柯萨奇病毒B组3型VP1基因真核表达重组质粒诱导小鼠中和抗体反应

以构建的柯萨奇病毒Ｂ 组３ 型（ＣＶＢ３）ＶＰ１ 基因的真核表达重组质粒ｐＣＥＰ４ＣＶＢ３ＶＰ１ 作为候选的基因疫苗,评价其诱导小鼠产生的中和抗体反应。大量制备并提纯ｐＣＥＰ４ＣＶＢ３ＶＰ１ ＤＮＡ,用其接种ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠,取血清进行病毒中和试验。结果证明其可诱导小鼠机体产生特异性中和抗体,并能中和ＣＶＢ３ 毒力,起到基因疫苗的预防作用。     

柯萨奇B组病毒3型VP1基因疫苗免疫效果的研究

目的 为研制防治病毒性心肌炎的基因疫苗打下基础。 方法 以带有ＣＶＢ３Ｐ１、Ｐ２区核酸序列的ｐＧＥＭ质粒为模板，用ＰＣＲ方法克隆ＣＶＢ３ＶＰ１基因ｃＤＮＡ，插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３中的ＨｉｎｄⅢ和ＸｂａＩ位点之间，构建成重组质粒。经大量扩增纯化后，肌肉注射免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠３次，用ＣＶＢ３毒株攻击小鼠，取血及脾细胞检测其免疫效果。 结果 小鼠经３次免疫后，虽未测出明显免疫应答指标，但诱导了Ｔ     

柯萨奇B组病毒3型VPI基因疫苗免疫效果的研究

目的为研制防治病毒性心肌炎的基因疫苗打下基础。方法以带有CVB。P1、P2区核酸序列的pGEM质粒为模板,用PCR方法克隆CVB3VP1基因cDNA,插入真核表达载体pcDNA3中的HindⅢ和XbaⅠ位点之间,构建成重组质粒。经大量扩增纯化后,肌肉注射免疫BALB／c小鼠3次,用CVB3毒株攻击小鼠,取血及脾细胞检测其免疫效果。结果小鼠经3次免疫后,虽未测出明显免疫应答指标,但诱导了T、B细胞的免疫记忆反应,免疫组鼠在CVB3毒株攻击后,迅速诱导产生了强烈的二次免疫应答。结论CVB3VP1基因疫苗对CVB3毒株的攻击有一定程度的保护作用。     

柯萨奇病毒B组3型VP1基因真核表达重组质粒诱导小鼠中和？…

以构建的柯萨奇病毒Ｂ组３型（ＣＶＢ３）ＶＰ１基因的真核表达重组质粒ｐＣＥＰ４－ＣＶＢ３ＶＰ１作为侯选的基因疫苗，评价其诱导小鼠产生的中和抗体反应。大量制备并提纯ｐＣＥＰ４－ＣＶＢ３ＶＰ１ ＤＮＡ，用其接种ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，取血清进行病毒中和试验。结果证明其可诱导小鼠机体产生特异性中和抗体，并能中和ＣＶＢ３毒力，起到基因疫苗的预防作用。     

一株引起无菌性脑膜脑炎柯萨奇B组3型病毒的分离和VP1基因分析

目的对一株从无菌性脑膜脑炎患者中分离到的柯萨奇B组3型病毒(coxsackie virus B3,CVB3)分离株KMA103-09进行VP1区的基因特征分析。方法采用Hep-2、RD细胞对患者粪便标本进行病毒分离,肠道病毒组合血清进行鉴别,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒目的片段,测序后进行VP1基因分析,用Mega4.1等软件分析处理。结果肠道病毒组合血清鉴别为柯萨奇病毒B组3型(Cox.B3),从病毒性脑膜脑炎患者粪便标本中,分离到CVB3,其VP1区的核苷酸长度为849bp,未发现核苷酸插入与丢失。与山东04433/SD/CHN/2004/CB3株、山东05280/SD/CHN/2005/CB3株及山东YZ127/SD/CHN/2005/CB3株氨基酸同源,与其余国内分离株同源性高于为99.29%,与国外毒株的同源性为95.41%~96.47%。在进化树上与AM06HZ/SD/CHN/2006/CB3株显示在同一个分支上。结论分离的肠道病毒为柯萨奇病毒B组3型(Cox.B3),分离株(KMA103-09)VP1区变异较小。     

柯萨奇病毒B组3型疫苗研究进展

柯萨奇病毒B组3型（coxsackie virus B3,CVB3）属于小核糖核酸病毒科（picornaviridae）,肠道病毒属（enterovirus）,通常感染后会使人出现发热、打喷嚏、咳嗽等感冒症状,但也可导致新生儿、婴幼儿以及免疫缺陷的成人出现严重的心脏、胰腺及中枢神经系统症状[1]。根据美国疾病预防控制中心（CDC）统计数据发现,     

柯萨奇病毒B1/B3型二价VP1基因疫苗的构建及其免疫试验

目的 构建柯萨病毒（CV）B1／B3型二价VP1免疫质粒,并探讨其免疫原性。方法 通过逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）技术扩增CVB1的主要中和抗原VP1基因,将分别由CMV和SV40启动子控制的 CVB1和CVB 3的VP1基因反向串联插入到真核表达载体pCR3-Uni中。将该质料一转染鼠NIH3T3细胞,于转染后24、48、96h进行免疫荧光及RT－PCR检测,应用重组质粒免疫BALB／c小鼠,于免疫前、免疫后2 、4、6周分别断尾采血,用ELISA方法检测CVB特异性抗体。结果 获得了含有CVB1和CVB3的VP1南粒,RT－PCR及免疫荧光检测结果表明该质粒在NIH3T3细胞获得瞬时表达,小鼠免疫后4、6周均有特异性抗体产生。结论 本研究构建的CVB1／B3型二价VP1基因疫苗能诱导小鼠产生CVB特异性抗体,可以作为候选基因疫苗。     

河南省2010年柯萨奇病毒A组16型VP1区基因特征分析

目的了解河南省2010年柯萨奇病毒A组16型(CA16)流行株VP1区基因特征。方法对河南省2010年手足口病(HFMD)粪便和咽拭子样品中分离到的10株CA16病毒,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法进行VP1编码区基因扩增,对扩增产物进行测序,利用生物信息学软件对序列分析,与已报道的CA16标准株序列构建基因亲缘关系树。结果 10株CA16毒株,其VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别为90.9%~100.0%,99.3%~100.0%,与国际CA16标准株G10在VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别为67.0%~69.0%,72.0%~74.0%。亲缘进化树显示全部CA16株可分为A和B两个基因型,B基因型又可分为B1和B2两个基因亚型。河南省分离的CA16毒株全部属于B1基因亚型,同时包含B1a和B1b两条进化分支在河南省共同流行。结论河南省手足口病感染CA16病毒的流行株属B1基因亚型,有B1a和B1b两个进化分支共同进化和循环。     

一株柯萨奇病毒B组5 型(Cox.B5) 病毒的分离及VP1基因分析

目的研究2009年昆明市无菌性脑膜炎的病原柯萨奇B5(coxsackie virus B5,CVB5)分离株(KMA193-09)的VP1基因特征。方法采用RD细胞、Hep-2细胞对患者粪便标本进行病毒分离,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒VP1基因并进行序列测定,用Mega 4.0等软件分析处理。结果从无菌性脑膜炎患者粪便标本中,分离到CVB5,其VP1区的核苷酸长度均为831bp,未发现核苷酸插入与丢失。与浙江COXB5/ZHEJIANG/12/02(CFS)株、山东02336/SD/CHN/2002/CB5株及浙江COXB5/ZHEJIANG/13/02株氨基酸同源性最高为98.19%,与国外毒株的同源性为95.67%～97.83%。在进化树上与YZ081/SD/CHN/2005/CB5株显示在同一个分支上。结论分离的肠道病毒为柯萨奇病毒B组5型(CVB5),分离株(KMA193-09)VP1区变异较小。     

柯萨奇病毒B组3型VP1和IL-15双表达基因疫苗对小鼠的免疫效果

目的构建柯萨奇病毒B3(CoxsackievirusB3,CVB3)VP1与白细胞介素 15 (interleukin 15 ,IL 15 )双表达基因疫苗 ,并观察其对小鼠的免疫效果。方法从CVB3VP1基因的重组质粒 pcDNA3/VP1上扩增出带有完整表达构件的VP1基因 ,克隆至IL 15基因重组质粒 pcDNA3/IL 15 ,构建成双表达重组质粒 pcDNA3/VP1 IL 15 ,转化DH5a大肠杆菌 ,大量扩增后 ,肌内注射Balb/c小鼠 ,1次 /周 ,共 3次 ,每次免疫后第 6天取血清 ,用微量中和试验方法检测血清中和抗体。第 3次免疫后的第 7天 ,用 80 0TCID5 0CVB3感染小鼠 ,观察各组小鼠的生存情况。结果构建的 pcDNA3/VP1 IL 15重组质粒目的基因与CVB3 VP1和IL 15的序列相同 ;免疫小鼠后 pcDNA3/VP1 IL 15重组质粒能诱导机体产生中和抗体 ,抗体滴度随免疫次数增加而提高 ;病毒攻击后 pcDNA3/VP1 IL 15和 pcDNA3/VP1 pcDNA3/IL 15组较其他组生存时间明显延长 (P <0 .0 5 )。结论本研究成功构建了 pcDNA3/VP1 IL 15真核双表达重组质粒 ;该质粒能诱导机体产生中和抗体 ,对CVB3毒株的攻击有一定程度的保护作用。     

uPA基因真核表达载体的构建和鉴定

目的:构建人尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)基因真核表达载体,并转染人肝癌细胞,为进一步体外研究uPA在肝癌发生发展中的作用奠定基础.方法:从肝癌组织中提取RNA,通过RT-PCR的方式,获得基因uPA的全长cDNA,并克隆于含有HA2-标签(tag)的真核表达载体pCMV上,酶切鉴定,质粒测序鉴定,用pCMV-uPA-HA2进行细胞瞬时转染及WesternBlotting鉴定.结果:经过测序证实得到获得包含uPA基因的pCMV-HA2真核表达载体,瞬时转染细胞有蛋白表达.结论:克隆了人肝癌的uPA基因,成功构建真核表达载体.     

真核表达质粒pcDNA3-hsp70的构建及鉴定

目的：构建并鉴定真核表达质粒pcDNA3—hsp70。方法：用基因释放刑提取人结核杆菌H37Rv株的基因组作为模板，进行PCR扩增、获得hsp70目的基因后，与pcDNA3载体进行连接重组。结果：pcDNA3—hsp70真核表达质粒构建完成后，用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列分析等多种方法进行鉴定，证实其构建成功。结论：pcDNA3—hsp70真核表达质粒的成功构建，为进一步研究该真核表达质粒的免疫保护效果及制备结核病pcDNA3—hsp70DNA疫苗奠定了基础。     

白细胞介素-2基因佐剂对柯萨奇病毒B3 VP1基因疫苗的免疫增强作用

目的探讨白细胞介素 2 (interleukin 2 ,IL 2 )基因佐剂对柯萨奇病毒B3(CoxsackievirusB3,CVB3)基因疫苗的免疫增强作用。方法将 pcDNA3/IL 2 pcDNA3/VP1、pcDNA3/VP1、pcDNA3/IL 2、空白质粒 pcDNA3和生理盐水分别肌内注射免疫BALB/C小鼠 ,1次 /周 ,共注射 3次 ,每次注射后的第 6天断尾取血 ,用微量中和试验方法检测血清中和抗体 ;第 3次注射后的第 7天用 80 0TCID50 CVB3感染小鼠 ,观察各组小鼠的生存情况。结果pcDNA3/IL 2 pcDNA3/VP1和 pcDNA3/VP1组小鼠能产生中和抗体 ,抗体滴度随免疫次数增加而提高 ,pcDNA3/IL 2 pcDNA3/VP1组抗体水平高于同期 pcDNA3/VP1组抗体水平 ,但各组小鼠的生存率无显著性差异(P >0 .0 5 )。结论IL 2基因佐剂对 pcDNA3/VP1诱导抗体产生有一定免疫增强作用。     

pcDNA3.1-preS1-GFP重组质粒构建及其小鼠精子表达

目的构建绿色荧光蛋白（GFP）与乙型肝炎病毒（HBV）preS1基因的重组真核表达载体并观察其在小鼠精子内的表达。方法采用PCR方法 ,以HBV全基因组质粒为模板扩增HBVpreS1基因片段,利用DNA重组技术将其定向插入到含有GFP的真核表达载体pcDNA3.1-GFP,经酶切及测序鉴定后,用脂质体介导法转染小鼠精子,在荧光显微镜下观察并应用PCR技术检测HBVpreS1基因的存在与表达情况。结果成功构建了pcDNA3.1-preS1-GFP真核表达载体,将其转染小鼠精子后,在荧光显微镜下观察到转染精子头部有绿色荧光,PCR扩增得到位于HBVpreS1基因区域内长约589bp的片段。结论重组质粒pcDNA3.1-preS1-GFP的成功建立及其在小鼠精子内的表达,为建立新的HBVDNA垂直传递的小鼠模型奠定了实验基础。     

水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E真核表达载体的构建与鉴定

目的 :构建水痘 -带状疱疹病毒 (VZV)糖蛋白E(gE)真核表达质粒。方法 :以水痘 -带状疱疹病毒基因组DNA为模板 ,用PCR扩增出约 85 2bpVZVgE片段。将其分别与pUC -T载体连接。经过蓝白筛选后 ,用双酶切得到目的基因片段 ,定向克隆到pcDNA3载体中。并用PCR、电泳和基因测序方法鉴定。结果 :用PCR方法扩增出与预期大小相符的VZVgE基因片段 ,蓝白筛选得到白色菌落及pUC -VZVgE载体 ,用PCR、电泳和基因测序方法证实pcDNA3-VZVgE(pcVZV -E)及pUC -VZVgE构建成功。结论 :本试验构建的pcVZV -E真核表达质粒 ,含有真核表达所必需的启动子等元件。目的基因克隆方向正确 ,读码框与翻译产物和VZVgE相符合 ,为进一步研制VZVDNA疫苗提供了有利条件     

结核分支杆菌早期分泌性蛋白ESAT-6基因真核表达重组质粒的构建及鉴定

目的 :构建结核分支杆菌早期分泌性蛋白ESAT - 6真核表达重组质粒。方法 :以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板 ,用PCR法对ESAT - 6基因进行扩增 ,PCR反应产物经酶切后 ,克隆于真核表达载体pcDNA3.1( )上。结果 :构建了结核杆菌基因ESAT - 6真核表达重组质粒pcDNA3.1( ) -ESAT - 6 ,测序报告ESAT - 6基因已正向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1( )上。结论 :结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT - 6真核表达重组质粒的成功构建为结核病的诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测打下了基础。     

大鼠肝再生增强因子真核表达质粒的构建及其抗急性肝功能衰竭作用的研究

目的研究肝再生增强因子真核表达质粒对急性肝功能衰竭的保护作用。方法PCR扩增的大鼠肝再生增强因子基因与真核表达载体 pcDNA3重组 ,重组后转化到大肠杆菌DH5α细胞内 ,扩增后提取重组的pcDNA3质粒。将重组的 pcDNA3质粒 (2 0 0 μg/kg)和生理盐水分别注射到 5 0 ?L4复制的急性肝功能衰竭大鼠腹腔。在CCL4染毒后 4h开始注射 ,存活超过 96h计为存活 ,观察肝再生增强因子对大鼠急性肝功能衰竭的保护作用。结果 pcDNA3 ALR重组质粒目的基因与文献报道的大鼠ALRcDNA序列相同。pcDNA3 ALR重组质粒应用后 ,肝功能衰竭大鼠存活率 4 0 % ,明显高于生理盐水对照组的存活率 (1 5 % ,P <0 .0 1 )。结论肝再生增强因子基因能明显提高CCL4诱导的急性肝功能衰竭大鼠的存活率