EBV-BHRF1基因阳性与阴性细胞株对3种诱导凋亡因素抵抗性差异的研究

目的观察ＥＢＶ┐ＢＨＲＦ１基因阳性（ＳＵＮＥ┐１、Ｒａｊｉ和Ｂ９５┐８）与阴性（Ｋ５６２、ＹＡＣ）细胞株对３种诱导细胞凋亡（ａｐｏｐ┐ｔｏｓｉｓ）因素（无血清培养４８小时，４３℃作用１０分钟或２×１０－６ｍｏｌ／Ｌ地塞米松作用２４小时）的抵抗力差异。方法ＰＣＲ扩增ＥＢＶ┐ＢＨＲＦ１基因片段诱导后经电镜及电泳ＤＮＡ检测细胞凋亡。结果分别从Ｂ９５┐８、Ｒａｊｉ及人低分化鼻咽癌细胞株（ＳＵＮＥ┐１）ＤＮＡ中扩增出ＥＢ病毒的ＢＨＲＦ１全基因片段，而Ｋ５６２、ＹＡＣ细胞株则不含该基因片段。分别经上述３种方法处理后，前３种细胞株的形态及ＤＮＡ电泳行为未发生明显改变，而后２种细胞株则出现典型的细胞凋亡特征，即细胞核凝缩，细胞膜及细胞器基本保持完整；ＤＮＡ电泳出现梯形（Ｌａｄｄｅｒ）条带。结论初步揭示ＢＨＲＦ１基因产物在抑制上述因素所诱导的细胞凋亡方面起着重要作用     

EB病毒BHRF1基因慢病毒载体的构建及功能鉴定

目的:构建并制备能够有效表达EB病毒BHRF1基因的重组慢病毒载体,观察BHRF1表达对人胚肺成纤维细胞(KMB17)凋亡的影响。方法:采用RT-PCR法,从B95-8细胞扩增EBV BHRF1基因,克隆至pWPI GW慢病毒载体上,与pVSVG及pSPAX质粒共转染人胚肾293T细胞,包装出重组慢病毒。将纯化后的重组慢病毒直接感染293T和KMB17细胞,荧光显微镜、实时定量RT-PCR、免疫印迹等方法检测BHRF1在细胞中的表达水平。流式细胞仪检测BHRF1表达对凋亡诱导剂或无血清培养诱发KMB17细胞凋亡的影响。结果:重组慢病毒介导BHRF1在293T和KMB17细胞内获得表达,能有效地抑制KMB17细胞的凋亡。结论:成功构建了表达BHRF1基因的重组慢病毒载体。     

BHRF1表达对鼻咽癌细胞凋亡能力的影响

目的 了解ＥＢ病毒（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒｖｉｒｕｓ）基因ＢＨＲＦ１（ＢａｍＨＩ－ＨｒｉｇｈｔｗａｒｄｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅＩ）表达对鼻咽癌细胞抗凋亡能力的影响。方法 构建表达ＢＨＲＦ１重组载体并转入鼻咽癌细胞株ＣＮＥ２细胞中,以检测癌细胞在＾６０Ｃｏ照射后生物学行为的改变。结果 ＢＨＲＦ１表达可抑制增殖细胞核抗原的表达,促使癌细胞的细胞周期重新分布,癌细胞对辐射的敏感性下降,生存能力增强,结     

EB病毒BHRF1基因表达对鼻咽癌细胞周期分布影响的研究

ＥＢ病毒感染与鼻咽癌的发生和发展明显相关。近来研究发现,ＥＢ病毒编码基因的表达与病毒介导的细胞转化与恶变有关。ＢＨＲＦ１为ＥＢ病毒编码的一个早期基因,其与原癌基因Ｂｃｌ－２具有部分相同的序列和共同的超微结构定位,提示其具有相似的功能和机理,即有抑制细...     

BHRF1表达对鼻咽癌细胞抗凋亡能力的影响

目的了解ＥＢ病毒（ＥｐｓｔｅｉｎＢａｒｖｉｒｕｓ）基因ＢＨＲＦ１（ＢａｍＨＩＨｒｉｇｈｔｗａｒｄｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅＩ）表达对鼻咽癌细胞抗凋亡能力的影响。方法构建表达ＢＨＲＦ１重组载体并转入鼻咽癌细胞株ＣＮＥ２细胞中，以检测癌细胞在６０Ｃｏ照射后生物学行为的改变。结果ＢＨＲＦ１表达可抑制增殖细胞核抗原的表达，促使癌细胞的细胞周期重新分布，癌细胞对辐射的敏感性下降，生存能力增强。结论ＢＨＲＦ１的表达可增强ＣＮＥ２细胞抵抗放射线诱发细胞凋亡的能力。     

鼻咽癌细胞SUNE中EBV—LMP1基因对上皮细胞增殖的影响

目的 研究鼻咽癌细胞系ＳＵＮＥ中ＥＢＶ－ＬＭＰ１基因对上皮细胞增殖的影响,探索ＬＭＰ１在鼻咽癌发生中所起的作用。方法 用ＬＭＰ１基因真核表达质粒转染人胚肾上皮细胞,检测ＬＭＰ１的表达,观察细胞在软琼脂中的集落形成能力,ＭＴＴ吸收能力以及ＰＣＮＡ的表达情况。结果 被ＬＭＰ１基因转染的细胞生长旺盛,能在软琼脂中形成多个集落,ＭＴＴ吸收能力增强,ＰＣＮＡ的表达水平增高。结论 ＬＭＰ１基因能明显改变上皮细     

SHG-44与U251胶质瘤细胞株放射抵抗性差异及其与APEX1 mRNA表达和细胞周期分布的关系

目的 对不同级别的SHG-44与U251胶质瘤细胞株放射抵抗性差异进行比较,探索放射抵抗性与APEX1 mRNA表达及细胞周期分布的关系.方法 采用平板克隆形成实验法检测SHG-44细胞株与U251细胞株之间放射抵抗性的差别;采用RT-PCR技术检测已知的胶质瘤放射抵抗因子APEX1 mRNA的表达情况;流式细胞术检测两种细胞细胞周期的分布情况;直线相关分析分析细胞放射抵抗性与APEX1 mRNA的表达情况及细胞周期分布的关系.结果 与WHOⅣ级的U251相比,WHO Ⅱ～Ⅲ级的SHG-44的放射抵抗性较高(SF2U251=0.58±0.02,SF2SHG-44=0.70±0.15,t=3.19,P＜0.05),但其APEX1 mRNA表达要低(1.17±0.04vs.0.70±0.18,t=19.92,P＜0.05),G1期SHG-44比例高于U251(60.13±3.26 vs.51.72±5.14,t=2.51,P＜0.05),S期SHG-44低于U251(18.57±0.64vs.28.80±2.96,t=5.09,P＜0.05),G2期两者差异无统计学意义(17.63±3.91 vs.21.78±4.81,t=1.25,P＞0.05),G1期比例与SF2存在相关性(r=0.735,P＜0.05).结论 胶质瘤的放射抵抗性与病理级别可能呈负相关,不同类型胶质瘤的放射抵抗机制可能存在差异,APEX1并不是SHG-44细胞放射抵抗性增高的决定因素,G1期阻滞可能是SHG-44细胞放射抵抗性增高的原因之一.     

多发性骨髓瘤的EBV、B7—1及主动免疫治疗研究

目的：探讨EB病毒在多发性骨髓瘤的病因作用及新型疫苗治疗多发性骨髓瘤的作用。方法：用多聚酶链反应（PCR）的方法检测21例多发性性骨髓瘤（MM）患者瘤细胞的EB病毒DNA,应用间接免疫荧光法检测瘤细胞上MHCⅠ、Ⅱ类分子及共刺激分子B7－1的表达,应用细胞因子与瘤细胞制成的疫苗主动免疫治疗4例MM患者,结果：发现66．7％的MM患者瘤细胞内有EB病毒DNA。瘤细胞膜多表达MHCⅠ、Ⅱ分子及B7－1。4例MM患者用疫苗治疗后3例取得明显疗效。结论EB很病毒很可能是MM的病因,与B7－1阳性的细胞及细胞因子联合制成的疫苗主动免疫治疗MMV具有较明显的疗效。     

基因芯片技术筛选Gemcitabine诱导胰腺癌Panc-1细胞凋亡相关基因的研究

目的研究抗癌药吉斯他滨（Gemcitabine）诱导胰腺癌Panc-1细胞凋亡的相关基因。方法应用基因芯片技术检测50．33μg／mL Gemcitabine作用于胰腺癌Panc-1细胞48h后凋亡基因表达的变化。结果Gemcitabine抑制细胞表达14种凋亡相关基因，包括IRF-4、Scotin、14．3．3gamma、PDE4、GRPS、TID1、AFP、STAT5、Sox-4、c-Rel、MYCN、Htt、CatD、Gd。相反，gemcitabine促进了3种凋亡相关基因的表达，包括CyclinB1、ASK1、AKT2。结论Gemcitabine诱导胰腺癌Panc-1细胞凋亡通过非依赖caspase ASK1途径。     

三氧化二砷诱导骨髓瘤细胞SOCS-1基因去甲基化及其对P—STAT3蛋白表达的影响

目的探讨三氧化二砷（AS2O3）对多发性骨髓瘤（MM）细胞内细胞因子信号转导抑制因子-1（SOCS-1）基因甲基化状态的影响及其对磷酸化的信号转导与转录激活因子-3（P．STA33）表达的影响。方法采用甲基特异性PCR法检测AS2O3作用前后MM细胞株U266和CZ-1细胞内SOCS-1基因的甲基化状态,应用蛋白免疫印迹法检测AS2O3处理前后细胞内P—STAT3蛋白的表达变化,并采用流式细胞技术检测AS2O3作用前后MM细胞增殖和凋亡的变化。结果MM细胞株内SOCS-1基因存在程度不同的甲基化状态,与对照组相比,AS2O3作用后MM细胞内SOCS-1基因甲基化程度明显减弱或消失,P—STAT3蛋白的表达也明显减弱,同时细胞生长受抑,凋亡比率升高。AS2O3浓度分别为0、0．5、1．0、2．0μmol／L时,U266细胞株的总凋亡率分别为0．06％、0．56％、48．96％、61．07％（x2=9．19,P〈0．05）;而CZ-1细胞株的总凋亡率分别为4．20％、40．30％、47．72％、68．49％（X2=8．96,P〈0．05）。结论AS2O3可能通过诱导MM细胞内SOCS-1基因去甲基化作用,进-步抑制细胞增殖信号Janus激酶（JAK）-STAT通路的活化,从而诱导MM细胞的凋亡。     

抑癌基因nm23-H1诱导癌细胞凋亡及抗氧化作用的研究

目的：初步探讨ｎｍ２３－Ｈ１基因的抑癌机制。方法：实验将ｎｍ２３－Ｈ１基因经进行入人喉癌细胞Ｈｅｐ－２,使其在细胞中稳定表达。使用电镜观察细胞形态学变化,并测定抗氧化还开型谷胱苷肽（ＧＳＨ）浓度。结果：ｎｍ２３－Ｈ１转化的Ｈｅｐ－２细胞有核固缩、核分离等典型细胞凋亡现象,其ＧＳ浓度也有所升高（１６．９％）。结论：表明ｎｍ２３－Ｈ１具有诱导肿瘤细胞凋亡,提高肿瘤细胞抗氧化能力的作用。     

RNAi沉默卵巢癌耐药细胞株SKOV3／TAXOL内源mdr1基因对细胞增生的影响

目的构建靶向于卵巢癌耐药细胞株中高表达的mdr1基因的短发夹状RNA重组质粒,研究其沉默卵巢癌耐药细胞株SKOV3／TAXOL内源mdr1基因对细胞增生的抑制作用。方法运用基因克隆技术构建靶向于mdr1基因的重组质粒pGPU6／GFP／Neo—mdr1并转染至卵巢癌耐药细胞株SKOV3／TAXOL,CCK-8检测对SKOV3／TAXOL细胞增生的抑制作用。结果构建的重组质粒pGPU6／GFP／Neo—mdr1能明显抑制mdr1基因的表达。CCK-8检测结果表明,转染重组质粒pGPU6／GFP／Neo—mdr1的SKOV3／TAXOL靶细胞的抑制率比对照组显著提高（P〈0．05）。pGPU6／GFP／Neo—mdr1明显抑制SKOV3／TAXOL细胞的增生。细胞凋亡检测显示,pGPU6／GFP／Neo—mdr1转染SKOV3／T后细胞凋亡增加,通过pGPU6／GFP／Neo—mdr1转染SKOV3／T促进凋亡的发生。结论mdr1基因在耐药的卵巢癌细胞增生与凋亡过程中发挥作用,重组质粒pGPU6／GFP／Neo—mdr1可有效地抑制SKOV3／TAXOL细胞内源mdr1基因的表达和mRNA的转录,并抑制细胞的增生和促进凋亡的发生,     

阻断急性髓性白血病细胞Bc1—2表达并诱导其凋亡的研究

目的 探讨特异Ｂc１－２反义脱氧寡核苷酸（ＡＳＡＯＮ）在诱导急性髓性白血病（ＡＭ Ｌ）细胞凋亡中的作用。方法 ３７例ＡＭＬ细胞及６例正常骨髓细胞分别与特异ＡＳＯＮ并定量检测凋亡细胞百分数。结果 ＡＭＬ细胞Ｂcl－３表达量高于正常骨髓细胞。特异ＡＳＯＮ能下调ＡＭＬ细胞Ｂel－２m;ＲＮＡ,并诱导其凋亡,而对正常骨髓细胞影响不大。结论 Ｂcl－２ＡＳＯＮ在治疗ＡＭＬ中有着一定的应用前景。     

EB病毒潜伏膜蛋白1基因多态性与NK/T细胞淋巴瘤的相关性

目的: 探讨EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白1(LMP1)基因变异与山东地区结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤(ENKTL)的相关性。方法:采用巢式PCR和DNA测序检测山东地区EBV阳性ENKTL组织(47例)和健康成年人咽漱液(70例)中LMP1全长序列,与EBV标准株及相关序列进行比对,绘制系统进化树,根据其特征性突变对基因变异进行分类,比较LMP1各变异类型在ENKTL和健康人群中分布的差异。结果:117例标本完成测序,共发现3种主要变异类型:China 1、China 2和Med-,其在ENKTL中的检出率分别为85.1%、8.5%和4.3%,在健康人群中的检出率分别为65.7%、5.7%和21.4%,另有1例(2.1%)ENKTL和5例(7.2%)健康人群为不同亚型的重组病毒株,LMP1亚型在2种人群中的分布差异具有统计学意义(P=0.022)。LMP1 N端XhoI 位点缺失变异即XhoI (-)和C端30 bp缺失即del-LMP1在ENKTL中的检出率(95.7%和85.1%)高于健康人群(74.3%和67.1%),差异均有统计学意义(P=0.003和P=0.029)。结论:山东地区ENKTL中LMP1以China 1亚型、XhoI (-)和del-LMP1为主,带有3种变异型的EBV毒株可能与ENKTL的发生相关。     

通过小干扰RNA沉默mdr-1基因逆转卵巢癌耐药细胞株SKOV3／TAXOL多药耐药的研究

 目的　构建靶向于卵巢癌耐药细胞株中高表达的多药耐药-1（mdr-1）基因的短发夹状RNA重组质粒,探讨RNAi沉默技术逆转卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞多药耐药的可行性。方法　运用基因克隆技术构建靶向于mdr-1基因的重组质粒PGPU6／GFP／Neo-mdr-1并转染至卵巢癌耐药细胞株SKOV3／TAXOL,反转录聚合酶链反应检测到mdr-1基因表达。CCK-8检测对SKOV3／TAXOL细胞增殖的抑制作用。结果　构建的重组质粒PGPU6／GFP／Neo-mdr-1能明显抑制mdr-1基因的表达。蛋白质印迹结果表明,转染重组质粒PGPU6／GFP／Neo-mdr-1的SKOV3／TAXOL靶细胞的抑制率显著提高。RT-PCR检测mdr-1基因mRNA转录水平下降;pPGPU6／GFP／Neo-mdr-1明显抑制SKOV3／TAXOL细胞的增殖。结论　重组质粒PGPU6／GFP／Neo-mdr-1可有效地抑制SKOV3／TAXOL细胞内源mdr-1基因的表达和mRNA的转录,并抑制细胞的增殖和促进凋亡的发生,应用RNAi技术,能够逆转卵巢癌细胞对化疗药物的多药耐药。为化疗耐受的肿瘤细胞提供了新的基因治疗手段。     

白细胞介素1β转换酶基因转导人肝癌细胞株的建立及其生物学特性研究

应用基因重组技术构建了人细胞凋亡基因白介素iβ转换酶(ICE)重组逆转录病毒载体pLXSN-hICE,采用电穿孔法将其与空载体pLXSN导入包装细胞系PA317,筛选G418抗性克隆,并将其病毒上清转入人肝癌细胞株SMMC7721,经G418筛选分别获得阳性克隆SMMC7721-hICE及SMMC7721-neo.RT-PCR分析证实目的基因已整合在SMMC7721-hICE细胞基因组中.细胞生长曲线测定及裸鼠致瘤性分析表明SMMC7721-hICE体外生长速度明显低于对照细胞SMMC7721及SMMC7721-neo,而且在裸鼠体内成瘤性降低(前者3/6,后者6/6),肿瘤发生延缓,肿瘤重量明显减轻.以上结果表明,逆转录病毒介导的人ICE基因转染使肝癌细胞恶性增殖明显受抑,为开展人ICE基因治疗提供了实验基础.     

胶质瘤细胞ING1基因表达水平与肿瘤细胞增殖和凋亡的关系研究

目的探讨胶质瘤细胞ING1基因表达水平及其与肿瘤细胞增殖活性和凋亡程度的关系.方法采用原位杂交及免疫组织化学染色方法,分别检测71例不同级别的人胶质瘤组织ING1 mRNA及ING1、PCNA蛋白,并采用TUNEL法检测原位细胞凋亡的情况.结果ING1 mRNA的阳性表达率为94.6%(35/37),ING1蛋白的阳性表达率为90.1%(64/71),两者的表达水平呈正相关(γ=0.714,P＜0.01),均随肿瘤恶性程度的增高而降低,具有显著性差异(P＜0.05).ING1表达水平降低时伴随着凋亡程度的降低及增殖活性的增强.结论胶质瘤细胞中ING1基因的表达水平与肿瘤恶性程度密切相关,并随肿瘤恶性程度的增加而相应降低.其表达异常的改变主要是转录水平调控异常的结果,并可能通过促进细胞增殖和抑制细胞凋亡,在胶质瘤的发生、发展中发挥重要作用.     

三氧化二砷诱导骨髓瘤细胞SOCS-1基因-去甲基化及其对P-STAT3蛋白表达的影响

 目的 探讨三氧化二砷（AS₂O₃) 对多发性骨髓瘤 (MM) 细胞内细胞因子信号转导抑制因子-1（SOCS-1）基因甲基化状态的影响及其对磷酸化的信号转导与转录激活因子-3（P-STAT3）表达的影响。方法 采用甲基特异性PCR法检测AS₂O₃作用前后MM细胞株U266和CZ-1细胞内 SOCS-1基因的甲基化状态,应用蛋白免疫印迹法检测AS₂O₃处理前后细胞内P-STAT3蛋白的表达变化,并采用流式细胞技术检测AS₂O₃作用前后MM细胞增殖和凋亡的变化。结果 MM细胞株内SOCS-1基因存在程度不同的甲基化状态,与对照组相比,AS₂O₃作用后MM细胞内SOCS-1基因甲基化程度明显减弱或消失,P-STAT3蛋白的表达也明显减弱,同时细胞生长受抑,凋亡比率升高。AS₂O₃浓度分别为0、0.5、1.0、2.0 μmol/L时,U266细胞株的总凋亡率分别为0.06%、0.56%、48.96%、61.07%（χ²=9.19,P<0.05）;而CZ-1细胞株的总凋亡率分别为4.20%、40.30%、47.72%、68.49%（χ²=8.96,P<0.05）。结论 AS₂O₃可能通过诱导MM细胞内SOCS-1基因去甲基化作用,进一步抑制细胞增殖信号Janus激酶（JAK）-STAT通路的活化,从而诱导MM细胞的凋亡。