VSMC-Cx43-/-条件性基因敲除小鼠模型的构建及基因型鉴定

目的 应用CRISPR-Cas9技术和LoxP-Cre系统构建血管平滑肌缝隙连接蛋白Cx43条件性基因敲除小鼠(VSMC-Cx43-/-)模型.方法 采用受精卵同源重组的方式,对Gja1基因进行flox修饰.通过体外转录的方式,获得Cas9 mRNA和gRNA;通过In-Fusion cloning的方法构建同源重组载...     

VSMC-Cx43-/-条件性基因敲除小鼠模型的构建及基因型鉴定

目的应用CRISPR-Cas9技术和LoxP-Cre系统构建血管平滑肌缝隙连接蛋白Cx43条件性基因敲除小鼠(VSMC-Cx43^-/-)模型。方法采用受精卵同源重组的方式,对Gja1基因进行flox修饰。通过体外转录的方式,获得Cas9 mRNA和gRNA;通过In-Fusion cloning的方法构建同源重组载体,该载体包含3.0 kb 5’同源臂、1.9 kb的flox区域和3.0 kb 3’同源臂。将Cas9 mRNA、gRNA和donor vector显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,获得F0代小鼠。PCR扩增及测序鉴定阳性的F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配获得3只阳性F1代小鼠(Cx43^flox/+)。将获得的flox杂合子Cx43^flox/+小鼠自交,获得flox纯合子Cx43^flox/flox小鼠。然后用Cx43^flox/flox小鼠和Myh11-CreERT2小鼠交配,最终获得flox纯合且Cre阳性的实验组小鼠(该小鼠简写为:VSMC-Cx43^-/-)和flox纯合且Cre阴性的对照组小鼠(Cx43^flox/flox)。用PCR进行基因型鉴定,用Western blot技术检测Cx43在大脑中动脉、冠脉、肺动脉和肾动脉组织中的表达,以明确基因敲除小鼠是否构建成功。结果基因型鉴定、免疫荧光和Western blot检测结果表明VSMC-Cx43^-/-基因敲除小鼠模型构建成功,小鼠一般性状无改变,小鼠大脑中动脉、冠脉、肺动脉和肾动脉组织中Cx43蛋白表达均下降。因此,可作为长期稳定模型研究血管平滑肌Cx43的功能。结论应用CRISPR-Cas9技术和LoxP-Cre系统成功构建了VSMC-Cx43^-/-基因敲除小鼠模型,为深入研究Cx43在血管疾病中的作用提供工具。     

采用PCR方法检测Fmr1基因敲除小鼠的基因型

目的为Fmr1基因敲除小鼠探索快速、简单的基因型PCR检测方法。方法设计两对引物扩增野生型Fmr1基因和Fmr1缺陷突变基因的DNA片段,用PCR仪梯度方案测试最佳退火温度,并将所得基因型结果与经典的western blot方法比较。结果野生型仅在800bp处有一条条带,突变纯合子仅在500bp处有一条条带,杂合子则在500bp和800bp处出现两条条带。用PCR方法获得的Fmr1基因分析结果与经典的western blot方法获得的结果完全一致。结论用PCR方法分析Fmr1基因敲除鼠的基因型具有快速、简单、廉价和适用的特点。     

泛素羧基末端水解酶-1与神经退行性疾病

神经退行性疾病是威胁人类健康的杀手之一,但是对于发病的原因和机理我们还所知甚少,研究表明在神经退行性疾病中,泛素蛋白酶体的活性受到抑制.泛素羧基端水解酶UCH-L1作为神经元中特异性表达的、脑内可溶性蛋白中含量最丰富的蛋白之一,在神经退行性疾病,尤其是帕金森和老年痴呆症中发挥着重要的作用.本文主要论述UCH-L1的功能和在神经退行性疾病中发挥的作用.     

4周龄Fmr1基因敲除小鼠的高架十字迷宫行为观察

目的对4周龄的Fmr1基因敲除小鼠的高架十字迷宫行为进行观察。方法采用SMART软件对4周龄的Fmr1基因敲除小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)进行高架十字迷宫行为观察,数据采用多因素方差分析处理。结果采用SMART软件分析发现:在高架十字迷宫实验中,与WT组小鼠比较,KO组小鼠的运动性、兴奋性、探索性明显增强,且KO组小鼠在开放区域活动时间,次数以及路程均明显高于WT组。结论 4周龄Fmr1基因敲除小鼠的行为异常,运动性和兴奋性较野生型小鼠增高。     

载脂蛋白E基因敲除小鼠血脂及病理组织学观察

目的观察载脂蛋白E（ApoE-/-）基因敲除小鼠血脂及病理组织学变化。方法选择24只ApoE-/-基因敲除小鼠,雌雄各半,另选同龄的雌雄各半C57BL/6J小鼠24只为对照,观察小鼠血脂及心脏病理形态学变化。结果 ApoE-/-基因敲除小鼠组总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL）水平较对照组明显增高（P〈0.05）;ApoE-/-基因敲除小鼠组高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）与对照组相比无差异（P〉0.05）;ApoE-/-基因敲除小鼠组动脉粥样硬化斑块大小较对照组明显增高（P〈0.05）;ApoE-/-基因敲除小鼠心肌发生粥样硬化病变改变。结论 ApoE-/-基因敲除小鼠更容易引起动脉粥样硬化病灶形成。     

Fmr1基因敲除型小鼠肠道菌群结构分析

目的探讨Fmr1基因敲除型小鼠粪便肠道细菌群落的结构及多样性。 方法利用16S rRNA高通量测序技术对10份小鼠粪便样本进行测序分析并进行生物学分析。 结果两组样本测序共获得高质量序列325 280条，核心菌门为拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门。Anosim分析表明基因敲除(KO)组与正常野生型(WT)组小鼠两组间具有显著差异，组内样品重复性满足数据分析要求，Adonis分析表明本次检验可信度高(P<0.05)。LDA值展现KO组与WT组小鼠肠道微生态菌群有明显差异，基于Unifrac距离，Amova分析表明KO和WT组组间差异显著(P<0.05)。 结论KO组与WT组小鼠肠道微生物群落的结构及多样性存在显著差异且具有统计学意义，提示孤独症与肠道微生态系统密切相关，肠道微生态系统可能通过微生物代谢的间接作用影响孤独症的发生发展，但具体的作用机制仍需进一步的研究。     

Fmr1基因敲除小鼠的被动回避行为及海马GAD的表达变化

目的 探讨Fmr1基因敲除小鼠的学习记忆功能和海马的谷氨酸脱羧酶(GAD)表达变化的关系.方法 对4周龄和6周龄的基因敲除型(KO)鼠和野生型(WT)鼠分别连续进行2天的被动回避行为的避暗和跳台实验观察后使用免疫印迹技术检测海马GAD的表达变化,根据所获得的数据进行多因素方差分析处理.结果 避暗实验中,4周龄和6周龄KO鼠潜伏期比WT鼠明显少(P＜0.05);而KO鼠的错误次数比WT鼠明显多(P ＜0.05);4周龄和6周龄KO鼠或WT鼠的潜伏期、错误次数无差异(P＞0.05),同周龄WT鼠第一天的潜伏期和错误与第二天相比无差异(P＜0.05).跳台实验中,4周龄和6周龄KO鼠的潜伏期比WT鼠明显少(P＜0.05);而KO鼠的错误次数比WT鼠明显多(P＜0.05);4周龄和6周龄KO鼠或WT鼠的潜伏期、错误次数无差异(P＞0.05);同周龄第一天KO鼠的潜伏期和错误次数与第二天相比无差异(P ＞0.05);同周龄第一天WT鼠的潜伏期和错误次数与第二天相比有显著差异(P＜0.05).GAD65/67蛋白在KO鼠海马表达比WT鼠增多(P＜0.05);随着周龄的增加,6周龄KO鼠或WT鼠的GAD 65/67蛋白表达比4周龄表达增多(P＜0.05).结论 4周龄和6周龄Fmr1基因敲除小鼠存在认知功能障碍,海马的GAD的表达异常变化可能介导Fmr1基因敲除小鼠学习记忆障碍.     

Plin1基因敲除对肥胖小鼠脂质代谢的影响及机制

目的 研究Plin1基因敲除对高脂饮食诱导肥胖小鼠脂质代谢的影响并探究其可能的作用机制。方法 普通C57BL/6J小鼠12只,随机分为普通组和高脂组,每组6只,Plin1基因敲除小鼠12只,随机分为敲除普通组和敲除高脂组,每组6只。喂养12 w后称量各组小鼠体重,取出白色和棕色脂肪组织称重并用HE染色观察不同脂肪组织的形态变化;试剂盒检测小鼠血清脂质相关指标;WB法检测脂质代谢相关蛋白的表达。结果 与普通组相比,高脂组小鼠体重和脂肪组织重量显著增加（P <0.05）,TG、TC、LDL-C、Glycerin和FFA水平均显著升高（P <0.05）,平均脂肪细胞面积变大（P <0.05）,脂肪组织中SREBP1蛋白表达明显增加（P <0.05）,p-HSL和ATGL的蛋白表达量显著下降（P <0.05）;与高脂组相比,敲除普通组和敲除高脂组小鼠体重显著减轻,其脂肪重量和系数也明显下降（P <0.05）,血清中TG、TC水平降低,HDL-C水平升高（P <0.05）,WAT细胞体积缩小,BAT细胞空泡增多,脂肪组织中SREBP1蛋白表达下降（P &...     

碱性裂解液提取DNA法在环氧化酶亚型基因敲除小鼠基因型鉴定中的应用

目的：应用碱性裂解液法提取的DNA鉴定环氧化酶（COX）亚型基因敲除小鼠,为鉴定纯合子小鼠提供一种方便快捷、低成本、可靠的实验方法。方法：取子代小鼠耳缘组织于EP管中,用碱性裂解液提取基因组DNA,PCR扩增COX-1和COX-2基因片段,通过琼脂糖凝胶电泳对小鼠基因型作出鉴定。结果：碱性裂解液法提取的DNA能应用于子代小鼠的不同基因型的鉴定,即野生型（COX-1＋/＋;COX-2＋/＋）、杂合子（COX-1＋/-;COX-2＋/-）和纯合子（COX-1-/-;COX-2-/-）。结论：建立了碱性裂解液提取DNA法,并将该法成功应用于环氧化酶亚型基因敲除小鼠基因型鉴定中。     

儿童钙代谢相关激素与Ⅰ型胶原及骨钙素基因多态性关系的分析

目的探讨Ⅰ型胶原及骨钙素基因多态性与儿童钙代谢相关激素之间的关系。方法以河南省某地8～12岁中国汉族健康儿童作为研究对象,采用放免法测定血清骨钙素(OC)和降钙素(CT);采用PCR-RFLP技术检测COL1A2 PvuⅡ、RsaⅠ和OC HindⅢ基因多态性。结果携带RR基因型的儿童血清Ca和CT浓度均值分别为2.75mmol/L和206.42ng/ml,均高于rr基因型儿童的2.36mmol/L和170.15ng/ml(分别P0.05)。血清OC浓度在COL1A2 RsaⅠ各基因型未见差异(P0.05),也未发现COL1A2 PvuⅡ及OC HindⅢ基因型与儿童血清Ca、CT及OC浓度相关。结论 COL1A2 RsaⅠ多态性可能对儿童血清钙及降钙素水平产生影响。     

抗氧化微量营养素对1型糖尿病小鼠胰岛素基因转录的影响

目的研究抗氧化微量营养素(antioxidant micronutrients,AM)对胰岛β细胞胰岛素基因转录的影响,为补充天然抗氧化物提高糖尿病状态下受损的胰岛素基因表达提供科学依据。方法应用MLDS(multiply low dosage of streptozotocin)法制备1型糖尿病(T1DM)小鼠模型,分别联合添加4种AM(Se+VE+V+Cr)和7种AM(Se+VE+V+Cr+VC+硫辛酸+烟酰胺)进行干预,应用RT-PCR技术观察联合AM对胰岛素基因转录的影响。通过生物化学方法检测小鼠心、脑、肾、肝自由基代谢产物丙二醛(MDA)含量。结果联合补充AM可明显增加T1DM模型小鼠胰岛β细胞胰岛素mRNA表达水平,降低小鼠肝、肾MDA含量。结论AM联合生物学效应可在转录水平上调T1DM情况下胰岛素基因表达,提高内源性胰岛素水平,拮抗糖尿病关键发病中间环节。     

枸杞多糖对慢性辐射小鼠细胞凋亡及bc1-2基因表达的影响

目的:探讨枸杞多糖(LBP)对辐射小鼠细胞凋亡及凋亡相关基因bcl-2表达的影响。方法:以水提取-乙醇沉淀法制备枸杞多糖,并制成0.8%的饲料,给予受试小鼠(枸杞多糖组)。正常对照组、辐射对照组给予普通饲料。除正常对照组外,另两组均用60Coγ射线对动物进行全身性照射,每天照射1次,每天照射剂量为0.084Gy,每周照射5d,连续照射6w,照射总剂量为2.52Gy。检测骨髓微核率、睾丸精母细胞染色体畸变、精子畸形率、肝细胞caspase-3mRNA表达水平、细胞凋亡及凋亡相关基因bc1-2表达等指标。结果:LBP可使辐射引起的微核率、染色体畸变、及精子畸形率显著降低,骨髓细胞增殖活性提高,凋亡率降低,使辐射小鼠bc1-2基因表达提高、caspase-3mRNA表达水平降低。结论:枸杞多糖的抗辐射作用与其调控细胞bc1-2基因表达,影响细胞凋亡有关。     

儿童Graves病临床特征与HLA-DQA1基因的相关性

[目的]探讨人类白细胞抗原HLA-DQA1基因型频率与儿童Graves病临床特征的相关性。[方法]应用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)及DNA测序法,对四川地区汉族GD儿童83例和正常对照50例的外周血白细胞DNA的HLA-DQA1基因进行分型,分析家族史、性别及眼病与基因型的相关性。[结果]DQA1*0102的频率在男女GD病儿中均显著增高(P=0.001;P﹤0.001),女性病儿的相关性高于男性,在家族史阳性和家族史阴性(P=0.004;P=0.001,)及伴和不伴眼病的GD病儿中均显著增高(P=0.031;P﹤0.001)。DQA1*0302/0501在女性病儿中显著增高(P=0.012),在家族史阴性(P=0.017)和伴眼病的GD病儿中显著增高(P=0.003)。DQA1*0101/0301仅在女性病儿中显著减少(P﹤0.001),在家族史阳性和家族史阴性(P=0.003;P﹤0.001)及伴和不伴眼病的GD病儿中均显著减少(P﹤0.001;P﹤0.001)。[结论]HLA-DQA1基因与GD儿童家族史的相关性不大,但与性别、是否伴发GD眼病相关。     

肿瘤转移抑制基因KAI1/CD82在宫颈癌的表达及其相关性研究

[目的]探讨肿瘤转移抑制基因KAI1/CD82在宫颈癌组织中的表达及其与宫颈癌侵袭和转移的相关性.[方法]采用免疫组化LsAB法检测70例浸润性宫颈癌、15例原位癌、20例正常宫颈组织以及29例转移淋巴结中KAI1/CD82蛋白的表达.[结果]KAI1/CD82在宫颈浸润癌及原位癌组织中的蛋白表达与正常宫颈上皮中的表达相比明显下调(P<0.05),原位癌与浸润癌中的表达差异无统计学意义(P>0.05);KAI1/CD82的蛋白表达与宫颈癌临床分期、病理类型、淋巴结转移、脉管浸润以及宫颈间质肌层浸润深度均无相关性(P>0.05);KAI1/CD82在高中分化组中的蛋白表达高于低分化组(P<0.05),在淋巴结转移灶中的表达与其原发灶中的表达相比差异无统计学意义(P>0.05).[结论]肿瘤转移抑制基因KAI1/CD82对宫颈癌组织的恶性侵袭行为可能不是一个主要影响因素.     

宫颈癌中RASSF1A基因杂合性丢失及HPV感染状态的研究

[目的]研究RASSF1A基因的杂合性丢失(Ioss of heterozygosity, LOH)及人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染与宫颈癌临床病理参数之间的关系.[方法]选择3p上2个微卫星位点,对110例宫颈组织进行LOH及HPV感染状态的分析.[结果]宫颈癌及CIN中RASSF1A基因LOH阳性的比例明显高于正常宫颈(P<0.05);官颈癌Ⅲ和Ⅳ期LOH的阳性率明显高于Ⅰ期和Ⅱ期(P<0.05);低分化宫颈癌的LOH阳性率明显大于高中分化官颈癌(P<0.05);随CIN级别的增加LOH阳性率也呈逐渐递增趋势,高级别CIN(CINⅢ及原位癌)明显高于低级别CIN(CIN I/Ⅱ)(P<0.05).宫颈癌中HPV感染阳性率明显高于CIN组及正常宫颈组(P<0.05);RASSF1A的LOH阳性率在HPV感染阳性组明显高于阴性组(P<0.05).[结论]RASSF1A基因的改变是宫颈癌发生过程中的较晚期事件,RASSF1A基因的LOH对于宫颈癌的筛查、早期诊断及判断预后可能具有临床实用价值.HPV感染与RASSF1A基因的LOH共同作用在宫颈癌发展过程中更有意义.     

一对父亲与胎儿所携乙型肝炎病毒前S基因的序列分析

目的：筛选一位父亲HBsAg,HBeAg,抗HBc均阳性的慢性携带者和母亲无任何乙型肝炎病毒（HBV）标志的子宫内受染胎儿为研究对象,分析父、儿所携带HBV前S基因的基因序列,探讨HBV男性垂直传播的存在。方法：应用半套式PCR检测父亲、胎儿的PreS1/S2基因,将扩增的片段克隆到PGEM－T载体进行克隆测序,并与文献中的中国人参照株序列相比较,结果：父、儿血清中均扩增出前S基因,测序结果表明二者的基因同源性达99％以上,且均有183bp的PreS1基因缺失,而与中国人参照株序列的同源性为89％,结论：父、儿前S序列的高度一致性表明HBV极可能存在男性垂直传播。     

Rapid Spread and Diversification of Respiratory Syncytial Virus Genotype ON1, Kenya

Respiratory syncytial virus genotype ON1, which is characterized by a 72-nt duplication in the attachment protein gene, has been detected in >10 countries since first identified in Ontario, Canada, in 2010. We describe 2 waves of genotype ON1 infections among children admitted to a rural hospital in Kenya during 2012. Phylogenetic analysis of attachment protein gene sequences showed multiple introductions of genotype ON1; variants distinct from the original Canadian viruses predominated in both infection waves. The genotype ON1 dominated over the other group A genotypes during the second wave, and some first wave ON1 variants reappeared in the second wave. An analysis of global genotype ON1 sequences determined that this genotype has become considerably diversified and has acquired signature coding mutations within immunogenic regions, and its most recent common ancestor dates to ≈2008–2009. Surveillance of genotype ON1 contributes to an understanding of the mechanisms of rapid emergence of respiratory viruses.