高表达蛋白hSav1对人胚肾HEK293增殖能力的影响

Objective To elucidate the effects of human Salvador 1 (hSav1 ) on cell proliferation of human embryonic kidney cell line HEK293. Methods The plasmid CFP-N1-hSav1 was constructed and transfected into HEK293 cells with lipofectamine 2000. The transfection efficiency was detected by fluorescent microscopy. The effects of hSav1 on cell proliferation were measured by MTT and BrdU incorporation. Results The transfection efficiency was about 70% -80%. The MTT results showed that the inhibition rate of cell proliferation in transfected group at the 12th, 24th, 36th, and 48th h was 2% , 5% , 15% , and 23% , respectively;while that in the control group was 2% , 3% , 2% , and 2% respectively. The BrdU incorporation revealed that the BrdU incorporation rate in transfected group (12. 9 ±5. 3)% was significantly lower than in control group (27.3±3.8)% (P<0.05). Conclusion hSav1 is a newly identified protein that can cause cell proliferation inhibition in HEK293 cells.     

高表达蛋白hSav1对人胚肾HEK293增殖能力的影响

Objective To elucidate the effects of human Salvador 1 (hSav1 ) on cell proliferation of human embryonic kidney cell line HEK293. Methods The plasmid CFP-N1-hSav1 was constructed and transfected into HEK293 cells with lipofectamine 2000. The transfection efficiency was detected by fluorescent microscopy. The effects of hSav1 on cell proliferation were measured by MTT and BrdU incorporation. Results The transfection efficiency was about 70% -80%. The MTT results showed that the inhibition rate of cell proliferation in transfected group at the 12th, 24th, 36th, and 48th h was 2% , 5% , 15% , and 23% , respectively;while that in the control group was 2% , 3% , 2% , and 2% respectively. The BrdU incorporation revealed that the BrdU incorporation rate in transfected group (12. 9 ±5. 3)% was significantly lower than in control group (27.3±3.8)% (P<0.05). Conclusion hSav1 is a newly identified protein that can cause cell proliferation inhibition in HEK293 cells.     

镉通过作用于细胞线粒体诱导人胚肾细胞（HEK）293发生Caspase依赖和非依赖的细胞凋亡

镉（Cd）无论是在体内还是在体外实验都证明对肾脏有毒性，同时其肾脏毒性与其诱导细胞发生凋亡有关，但其内在机制仍不清楚。本研究评价了镉对HEK-293细胞的效果及探讨镉所诱导发生细胞凋亡的相关内在机制。MTT结果、细胞形态学的改变以及DNA片断化的分析表明了30-60μM的镉确实诱导了细胞发生凋亡，而120μM的镉则主要引起了细胞的坏死。     

原代人胚成肌细胞体外培养增殖及分化特性

目的 分离培养人胚胎成肌细胞,观察原代细胞体外增殖与分化特性。方法 选择健康妇女损赠的胎儿骨骼肌标本,参照Blau等的胰蛋白酶与胶原酶混合、多步消化法分离成肌细胞。经美速贴壁法纯化后,在含20％胎牛血清的生长培养基中培养,以生长曲线评价及其增殖情况;含5％胎牛血清的融合培养基中培养,以磷酸肌酸激酶－MM型合成量及成肌细胞融合率评价及其分化能力。通过光镜、透射电镜、免疫细胞化学方法（小鼠抗人肌球蛋白单克隆抗体）鉴定所得细胞。结果 电镜下可见所得细胞含大量游离核糖体,肌球蛋白免疫细胞化学染色强阳性,能合成磷酸肌酸激酶,能融合形成肌小管,证明其为骨骼肌成肌细胞。在生长培养基中原代细胞倍增时间为4．8天,在融合培养基作用下,肌小管融合率及磷酸肌酸激酶合成量明显增加。结论 多步酶消化法与差速贴壁法能获得足量、纯净成肌细胞,所得细胞增殖能力强,能表达骨骼肌特异的收缩蛋白;融合培养基能促进其体外分化。     

17-β雌二醇对人胚肾成纤维细胞生物特性的影响

雌激素作为一种多功能的自分泌和旁分泌激素具有生殖功能以外的重要生理作用［１］。雌激素可抑制肾小球系膜细胞合成和分泌胶原,减少系膜基质的聚集,限制肾小球硬化的发展［２］。在间质纤维化的发展过程中,肾成纤维细胞（ｋｉｄｎｅｙ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ,ＫＦＢ）的增殖起着决定性作用［３］。１７－β雌二醇（１７－β ｅｓｔｒａｄｉｏｌ,Ｅ２）对肾脏病的进展可能具有良性作用,其对ＫＦＢ的影响尚未见报道。本试验拟在细胞水平,观察Ｅ２对ＫＦＢ增生、凋亡及细胞外基质成分（ＥＣＭ）之一的纤连蛋白（Ｆｎ）表达的影响。 一…     

ptsA58H质粒转染人胚腱细胞的增殖特性及端粒酶活性分析

目的 分析体外长期传代ptsA58H质粒转染人胚腱细胞的增殖能力及端粒酶活性。方法 选用连续传代培养的第40代、第70代、第75代转化人胚腱细胞,免疫组化染色观察细胞分泌胶原类型,比较细胞生长曲线,并行染色体核型分析,流式细胞术检测细胞增殖周期,提取细胞总RNA,RT－PCR二步法检测细胞我端粒酶逆转录酶mRNA表达。结果 转化人胚腱细胞传代至70代以后,细胞形态发生改变,出现复制哀老现象。细胞具有正常分泌Ⅰ型胶原的能力,转化人胚腱细胞染色体呈异倍性（2n=94）。转化人胚腱细胞无人端粒酶逆转录酶mRNA特异扩增带,无端粒酶活性表达。结论 单纯SV40转染不能使人胚腱细胞永生化,同时也说明转化人胚腱细胞无恶性转化倾向。     

肾癌特异相关基因GYLZ-RCC18的表达及对肾癌细胞生长及增殖活性的影响

目的 通过检测肾癌相关新基因GYLZ－RCC18（基因号：BE825133）在肾癌中的表达特点及其对肾癌细胞生长、增殖的影响，探讨GYLZ－RCC18基因的功能及其在肾癌发生发展中的作用。方法 应用逆转录－聚合酶链式反应（RT－PCR）的方法检测肾癌相关基因GYLZ－RCC18在31例肾癌标本中的表达特点；观察GYLZ－RCC18反义寡核苷酸对肾癌细胞生长、增殖活性、形态学的影响。结果 GYLZ－RCC18基因在肾癌组织特异表达，正常肾组织较肾癌组织低表达或不表达，两者表达量差异为1－9倍。GYLZ－RCC18基因的表达在高分级、高分期肾癌明显高于低分级、低分期肾癌；导入GYLZ－RCC18反义寡核苷酸后，可明显抑制癌细胞的生长和增殖活性，并减少分期肾癌，导入GYLZ－RCC18反义寡核苷酸后，可明显抑制癌细胞的生长和增殖活性，并减少GRC－1细胞的核分裂。结论 GYLZ－RCC18是肾癌组织相对较特异表达的新基因，它的高表达与肾癌发生发展以及生长、增殖密切相关，它的成功克隆为阐明肾癌发生发展的分子生物学机制开辟了新的途径，为今后肾癌的特异诊断，基因治疗提供了新的理论依据。     

依普拉芬对鸡胚成骨细胞的增殖和分化的影响

目的 建立鸡胚额骨成骨细胞的培养方法,研究依普拉芬对其成骨细胞增殖和分化功能的影响。方法 采用混合胶原酶和胰酶、两次消化的方法,获取成骨细胞,经培养传代,取状态良好的第3代细胞在96孔板上进行增殖率和碱性磷酸酶活性的测定。结果 消化培养的细胞具有明显的成骨细胞的特点:属于成纤维目细胞型、碱性磷酸酶黑染、基质前体红染,长期培养能形成矿化结节。应用依普拉芬后发现10-4mol/L IP可抑制成骨细胞增殖,而10-8moL/L对改善成骨细胞的增殖和分化有显著功效(P<0.01),小于10-10mol/L浓度的IP则对成骨细胞与对照组无差异。结论 酶混合消化可以得到较纯的成骨细胞,应用依普拉芬研究表明,适宜浓度的IP可促进鸡胚额骨成骨细胞增殖和分化,提高其碱性磷酸酶活性,增强成骨细胞矿化,促使骨形成。     

过氧化物酶体增殖物活化受体γ激动剂对人肾间质成纤维细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)激动剂在抗肾间质纤维化方面的潜在作用.方法原代培养正常人肾间质成纤维细胞(HFB),PPARγ配体15-脱氧前列腺素J2(15d-PGJ2)和PPARγ激动剂TZDs(曲格列酮和齐格列酮)作用细胞24至72 h.应用台盼蓝染色进行活细胞计数,四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)检测细胞增殖情况,应用流式细胞技术检测细胞凋亡和细胞周期.结果在PPARγ激动剂作用下,HFB的活细胞数较对照组明显减少(P＜0.05).MTT检测发现PPARγ激动剂能明显抑制H邝细胞增殖(P＜0.05).流式细胞技术检测,PPARγ激动剂处理组细胞凋亡明显,与对照组比较差异有显著性意义.凋亡率分别是对照组(3.49±0.60)%,15d-PGJ2组(14.07±0.24)%,齐格列酮组(13.46±0.81)%,曲格列酮组(14.78±1.17)%,与对照组比较,各用药组P分别＜0.01,＜0.01,＜0.05.PPARγ激动剂处理48～72 h后用流式细胞仪观察到G0/G1细胞数明显增加,与对照组比较差异显著(P均＜0.01).结论PPARγ激动剂可以促进HFB细胞凋亡,通过G1期停滞抑制其增殖,提示PPARγ可能作为防止肾间质纤维化的一个潜在的治疗靶目标.     

姜黄素抑制人肾癌细胞769-P增殖及促凋亡的实验研究

【摘要】 目的 分析不同浓度姜黄素（curcumin，分子式C₂₁H₂₀O₆）对人肾癌细胞769-P的生物学作用及其调控机制。方法 体外培养人肾癌细胞769-P，用不同浓度姜黄素处理24 h后，采用MTT比色法测定姜黄素对细胞的增殖抑制作用，利用倒置显微镜观察细胞的显微形态结构，采用细胞划痕法观察细胞的迁移情况；Western Blot 法检测细胞内Caspase-3、 AIF蛋白质的表达情况；用反转录PCR法检测AIF、Bax mRNA的表达水平。结果 MTT法检测显示姜黄素能显著抑制人肾癌细胞系769-P的增殖，呈现浓度和时间效应关系；倒置显微镜结果显示姜黄素能够使肾癌细胞系的形态学发生改变，呈现出典型凋亡特征如核皱缩、核破裂、核肿胀等形态；细胞划痕实验显示，姜黄素抑制了肾癌细胞系的迁移；RT-PCR实验显示，姜黄素促进了BAX mRNA和AIF mRNA的表达；蛋白杂交实验显示，姜黄素促进了Caspase-3和AIF蛋白的活化，从而促进了凋亡。结论 姜黄素能显著抑制人肾癌细胞的增殖并促进其凋亡，这种生物学效应可能与激活Bax和AIF表达，活化Caspase-3的信号通路有关。     

表达肾癌G250基因和hGM-CSF基因HEK293细胞系的建立

目的 建立稳定表达肾癌G250基因与基因佐剂hGM-CSF基因编码蛋白的的HEK293细胞系。方法 通过脂质体转染的方法,将表达肾癌G250基因与细胞因子GM-CSF基因的双顺反子pIG250-GM真核表达质粒导入HEK293细胞中;经持续G418压力选择和有限稀释法获得稳定转染的细胞系;用免疫组化、ELISA和Western Blot方法,检测目的蛋白在HEK293细胞中的表达。结果 经600 μg/mL的G418压力筛选后,获得了抗性细胞克隆;免疫组织化学方法检测到表达G250的阳性细胞;ELISA方法检测到pIG250-GM转染组细胞培养上清中hGM-CSF的表达与空载体对照组比较,差异有统计学意义（P<0.05）;Western Blotting方法检测到G250蛋白的表达,分子量约54Ku,与预期大小相符。结论 成功建立可稳定表达肾癌G250基因与细胞因子GM-CSF基因的HEK293细胞系,为研究防治肾癌疫苗的免疫应答机制提供了实验基础。     

Effect of curcumin on cisplatin- and oxaliplatin-induced oxidative stress in human embryonic kidney (HEK) 293 cells

Generation of reactive oxygen species (ROS) is involved in the nephrotoxicity of platinum anticancer drugs. This study involved incubation of human embryonic kidney (HEK) 293 cells in cell culture media supplemented with cisplatin or oxaliplatin in the presence or absence of curcumin, a well-studied antioxidant. Thereafter several indices of oxidative stress have been measured, which included glutathione (GSH), total antioxidant capacity (TAC), and antioxidant enzymes [(superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), and glutathione peroxidases (GPX)]. The impact of platinum drugs on cells viability, lipid peroxidation, and lactate dehydrogenase leakage was also examined. The results show that at both acute (60 min) and chronic (24 h) durations of incubation, cisplatin and oxaliplatin induced oxidative stress as evidenced by significant inhibition of the activities of SOD, CAT, and GPX enzymes as well as significant reduction of the concentrations of GSH and TAC. Curcumin ameliorated the oxidative stress induced by these insults by significantly restoring the measured oxidative indices. Our findings provide evidence that curcumin significantly ameliorates oxidative stress induced by both cisplatin and oxaliplatin in HEK cells.     

金属硫蛋白1E对胰腺癌SW1990细胞生长的影响

目的 观察外源性人金属硫蛋白1E(MT1E)基因对胰腺癌SW1990细胞生长的影响.方法 构建MT1E基因真核表达载体,转染SW1990细胞并获得阳性单克隆细胞.用Westernblot技术检测转染前后MT1E蛋白表达,噻唑蓝(MTT)实验检测其增殖能力的变化,流式细胞仪分析细胞周期时相分布.同时检测Cyclin D1与p53的表达.结果 MT1E融合蛋白在SW1990MT1E细胞中表达.MTT结果表明,与SW1990和SW1990MT1E空细胞比较,SW1990MT1E细胞增殖速度明显增快.SW1990MT1E细胞与SW1990和SW1990空细胞比较,G0/G1期细胞明显减少,S期明显增多,差异有统计学意义.SW1990MT1E较SW1990空的细胞Cyclin D1与p53表达明显升高.结论 MT1E能够促进SW1990增殖,可能和上调Cyclin D1促使细胞进入S期增多,通过失活p53蛋白使细胞恶性变.     

hUHRF1基因对人肿瘤SKOV-3细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察hUHRF1基因对人肿瘤SKOV-3细胞增殖和凋亡的影响.方法 小干扰RNA转染肿瘤SKOV-3细胞;实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-qPCR)和Western blot法分别检测转染前后hUHRF1 mRNA及蛋白的表达水平;细胞计数试剂盒(CCK-8)试验检测细胞增殖;流式细胞术分析细胞凋亡.结果 hUHRF1 mRNA在转染组表达显著降低(P＜0.01);转染组、阴性组和空白组蛋白相对表达量分别为0.72±0.42、1.66±0.27和1.62±0.29.干扰后,细胞增殖减少(P＜0.05);各组别细胞凋亡率分别为(42.320±4.174)％、(17.740±1.786)％和(15.440±1.233)％结论小干扰RNA沉默技术可以显著抑制肿瘤SKOV-3细胞hUHRF1的表达,有效抑制细胞增殖,并显著诱导细胞凋亡.     

大鼠Uqcrfs1重组质粒的构建及其在HEK293T细胞中的表达

目的:构建大鼠Uqcrfs1的重组质粒并检测其在人胚胎肾293T细胞中的表达。方法:应用RT-PCR方法从大鼠肾脏组织总RNA中扩增出编码Uqcrfs1的cDNA,克隆至pUM-T载体并测序,然后亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1/V5-His,酶切鉴定及测序正确后以磷酸钙共沉淀法瞬时转染HEK 293T细胞,使用RT-PCR、Western Blot方法检测重组质粒在转录及蛋白水平的表达。结果:测序结果证实PCR扩增得到编码Uqcrfs1的cDNA序列正确;磷酸钙共沉淀法转染HEK293T细胞后,在基因转录与蛋白表达水平,结果达到预期。结论:成功构建大鼠Uqcrfs1的重组质粒,该重组质粒可在HEK293T中过表达。     

丁酸钠对人胰腺癌细胞ASPC-1生长的影响及其机制的研究

目的 探讨丁酸钠对人胰腺癌ASPC-1细胞生长的影响并探讨其作用机制.方法 使用不同浓度丁酸钠处理ASPC-1细胞.MTT法观察肿瘤细胞的增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期的变化;Western印迹法检测细胞内p21、p53、bcl-2、bax蛋白表达的变化,实时定量PCR检测p21和bcl-2的表达.结果 丁酸钠能明显抑制ASPC-1细胞的增殖,其作用具有明显的时间和剂量依赖性.丁酸钠处理24 h后ASPC-1细胞凋亡率明显提高(P＜0.05),S期细胞比例显著降低(P＜0.05),G0/G1期细胞比例显著升高(P＜0.05).p21、bax蛋白表达明显上调(P＜0.05);bcl-2蛋白的表达显著降低(P＜0.05);p53蛋白表达无明显变化(P＞0.05).结论 丁酸钠可以通过诱导胰腺癌细胞的凋亡和周期阻滞而抑制癌细胞生长;其发生机制可能与下调抗凋亡基因bcl-2、上调促凋亡基因bax和肿瘤抑制基因p21的表达有关.

Abstract：

Objective To investigate the effects of sodium butyrate(NaBT) on proliferation of human pancreatic cancer cell line ASPC-1 and explore the possible mechanism. Methods The methylthiazolyl tetrazolium assay (MTT) method was used to detect cell proliferation and draw a curve. The cell apoptosis and cell cycle were determined with flow cytometry. Western blot was used to study the effect NaBT on the pancreatic cancer cells and explore its mechansim. Real-time PCR was employed to assess the expression levels of p53, p21, bcl-2 and cell cycle regulation gene p21. Results After incubation with different concentrations of NaBT for 24 to 72 h, ASPC-1 cell proliferation was inhibited dramatically. NaBT induced an increase of G0/G1 phase cells and a significant decrease in the ratio of S phase cells. The expression of p21 and bax was up-regulated at protein and mRNA level. The expression of bcl-2 was down-regulated at protein and mRNA level. There was no significant difference in the expression of p53 at protein and mRNA level. Conclusion TSA-induced growth inhibition is associated with a block in the G0/G1 phase and apoptosis, which may occur through down-regulating the expression of apoptosis gene bcl-2 and up-regulating the expression of cell cycle regulation gene p21and pro-apoptotic gene bax.     

肿瘤转移抑制基因nm23-H1转染对人胆管癌细胞系增殖能力的影响

目的 探讨nm23-H1基因转染对人胆管癌细胞系增殖能力的影响。方法 通过脂质体法将含有全长nm23-H1 cDNA的真核表达载体转染人胆管癌细胞系QBC939,Northern blotring及免疫组织化学观察转染前后细胞内nm23-H1基因的mRNA及蛋白表达情况,噻唑蓝(MTT)比色法检测转染前后细胞体外增殖能力变化,流式细胞仪分析转染前后细胞周期及凋亡改变。结果 转染成功的QBC_(939)-nm23细胞nm23-H1基因的mRNA及蛋白表达明显上升,体外增殖能力下降,G_0/G_1期、G_2/M期、S期比例及凋亡率(％)分别为(70.24±2.05、12.37±0.91、17.39±2.95、9.54±0.78),与亲本QBC_(939)细胞(56.57±0.99、16.00±1.39、27.44±2.09、4.23±1.05)及对照组QBC_(939)-C细胞(56.17±0.82、17.23±0.77、26.60±0.53、3.67±0.49)相比,G_0/G_1期细胞比例明显增加,G_2/M期及S期细胞比例明显下降,凋亡细胞增加(P<0.05)。结论 nm23-H1基因可以抑制体外胆管癌细胞的增殖能力及诱导凋亡。     

诱导表达人IFITM3的293细胞株的建立及其对H1N1型流感病毒侵染作用

目的建立诱导表达IFITM3蛋白的293细胞株,为进一步研究人IFITM3对H1N1型流感病毒侵染的作用及其分子机制提供细胞模型。 方法构建IFITM3/pcDNA5/FRT/TO expression vector质粒及诱导表达细胞株,建立HN1型流感病毒假病毒评价系统,利用蛋白印迹（Western blot）和荧光素酶报告基因对筛选的诱导表达细胞株功能进行检测。 结果建立的293诱导表达细胞株能够很好表达目的蛋白,且诱导表达出来的IFITM3蛋白使H1N1型流感假病毒感染率下降97%（t = 38.08、P < 0.001）,使水泡性口炎假病毒（VSVpp）感染率下降68%（t = 54.56、P < 0.001）,而阴性对照组小鼠白血病假病毒（MLVpp）感染率（t = 1.282、P = 0.2208）和拉沙假病毒（LASVpp）感染率（t = 0.4814、P = 0.6377）无显著影响。 结论IFITM3蛋白诱导表达细胞株可以显著抑制H1N1型流感病毒感染,为进一步深入研究IFITM3抑制流感病毒感染的作用机制和分子机理提供了细胞模型和实验基础。