细粒棘球绦虫原头蚴复合染色方法的探讨

目的 改进染色方法，制作结构清晰、颜色对比鲜明的细粒棘球绦虫原头蚴标本。方法 原头蚴经4％孔雀绿36℃初染48h后，分别用石碳酸复红、稀释石碳酸复红、沙黄、伊红，醋酸洋红，苏木精洋红，盐酸洋红染液复染。结果 经4％孔雀绿初染的原头蚴标本分别用稀释石碳酸复红或沙黄染液复染5s、伊红染液复染30s、洋红染液复染5min均能获得满意效果。染色后原头蚴头钩呈亮绿色，吸盘和其余实质部分着淡红色或浅紫红色，层次分明，立体感强。结论 用孔雀绿初染，用红色染液复染制作原头蚴标本，染色效果好，操作简单，值得推广。     

制作细粒棘球绦虫原头蚴染色标本方法的初探

目的　探索制作结构清晰、颜色鲜明、能长期保存的细粒棘球绦虫原头蚴标本的方法。　方法　孔雀绿染色法 :将原头蚴分别用 1%、2 %和 4 %孔雀绿水溶液 ,在室温或 36℃染色 2 4 h、4 8h和 72 h。　结果　 4 %孔雀绿水溶液 ,36℃ ,染色 4 8h为最佳条件。染色后原头蚴头钩呈亮绿色 ,而吸盘和实质部分无色透明 ,标本的对比性和立体感强。　结论　用孔雀绿染色法制作原头蚴标本在临床诊断和教学中有实用价值。     

制作细粒棘球绦虫原头蚴染色标本方法的初探

目的 探索制作结构清晰、颜色鲜明、能长期保存的细粒棘球绦虫原头蚴标本的方法。方法 孔雀绿染色法：将原头蚴分别用1％、2％和4％孔雀绿水溶液，在室温或36℃染色24h、48h和72h。结果 4％孔雀绿水溶液，36℃，染色48h为最佳条件。染色后原头蚴头钩呈亮绿色，而吸盘和实质部分无色透明，标本的对比性和立体感强。结论 用孔雀绿染色法制作原头蚴标本在临床诊断和教学中有实用价值。     

细粒棘球绦虫原头蚴mRNA测序及表达谱分析

目的 通过对细粒棘球绦虫原头蚴的mRNA的测序及表达谱分析,初步建立起细粒棘球绦虫原头蚴的表达谱数据库,了解细粒棘球绦虫原头蚴基因表达及蛋白构成情况,为全面了解细粒棘球绦虫原头蚴生物学特征及寄生虫与宿主之间的关系奠定基础并为新的诊断方法、筛选新的药物靶点和疫苗候选分子选择提供理论依据。方法 用TRIZOL法提取人源细粒棘球绦虫原头蚴的总RNA,构建细粒棘球蚴的转录组测序文库,Illumina的solexa测序平台对RNA进行测序并进行生物信息学分析。结果 测序结果去杂后得到2G数据,通过从头拼接我们得到18 569个contig,这些contig的总长度为71 329 bp,contig平均长度为384 bp,最小的contig长度为201 bp,最大contig长度为4 618 bp,N50(覆盖50%所有核苷酸的最大序列重叠群的长度)为384 bp。预测得到unigene为9 029条,将这9 029条基因与NCBI的nr数据库做blast比对,最终有7 441条unigene具有同源比对信息。结论 根据GO分析可以发现,共有10 550条unigene与数据库中的基因有较高同源性,且较多的unigene可以与多条基因相对应,一共建立了10 550条对应关系。通过与KEGG数据库进行比对分析,细粒棘球绦虫原头蚴的转录组中有4 731条unigene得到注释,这4 731个得到注释的基因位于241条代谢通路中,这些代谢通路分别与代谢过程,基因信息过程,环境相关过程,细胞过程及与人类疾病相关。     

刃天青还原法检测细粒棘球绦虫原头蚴总数

目的 建立刃天青还原法体外检测细粒棘球绦虫存活原头蚴总数的实验方法。方法 根据刃天青在活细胞线粒体酶作用下被还原成强荧光物质的原理,将体外培养的原头蚴,用2 mg/mL刃天青染色10 h后,用荧光分光光度计(激发光波长在560 nm,发射长590 nm)测定荧光值,并利用激光扫描共聚焦显微镜形态观察,通过统计学方法建立活原头蚴总数与对应的荧光值之间的数学模型,用于存活原头蚴总数的检测。结果 激光扫描共聚焦显微镜观察发现,死亡的原头蚴经刃天青染色没有荧光,活的原头蚴经刃天青染色发出红色荧光。活原头蚴总数与对应的荧光值呈线性关系,建立直线方程y=0.019x+6.453,在检验中将测得的荧光值(y)带入该公式即可获得活原头蚴总数,此数学模型相关系数r=0.994,P<0.01,说明每个浓度下活原头蚴总数与每个浓度对应的荧光值之间的相关系数r极显著。结论 本研究建立了刃天青还原法体外快速检测细粒棘球绦虫存活原头蚴总数的实验方法,该方法可应用于抗包虫病药物体外筛选,具有避免人为误差、降低人力消耗等优点。     

胆汁对体外细粒棘球蚴原头节的作用观察

目的探讨不同浓度的胆汁对细粒棘球蚴原头节的生长作用及形态学影响。方法将体外培养的细粒棘球蚴原头节分别加入40％、60％、80％、100％的胆汁中体外孵育。0．1％伊红染色在倒置显微镜下检测原头节的活力及形态改变,实验重复三次;透射电子显微镜下（TEM）下观察胆汁作用后原头节表面超微结构改变。结果不同浓度的胆汁对原头节均有杀伤作用,其中浓度为100％和80％的胆汁对细粒棘球蚴原头节杀伤作用最明显。倒置显微镜下观察发现,不同浓度的胆汁作用细粒棘球蚴原头节后,原头节多呈外翻型,原头节顶突上的小钩排列紊乱,部分脱落,吸盘突起,变形,活动性减弱。随着浓度的增加,变化越明显。超微结构显示40％的胆汁作用3d后,原头节纤毛出现少量缺损,合胞体带排列较紊乱,合胞体带内出现散在少量的空泡和脂滴。60％胆汁作用3d后,合胞体带内微毛出现融合,腔内出现空泡和脂滴,数量多且大。结论胆汁作用后,可导致体外细粒棘球蚴原头节的形态发生不同程度的改变并有有抑制作用,然而关于胆汁在体内的疗效有待于进一步研究。     

放射线对体外细粒棘球蚴原头蚴成囊及Gadd45α基因的影响

目的探讨放射线对体外培养细粒棘球蚴原头蚴成囊过程及凋亡相关基因Gadd45α的影响。方法体外培养自然感染的羊肝中的原头蚴,分别采用0、10、20、30、40、50Gy剂量的6MV-X线照射1次,继续培养14d后在光镜及电镜下观察原头蚴成囊情况并计算成囊率。取原头蚴,分别采用0、30、45、60Gy剂量的6MV-X线照射后继续培养14d,RT-PCR检测包囊细胞Gadd45α基因的表达情况。结果放射线照射后,能发育成囊的原头蚴囊在光镜及电镜下可见明显的放射损伤,对照组成囊发育良好,照射组可见钩突崩解,正常结构消失,且剂量越高,包囊结构异常越明显。0、10、20、30、40、50Gy剂量照射后的成囊率分别为(81.83±0.027)%、(50.62±0.021)%、(33.17±0.014)%、(27.71±0.024)%、(23.06±0.011)%和(20.65±0.009)%,成囊率与放射剂量呈负相关(r=-0.898,P0.01)。RT-PCR检测30、45、60Gy剂量照射后的Gadd45αmRNA相对转录水平分别为1.46±0.190、3.21±0.369和4.26±0.524,与0Gy剂量下的相对表达水平(1±0)比较差异有统计学意义(P0.01),mRNA相对表达水平与放射剂量呈显著正相关(r=0.949,P0.01)。结论放射线照射对原头蚴的成囊有抑制作用,以高剂量组改变和破坏程度更显著。凋亡相关基因Gadd45α可能在放射线抑制原头蚴成囊的机制中发挥重要作用。     

细粒棘球蚴原头节胆碱脂酶的研究

细粒棘球蚴中的原头节在终宿主消化系统逐步发育为成虫,一些研究者试图用药物阻止其发育。鉴于一些抗线虫药以灭活虫体胆碱脂酶为目标,本文作者分别用分光光度计和电泳法研究了原头节提取物的胆碱脂酶活性和/或拟胆碱脂酶活性,以及特异性抑制剂和有机磷类抗蠕虫药敌百虫对酶活性的影响。     

人体细粒棘球蚴的超微结构

透射电镜下角质层呈板层状结构;生发层见较多微毛、皮层和皮层细胞等;并观察到生发层近内侧缘的巨大囊泡、附于内侧缘的电子致密颗粒、位于皮层细胞区的类似神经髓鞘样结构和变性的生发层。扫描电镜观察原头节大多为内陷型,体表无微毛,遍布细小皮孔,顶端见盘状凹陷孔,后端亦微陷,常见蒂外突。少数为外翻型,外观分四部分:顶突有两排头钩,微毛呈细长圆柱状:中部体表见四个吸盘及刀状微毛;后部则见较多细条状或不规则形质膜突起,或遍布细小圆柱状突起;蒂部与内陷型相似。另可见介于两者之间、头节部分外翻的原头节。     

细粒棘球绦虫原头蚴及囊液miRNA测序与生物信息学分析

目的通过对绵羊肝、肺来源的细粒棘球绦虫原头蚴(protoscoleces,PSC)及囊液miRNA测序及表达谱分析,筛选差异表达miRNAs,并对其调控的靶基因进行初步预测,以期了解细粒棘球绦虫原头蚴生物学特征研究奠定基础,同时为细粒棘球蚴病的综合防控提供理论依据。方法采用TRIZOL法分别提取细粒棘球绦虫原头蚴及囊液总RNA,构建sRNA测序文库,采用Illumina HiSeq2500高通量测序技术进行深度测序,分别比较肝、肺原头蚴组及肝、肺囊液组miRNAs的表达差异。对显著差异表达的miRNAs进行筛选与靶基因预测,并进行GO和KEGG功能富集分析,初步探讨差异表达miRNAs。结果原始测序数据一系列数字化过滤后,得到的sRNAs长度分布在18-26nt之间。本次测序筛选出764个miRNAs,包括保守miRNAs 134个,新miRNAs 537个。筛选出显著差异表达的miRNAs共计61个,其中肝、肺原头蚴组4上调表达,56个下调表达,囊液组仅有1个miRNA且上调表达。GO分析其在生物过程中多富集在转录及调控、蛋白磷酸化、氧化还原反应等;在分子功能上多集中于ATP、蛋白、核酸及离子的结合和转运等。KEGG显示,受显著差异miRNAs调控的靶基因参与了2条信号通路,主要在细胞的增殖、分化、凋亡、代谢和抵抗氧化应激等方面发挥作用。结论肝、肺原头蚴组及其囊液存在特异miRNAs表达谱,包括数量和种类及其表达水平的不同,可为包虫病筛选新的药物靶点,评估包虫转移风险提供理论参考。     

伽马射线体外照射对细粒棘球蚴原头节的杀灭作用

目的 探讨细粒棘球蚴原头节体外照射γ-射线后导致的死亡、细胞内caspase-3的表达和显微结构的变化。方法 在体外培养的基础上,用不同剂量的γ-射线对细粒棘球蚴原头节进行照射。对照射后各组原头节细胞内的caspase-3蛋白酶活性进行测定,观察期原头节死亡率,并在倒置显微镜下动态观察原头节形态结构的变化。结果 原头节经过γ-射线体外照射后会出现死亡率升高,caspase-3表达增强现象,同时原头节形态结构出现肿胀、塌陷、碎裂的阶段性变化。结论 γ-射线体外照射可以直接杀灭原头节,且诱导原头节细胞发生凋亡。     

约旦地区人和家畜细粒棘球蚴中原头蚴的形态变异

在约旦,棘球蚴病是一种对人类和家畜危害严重的疾病。在该病流行区,由于存在着不同的细粒棘球绦虫虫株,因此其流行病学常常是复杂的。据报道,在叙利亚和黎巴嫩至少存在2个不同的细粒棘球绦虫虫株,     

细粒棘球蚴原头节感染对小鼠肝细胞增殖的影响

目的探讨细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,E.g)感染对小鼠肝脏细胞周期相关蛋白表达的影响。方法C57BL/6J小鼠16只随机分为实验组和对照组,实验组8只以细粒棘球蚴原头节混悬液直视下注射肝脏,对照组8只以相同方法注射无菌PBS,感染180 d后处死小鼠,检测血清中转氨酶的变化,HE染色后观察肝组织病理改变,采用Western blot检测p-ERK、PCNA、cyclin A、cyclin D1和cyclin E在肝内的表达。结果与对照组相比,实验组小鼠血清中ALT和AST分别升高0.34倍和2.33倍;镜下可见肝脏病灶出现坏死、炎性细胞浸润和纤维组织形成等多种病理改变,肝内PCNA蛋白表达增加,且在两组间的表达差异有统计学意义(t=2.37,P0.05)。结论 E.g感染宿主后,肝脏损伤与感染应激条件下的代偿性增生同时存在。     

3种药物体外抗细粒棘球蚴原头节作用的比较

目的　通过比较氧苯达唑、阿苯达唑和阿苯达唑脂质体体外抗细粒棘球蚴原头节作用 ,探讨氧苯达唑抗包虫病的作用。　方法　将氧苯达唑、阿苯达唑和阿苯达唑脂质体分别配成高、中、低浓度加入 RPMI16 4 0培养基中 ,体外培养细粒棘球蚴原头节 ,观察其每天的死亡率 ,直到对照组的头节全部死亡为止。　结果　将相同条件下 3种药物作用原头节的死亡率分别与对照组相比 ,阿苯达唑、氧苯达唑高、中、低浓度组与对照组相比 ,差异均有统计学意义 (P<0 .0 5 ) ;而阿苯达唑脂质体仅在高浓度时与对照组的差别有统计学意义 (P<0 .0 5 )。　结论　氧苯达唑、阿苯达唑和阿苯达唑脂质体均有显著的体外抗细粒棘球蚴原头节作用 ;氧苯达唑体外抗细粒棘球蚴原头节作用与阿苯达唑相当 ,可认为是一种新型抗包虫药 ;阿苯达唑脂质体剂型并未显示出特殊的体外抗原头节作用。     

阿霉素体外抗细粒棘球蚴原头节作用研究

目的研究阿霉素(Dox)对细粒棘球蚴原头节的体外抑制作用。方法 4 800个原头节随机分为空白对照组、 1%DMSO组、 Dox组(25、 50、 100、 200、 400、 600μmol/L),每组200个原头节,设3个平行组,体外干预24 h。伊红拒染实验检测Dox干预后原头节活力,统计存活率。扫描电镜观察Dox干预后原头节表面超微结构变化。单细胞凝胶电泳实验检测Dox干预后原头节DNA损伤程度。实时荧光定量PCR (qRTPCR)检测Dox干预后DNA损伤相关基因共济失调毛细血管扩张症突变激酶(ATM)、 p53、 DNA拓扑异构酶2A (Topo2a)的mRNA表达水平。结果伊红拒染实验结果显示,空白对照组、 1%DMSO组、 25、 50、 100、 200、 400、600μmol/L Dox组细粒棘球蚴原头节的存活率分别为(99.0±0.5)%、(98.6±0.3)%、(96.0±1.4)%、(80.3±4.8)%、(75.6±6.2)%、(53.2±3.0)%、(26.4±8.1)%和0, IC50为(267.9±7.1)μmol/L。与空白对照组相比,1%DMSO组、 25μmol/L Dox组原头节存活率差异无统计学意义(P 0.05), 50、 100、 200、400、 600μmol/L Dox组原头节存活率差异有统计学意义(P 0.01)。扫描电镜结果显示,空白对照组、 1%DMSO组原头节表面光滑,头节呈球形或椭圆形,顶突完整,微毛清晰可见;400μmol/L Dox组原头节吸盘变形,体部塌陷严重,顶突轻微变形,微毛明显脱落,虫体表层发生皱缩。单细胞凝胶电泳实验结果显示,100μmol/L Dox组原头节出现拖尾现象,彗星尾距(OTM)为16.6±1.7,与空白对照组(0.1±0.0)相比,差异有统计学意义(P 0.01)。qRTPCR结果显示,1%DMSO组原头节ATM、 p53和Topo2a mRNA相对表达量分别为1.0±0.1、 1.1±0.1、 1.3±0.9,与空白对照组(1.0±0.1、 1.0±0.4、 1.0±0.1)相比,差异无统计学意义(P 0.05)。100μmol/L Dox组原头节ATM、 p53和Topo2a mRNA相对表达量分别为38.6±3.5、 10.0±2.5、 54.0±0.8,与空白对照组相比,差异有统计学意义(P 0.05)。结论Dox具有体外抗细粒棘球蚴原头节作用,可引起虫体DNA损伤,可能与ATM、 p53、Topo2a的mRNA相对表达量变化相关。     

3种药物体外抗细粒棘球蚴原头节作用的比较

目的 通过比较氧苯达唑、阿苯达唑和阿苯达唑脂质体体外抗细粒棘球蚴原头节作用，探讨氧苯达唑抗包虫病的作用。方法 将氧苯达唑、阿苯达唑和阿苯达唑脂质体分别配成高、中、低浓度加入RPMI1640培养基中，体外培养细粒棘球蚴原头节，观察其每天的死亡率，直到对照组的头节全部死亡为止。结果 将相同条件下3种药物作用原头节的死亡率分别与对照组相比，阿苯达唑、氧苯达唑高、中、低浓度组与对照组相比，差异均有统计学意义（P＜0．05）；而阿苯达唑脂质体仅在高浓度时与对照组的差别有统计学意义（P＜0．05）。结论 氧苯达唑、阿苯达唑和阿苯达唑脂质体均有显著的体外抗细粒棘球蚴原头节作用；氧苯达唑体外抗细粒棘球蚴原头节作用与阿苯达唑相当，可认为是一种新型抗包虫药；阿苯达唑脂质体剂型并未显示出特殊的体外抗原头作用。     

甘肃省细粒棘球蚴病聚类分析

根据2012年全国细粒棘球蚴病流行情况调查数据库中甘肃省72个县(市、区)细粒棘球蚴病的调查资料,选取人群患病率、家畜感染率和犬棘球绦虫粪抗原阳性率3个指标,采用样本聚类法进行分析。甘肃省人群棘球蚴病患病率为0~1.59%,家畜感染率为0~15.22%,犬粪抗原阳性率为0~16.87%。聚类分析结果显示,72个县(市、区)存在4种流行类型,第一类地区仅包括敦煌市,人群患病率、家畜感染率和犬粪抗原阳性率分别为0.27%、15.22%和16.87%;第二类地区包括4个县(市、区),3个指标分别为0.43%、6.57%和1.83%;第三类地区包括22个县(市、区),3个指标分别为0.22%、1.15%和10.35%;第四类地区包括45个县(市、区),3个指标分别为0.16%、0.58%和1.69%。     

四种小鼠对细粒棘球蚴感染情况观察

为了解新疆人体细粒棘球蚴对不同种株小鼠的易感性,小鼠感染细粒棘球蚴后对子一代小鼠感染能力的影响,我们采用实验性继发性包虫动物模型(Deve.compleRenclu Sean Boil 1933;144:455)观察感染小鼠对细粒棘球蚴的感染情况,筛选出理想的实验小鼠种株。     

细粒棘球绦虫原头蚴水通道蛋白编码基因的转录组分析

目的应用转录组测序及生物信息学分析细粒棘球绦虫原头蚴水通道蛋白(aquaporins,AQPs)编码基因转录特征及其在细胞代谢通路中的作用。方法应用RNA测序(RNA-seq)技术对细粒棘球绦虫原头蚴进行转录组测序。从原头蚴样品中提取总RNA,纯化mRNA并制备链特异性文库,通过Illumina Hiseq X测序平台对RNA进行测序,然后对原头蚴的AQPs进行生物信息学分析,然后将过滤后序列(Clean Reads)与公共数据库进行BLAST比对。将检测样品与NCBI的参考基因组的序列比对,进行基因表达量分析、可变剪接预测分析及新基因的发掘,查找细粒棘球绦虫水通道蛋白基因型和转录本。结果测序获得6.73Gb Clean Reads,Clean Reads与BLAST比对显示11 593条单基因簇得到功能注释;从检测样品中发掘新基因513个,其中286个得到功能注释;发现细粒棘球绦虫水通道蛋白共5个基因型、8个转录本。结论细粒棘球绦虫原头蚴存在AQPs,该蛋白是定位在细胞膜上的主要内在膜蛋白家族成员,主要参与胆汁分泌代谢通路Ko04976、碳酸氢盐代谢通路Ko04964,可作为细粒棘球蚴病治疗的药物靶点。