反转录—聚合酶链反应在呼吸道合胞病毒感染检测的应用

为呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）感染的临床诊断寻求敏感，特异的检测方法，采用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增毒培养液和急性呼吸道感染患者鼻咽分泌物中的ＲＳＶ基因，并应用地高辛标记ｃＤＮＡ探针对扩增产物进行鉴定。结果成功地提取了ＲＳＶｍＲＮＡ，反转录合成ｃＤＮＡ，经扩增得到４７１ｂｐ左右ｃＤＮＡ区带。流感病毒Ｂ，副流感病毒２型，腺病毒７对照无扩增带，ＲＳＶ培养液１０倍连续稀释至１：１０００，经ＲＴ－ＰＣＲ扩增仍可见４     

黑色素瘤抗原-1基因在肝细胞癌中的表达

目的 检测黑色素瘤抗原－１（ＭＡＧＥ－１）ｍＲＮＡ在肝细胞癌（ＨＣＣ）中的表达,为用ＭＡＧＥ－１基因编码蛋白作为疫苗对ＨＣＣ患者进行免疫治疗提供依据。方法 用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法对４５例ＨＣＣ患者组织和相应癌旁肝组织以及１６例肝硬化组织和１２例正常肝组织的ＭＡＧＥ－１ｍＲＮＡ表达情况进行了研究,对６例ＲＴ－ＰＣＲ扩增产物的目的基因片段进行ＤＮＡ序列测定,并以测序证实为ＭＡＧＥ－     

抗CD4单克隆抗体可变区基因克隆及测序

目的：获取抗ＣＤ４单克隆抗体（ＭｃＡｂ）可变区基因，为构建抗ＣＤ４嵌合抗体打下基础。方法 从分泌抗人ＣＤ４ ＭｃＡｂ的杂交瘤细胞系中提取总ＲＮＡ，用家族特异性引物进行逆转录多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ），分别扩增出重链可变区（ＶＨ）基因及轻链可变区（ＶＬ）基因。将ＰＣＲ产物克隆至ｐＧＥＭ－Ｔ载体，然后转化ＪＭ１０９细菌。并用全自动 ＤＮＡ序列分析仪对ＶＨ及ＶＬ基因序列进行测定。结果：ＶＨ基因为３５１     

血小板激活因子受体mRNA在小鼠附睾精子内的表达

目的 检测血小板激活因子受体（ＰＡＦＲ）ｍＲＮＡ在小鼠附睾精子内的表达,探讨ＰＡＦＲ对受精过程的影响。２方法 分离提高小鼠附睾精子ｍＲＮＡ,经逆转录（ＲＴ）合成ＰＡＦＲ－ｃＤＮＡ。利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增ＰＡＦＲ－ｃＤＮＡ,ＤＮＡ序列分析验证扩增产物的准确性。结果 小鼠附睾精子表达ＰＡＦＲ－ｍＲＮＡ;ＤＮＡ序列分析验证ＰＣＲ产物的小鼠ＰＡＦＲ－ｃＤＮＡ。④结论 小鼠附睾精子有ＰＡＦＲ－ｍＲＮ     

PCR扩增杂交试验检测HCV-RNA

目的：评价ＰＣＲ扩增杂交试验（ＰＣＲ－Ｈｙｂ）在ＨＣＶ－ＲＮＡ检测中的应用。方法：对２８例丙型肝炎患者和５例非丙型肝炎患者采用ＰＣＲ扩增杂交（ＰＣＲ－Ｈｙｂ）试验、套式ＲＴ－ＰＣＲ及ｂＤＮＡ信号扩增试验检测ＨＣＶ－ＲＮＡ。结果：三种方法的阳性率分别为７１．３４％（２０／２８）、７８．５７％（２２／２８）、１００％（２７／２７）。ＰＣＲ－Ｈｙｂ与套式ＲＴ－ＰＣＴ的阳性符合率为９３．９３％（３１／３３），与ｂＤＮＡ结果呈现较好的相关性（ｒ＝０．８０８３）。结论：ＰＣＲ－Ｈｙｂ具有较好的特异性和敏感性，并在抗病毒治疗时的动态观察有一定价值。     

HFRS患者血清中HV-RNA的PCR检测及扩增产物的测序分析

目的 探讨ＲＴ－ＰＣＲ用于ＨＦＲＳ临床标本中病毒基因检测的若干影响因素及西安地区近年主要浒汉坦病毒（ＨＶ）毒株的分子流行病学特点。方法 设计合成了两套分别互补于ＨＶ Ｍ基因片段和Ｓ基因片段的引物,建立了检测ＨＦＲＳ患临床血清标本中ＨＶ基因的ＲＴ－ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ方法,并对扩增的部分ＨＶ靶基因进行了测序分析和比较,结果 １１９份ＨＦＲＳ患轿清（经临床和ＩＦＡ确诊）经用Ｓ基因片段引物的ＲＴ－ｎ     

甲肝病毒减毒活疫苗（H2株）的cDNA克隆及序列分析

本文通过ｍＲＮＡ提取，逆转灵（ＲＴ）－聚合酶链反应（ＰＣＲ），获得甲肝病毒减毒活疫苗株（Ｈ２减毒株）的ｃＤＮＡ片段，再经分子克隆，从而得到贯穿甲肝病毒（ＨＡＶ）全基因组的１０个相互重叠基因片段的ｃＤＮＡ克隆。经双脱氧末端终止法进行核苷酸序列分析，得到了长度为７４７３ｂｐ的甲肝病毒减毒活疫苗株（Ｈ２减毒株）ｃＤＮＡ全序列。计算机分析表明，该株与野毒株ＨＭ１７５的核苷酸和氨基酸同源性分别为９９．４％和     

RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 Mrna

目的 建立一种检测先天性人巨细胞病毒感染胎鼠大脑皮质内皮素－１（ＥＴ－１）ｍＲＮＡ的方法。方法 采用逆转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法并对实验条件进行优化。建立稳定的检测体系后,对胎鼠大脑皮质ＥＴ－１ ｍＲＮＡ进行检测,并以ＲＴ－ＰＣＲ后产物的ＯＤ值来反映起初ＥＴ－１ ｍＲＮＡ的模板相对含量。结果 在一定ＴａｐＤＮＡ酶、镁离子浓度、引物浓度等条件下,ＥＴ－１ ｍＲＮＡ经ＲＴ－ＰＣＲ扩增后产     

T细胞受体Vβ6,7,8基因选择性识别单纯疱疹病毒的表达和特征

本研究用变异ＨＳＶ、ＨＳＶ及ＰＨＡ分别刺激正常成人ＰＬＢｓ，培养４－６天后，提取ｍＲＮＡ，并采用ＲＴ－ＰＣＲ检测法，测定ＴＣＲＶβ基因表达水平，发现ＴＣＲＶβ６、７、８基因在体外选择性扩增，在采用ＨＳＶ攻击－静止－再攻击时，发现ＴＣＲＶβ基因表达变化随着抗原刺激的阶段不同有所改变，这显示了ＴＣＲＶβ基因的变化是绝对特异性的。     

重组人单链白细胞介素12融合基因（rhscIL—12）的构建和真？…

目的 克隆人ＩＬ－１２（ｈＩＬ－１２）ｐ４０和ｐ３５亚单位ｃＤＮＡ，构建人单链ＩＬ－２（ｒｈｓｃＩＬ－２）融合基因，并在哺乳动物细胞中进行表达。方法从经ＰＤＢｕ刺激的ＥＢＶ转化的人Ｂ淋巴细胞株ＮＣ３７中提取ｍＲＮＡ，经ＲＴ－ＰＣＲ分别获得ｈＩＬ－１２ｐ４０和ｐ３５亚单位编码序列的ｃＤＮＡ，运用重组ＰＣＲ技术将两段基因通过一疏水性多肽接头（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ＤＮＡ序列进行体外基因重组，构建ｒｈｓｃＩ     

抗人卵巢癌抗体可变区cDNA的克隆与ScFv的构建和表达及放射免疫显像

目的:为研究小分子抗体作为导向载体的作用,制备抗人卵巢癌单克隆抗体COC183B2的单链抗体(single chain Fv,ScFv),并进行放射免疫显像(radioimmunoimaging,RⅡ).方法:利用PCR技术从COC183B2杂交瘤细胞中扩增COC183B2重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),并将其克隆入高效表达载体pTHA90中.重组子转化大肠杆菌TOP10,IPTG诱导表达ScFv融合蛋白,经改进氯化亚锡法进行99mTc标记,在卵巢癌裸鼠皮下瘤模型上进行RⅡ.结果:(1)ScFv融合蛋白以包涵体形式获高效表达;(2)改进氯化亚锡法成功进行小分子抗体ScFv 99mTc的标记,标记率达98%;(3)应用99mTc标记ScFv融合蛋白进行RⅡ,肿瘤显像早,图像清晰.结论:应用单链抗体ScFv可改善RⅡ.     

抗血管内皮生长因子165抗体轻重链可变区基因的克隆与？…

获得抗血管内皮生长因子１６５抗体的轻重链可变区基因。方法从分泌具有中和抗血管皮生长因子１６５活性的单抗杂交瘤细胞株Ｖｍｄ１１中提取总ＲＮＡ，经ＲＴ－ＰＣＲ扩增并克隆该单抗的轻，重链可变区基因并进行序列分析。     

载脂蛋白H单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备及鉴定载脂蛋白H Aport单克隆抗体。方法从人血清中分离纯化Aport免疫小鼠后取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经筛选出两株杂交瘤细胞株2C5和3H4，制备腹水后，用硫酸胺沉淀等方法纯化。获得Aport单抗。结果两株细胞产生的单抗皆属于IgG1，与其它载脂蛋白无交叉反应，细胞株连续传代3个月仍能稳定分泌Aport单抗，且效价稳定。结论2C5和3H4两株细胞能分泌合格的Aport单抗。     

甲型肝炎病毒单克隆抗体细胞株的建立及鉴定

目的 探讨建立和鉴定甲型肝炎(HAV)病毒单克隆抗体(McAb)细胞株的方法,为临床提供抗体来源.方法 通过McAb杂交瘤细胞培养方法进行甲型肝炎病毒单克隆抗体细胞株的培养后,选取实验培养的具有稳定性的McAb杂交瘤细胞后编号,对各细胞株进行特异性、效价的测定,并进行比对.结果 McAb杂交瘤细胞与甲肝病毒抗原的结合特...     

抗HBs单克隆抗体Fv段基因的克隆及其表达

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）获得抗－ＨＢｓ单克隆抗体Ｆｖ段轻、重链基因，经连接后形成一条单链含轻、重链的Ｆｖ基因（ＳｃＦｖ），并在重组－噬菌体－抗体系统（ＲＰＡＳ）中获得表达，用酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）证明表达的Ｆｖ段具有特异性抗原结合活性。     

抗猪鼻支原体单克隆抗体的制备与鉴定

目的：制备抗猪鼻支原体(M．hyorhinis,M.hy)的单抗隆抗体(monoclonal antibody,McAb)，为相关研究提供工具。方法：用灭活的猪鼻支原体免疫BALB／c小鼠，运用传统的细胞融合技术制备抗猪鼻支原体单克隆抗体。单抗鉴定采用酶联免疫吸附实验(ELISA)和免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)方法。结果：经ELISA筛选获得了一株抗猪鼻支原体的单克隆抗体，该抗体亚类为IgG2b。ELISA结果表明该单抗仅与猪鼻支原体反应而与肺炎支原体和发酵支原体不反应。用经PCR检测支原体阳性的胃癌切片做免疫组化，结果显示，该抗体能与PCR阳性的胃癌组织切片产生特异性反应。结论：获得一株抗猪鼻支原体特异性单克隆抗体，可为相关研究提供工具。     

基因重组人粒细胞集落细胞刺激因子单克隆抗体的制备及特性

采用高效免疫方法，利用rhG－CSF免疫BALB／C小鼠，经过两次融合制备了3株抗rhG－CSF的单克隆抗体，分别命名为1H11、2B3、2C3；抗体类型均为IgG2a。免疫印迹试验证明为特异性抗G－CSF的单克隆抗体；单抗相加试验和单抗竞争试验表明3株单抗针对G－CSF两具不同的抗原决定簇；中和试验表明2B、2C3识别的位点与G－CSF刺激NFS－60细胞增殖活性有关。     

抗CRF单克隆抗体制备及鉴定

本文报道了应用促肾上腺皮质激素释放因子（ＣＲＦ）在碳化二亚胺作用下与牛血清白蛋白（ＢＳＡ）偶联形成的完全抗原，免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，采用淋巴细胞杂交瘤技术。制备了２株分泌抗ＣＲＦ单克隆抗体的杂交瘤。并利用建立的小分子肽ＣＲＦ的间接ＥＬＩＳＡ法，对其腹水效价及其特异性进行了分析。     

人心肌肌钙蛋白I单克隆抗体的制备及鉴定

目的 :制备抗人心肌肌钙蛋白 I(c Tn I)单克隆抗体 (c Tn I Mc Ab)并进行初步鉴定。 方法 :从健康意外死亡者的心肌中提取、纯化人 c Tn I,以其为抗原 ,免疫 BAL B/ c小鼠后 ,取其脾淋巴细胞与小鼠 Sp2 / 0骨髓瘤细胞融合 ,反复筛选及克隆 ,得到能稳定分泌 c Tn I Mc Ab的杂交瘤细胞株。初步鉴定 c Tn I Mc Ab。结果 :经间接 EL l SA法筛选 ,3次克隆化后获得 5株能稳定分泌 c Tn I Mc Ab的杂交瘤细胞 (3A7、3A 11、3D2、3F10和 1H9) ,5株单抗免疫球蛋白亚类鉴定均为 Ig G2 a类。染色体数目 92～ 110条。 5株单克隆抗体腹水按 1∶ 10 0稀释 ,与 L DH、CK、CK- MB、AST和人心肌肌钙蛋白 T(c Tn T)行交叉反应为阴性。 5株 c Tn I Mc Ab腹水效价为 3.2× 10 - 6 ～ 1.6× 10 - 7。c Tn I Mc Ab相加试验表明 ,3D2、3F10与 3A7、3A11、1H9能识别不同的抗原表位。 结论 :本实验成功制备了具有较高活性的 c Tn I Mc Ab,具有良好应用开发价值。     

抗腺病毒载体单克隆抗体的制备及其初步鉴定

目的 研制抗腺病毒载体(Adv)表面蛋白的单克隆抗体(McAb).方法 将Adv以Al(OH)3佐剂化,常规免疫BALB/c小鼠.采用细胞融合技术制备抗Adv McAb;采用ELISA、免疫细胞化学及Western blot法对McAb进行筛选与鉴定.结果 共获得6株可稳定分泌特异性McAb的细胞(A4H11、A8C7、F1H5、G1D2、G4E3、H2G8),其染色体数目为102～106条,所分泌McAb均属IgG1亚类,持续3个月适应培养仍能保持其稳定的抗体分泌能力.腹水抗体的ELISA效价在1∶106～1∶108之间;Western blot结果显示6株McAb均与来自腺病毒载体及野生3、5、7型腺病毒抗原提取物中分子量约为114 kD的多肽反应,据此推测它们均是抗ADV-TK六邻体蛋白的McAb.结论 成功制备出6株抗腺病毒载体六邻体单克隆抗体,为腺病毒载体应用于肿瘤基因治疗的临床前研究提供物质基础.