞,以促肝细胞生长因子和干细胞因子培养3w,采用免疫细胞化学法检测白蛋白和甲胎蛋白表达情况;以D-半乳糖苷腹腔注射法建立大鼠急性肝衰竭模型,24 h后每日经鼠尾静脉分别注入脐血干细胞,或骨髓干细胞,或混合的脐血干细胞和骨髓干细胞,对照组注射等量生理盐水,治疗7d,观察4组大鼠存活率、肝功能和肝组织病理学变化。结果在促肝细胞生长因子及干细胞因子的诱导下,脐血干细胞和骨髓干细胞可以在体外扩增并分化为肝细胞;脐血干细胞移植、骨髓干细胞移植和联合细胞移植组大鼠9d 存活率分别为55.6%、50.0%和77.8%,均明显高于生理盐水对照组（16.7%,P〈0.01）;联合移植组存活率高于任何一种单纯干细胞移植（P〈0.01）。结论脐血干细胞和骨髓干细胞移植对大鼠急性肝损伤有一定的保护作用,两者联合移植有协同作用。     

The expression of Wnt-inhibitor DKK1 (Dickkopf 1) is determined by intercellular crosstalk and hypoxia in human malignant gliomas

Objective

Wnt signalling pathways regulate proliferation, motility and survival in a variety of human cell types. Dickkopf 1 (DKK1) gene codes for a secreted Wnt inhibitory factor. It functions as tumour suppressor gene in breast cancer and as a pro-apoptotic factor in glioma cells. In this study, we aimed to demonstrate whether the different expression of DKK1 in human glioma-derived cells is dependent on microenvironmental factors like hypoxia and regulated by the intercellular crosstalk with bone-marrow-derived mesenchymal stem cells (bmMSCs).

Methods

Glioma cell line U87-MG, three cell lines from human glioblastoma grade IV (glioma-derived mesenchymal stem cells) and three bmMSCs were selected for the experiment. The expression of DKK1 in cell lines under normoxic/hypoxic environment or co-culture condition was measured using real-time PCR and enzyme-linked immunoadsorbent assay. The effect of DKK1 on cell migration and proliferation was evaluated by in vitro wound healing assays and sulphorhodamine assays, respectively.

Results

Glioma-derived cells U87-MG displayed lower DKK1 expression compared with bmMSCs. Hypoxia led to an overexpression of DKK1 in bmMSCs and U87-MG when compared to normoxic environment, whereas co-culture of U87-MG with bmMSCs induced the expression of DKK1 in both cell lines. Exogenous recombinant DKK1 inhibited cell migration on all cell lines, but did not have a significant effect on cell proliferation of bmMSCs and glioma cell lines.

Conclusion

In this study, we showed for the first time that the expression of DKK1 was hypoxia dependent in human malignant glioma cell lines. The induction of DKK1 by intracellular crosstalk or hypoxia stimuli sheds light on the intense adaption of glial tumour cells to environmental alterations.     

人C-kit阳性心脏干细胞离子通道特性

目的研究不同人来源的人左心耳组织培养的c-kit＋（CD117）心脏干细胞（c-kit＋CSCs）的离子通道的表达情况,进一步了解心脏干细胞的电生理特性,为临床干细胞移植的安全性提供参考。方法通过分离筛选培养人c-kit＋CSCs,运用全细胞膜片钳和定量反转录聚合酶连锁反应（qRT-PCR）技术,检测人c-kit＋CSCs的通道电流和MaxiK基因、HNE-Na基因、CACNA1G基因、Kv4.2基因、CACNA1C基因的表达情况。结果在人c-kit＋CSCs上,记录到了人电压依赖性Ca2＋激活K＋电流,检测到MaxiK基因表达相对较高,HNE-Na基因、CACNA1G基因表达尚可,Kv4.2基因通道的表达相对较低,未见CACNA1C基因的表达。结论人c-kit＋CSCs表达多种离子通道的相关基因,能记录到人电压依赖性Ca2＋激活K＋电流,这与其基因的高表达是相一致的。     

胰腺癌肿瘤干细胞的悬浮培养法

目的 建立无血清悬浮培养分离人胰腺癌细胞系PANC1干细胞球的方法.方法 采用无血清悬浮法培养PANC1细胞,显微镜下观察干细胞球形成率;流式细胞仪检测细胞CD133表达和细胞周期;以含10%FBS培养基诱导干细胞球细胞分化,荧光显微镜下观察细胞形态及CK18的表达;干细胞球细胞接种NOD/SCID小鼠皮下,观察其成瘤能力.结果 在无血清悬浮培养条件下存活的PANC1细胞形成干细胞球,体外连续传代培养20代始终保持4%0～5%0的干细胞球形成率.干细胞球细胞CD133表达率(5.91±0.7)%,G0/G1期细胞占(80.99±2.60)%,与原代PANC1细胞的(1.44±0.52)%和(69.01±5.03)%相差显著(P＜0.05).将于细胞球细胞置含血清培养基中培养.细胞逐渐恢复原代细胞形态,并表达上皮标志蛋白CK18,2×103的干细胞即在NOD/SCID小鼠皮下成瘤.结论 无血清悬浮法培养PANC1细胞可分离出肿瘤干细胞,其具有自我更新、多向分化和成瘤能力.     

人参皂甙Rh2对人脑胶质瘤细胞株U251凋亡的影响及机制探讨

目的观察人参皂甙Rh2（GS-Rh2）对人脑胶质瘤细胞株U251凋亡的影响,并探讨其机制。方法人脑胶质瘤细胞株U251经GS-Rh2处理后,采用MTT法测算细胞抑制率,用流式细胞术测算细胞凋亡率,用RT-PCR检测U251中Bcl-2、Caspase-3 mRNA,用Western blot法检测U251中Bcl-2、Caspase-3蛋白。结果 GS-Rh2对U251具有抑制作用,并呈剂量依赖性;根据细胞增殖抑制曲线计算出GS-Rh2作用于细胞的抑制浓度（IC）,求得IC30、IC50、IC70值分别为10.6、22.3、70.2μg/ml;GS-Rh2可诱导U251凋亡,并呈剂量依赖性。在GS-Rh2作用下,U251中Bcl-2 mRNA、蛋白呈明显低表达,随着GS-Rh2作用时间延长,Caspase-3 mRNA、蛋白表达逐渐增高。结论 GS-Rh2可明显抑制U251增殖,诱导其凋亡,其机制与GS-Rh2下调U251中Bcl-2 mRNA及蛋白表达、上调Caspase-3 mRNA及蛋白表达有关。