人类神经干细胞的长期培养和传代

目的：探讨人类神经干细胞的体外培养条件及其传代的方法。方法：采用机械方法从胎脑中分离神经细胞，应用N2培养基进行培养，碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和表皮生长因子(EGF)刺激细胞扩增；传统方法和对神经球切割的方法进行传代培养；应用免疫组织化学染色对培养的细胞及其分化的细胞进行鉴定。结果：从流产胎脑当中成功培养出人类的神经干细胞，培养条件下呈悬浮状态生长，形成神经球，绝大多数的细胞表达波形蛋白和Musashi1两种神经干细胞的标志物；这种细胞可分化为神经元和星型胶质细胞，早期的培养有少量的少突胶卷质细胞；在这种培养条件下，神经干细胞生长速度较慢，而采用切割神经球的方法保持了细胞间的联系，神经干细胞可获得较大的扩增速度。结论：体外的培养条件下，可从胎脑组织中培养出神经干细胞，它可做为中枢神经系统疾病移植治疗的潜在细胞来源。     

人胚神经干细胞的长期培养和传代

目的 探讨人胚神经干细胞的体外培养条件及传代方法.方法 采用机械方法从胎脑中分离神经细胞,用Eagles MEM培养基,加入碱性成纤维生长因子和表皮生长因子刺激细胞增殖,传统的方法进行传代培养;应用免疫组织化学和免疫荧光染色对培养的细胞及分化的细胞进行鉴定.结果 培养第8天,细胞具备神经元形态;折光性强的锥形或圆形胞体及长的多极突起.免疫组化和免疫荧光染色,神经元特异性烯醇化酶、神经蛋白、胶质纤维酸性蛋白酶、微管相关蛋白为阳性.结论 在体外的培养条件下,可以从胎脑组织中培养出神经干细胞,为中枢神经系统疾病移植打下了基础.     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养和鉴定

目的探讨大鼠胚胎神经干细胞体外分离培养增殖及分化,为进一步的实验研究提供基础。方法取孕14~16 d的SD大鼠胚胎端脑皮层在条件培养基中培养增殖传代分化,用神经干细胞特异性抗体———巢蛋白(Nestin)鉴定克隆细胞,用特异性的单克隆抗体鉴定克隆球诱导分化后的细胞。结果获得了大量自我增殖并分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的神经干细胞。结论成功分离并获得了大鼠胚胎端脑皮层神经干细胞,并连续稳定传代,具有多向分化潜能,可用于进一步的实验研究。     

神经干细胞的分离培养和鉴定及体外长期培养

目的探索新生SD大鼠神经干细胞的分离培养、鉴定及体外长期培养的方法。方法分离新生SD大鼠海马组织,用无血清培养技术培养神经干细胞,免疫组织化学荧光技术检测其巢蛋白(Nestin)的表达;并用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)掺入试验,免疫荧光双标技术观测神经干细胞的增殖状况。诱导神经干细胞分化,分别用神经元特异性核抗原(NeuN)抗体、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体、2,3-环核苷酸磷酸二脂酶(CNPase)抗体进行免疫组织化学荧光染色鉴定分化细胞。结果获得大量未分化呈巢状悬浮生长的神经干细胞团,并能分化为神经元和神经胶质细胞,且经传代培养10代以上仍具干细胞特性。结论成功培养出胚胎大鼠神经干细胞,培养出的细胞具有增殖、自我更新及多潜能分化能力,可分化为神经元及神经胶质细胞并可作为神经干细胞移植实验研究的供体细胞。     

不同生长基质对体外培养神经干细胞迁移的影响

【目的】建立神经干细胞培养的模拟体内条件，为寻找更合适的生长基质提供参考。【方法】体外培养获得的大鼠胚胎神经干细胞克隆球种植于用人血浆纤连蛋白和多聚-L-鸟氨酸处理的培养瓶内，观察细胞迁移及生长状况，分析人血浆纤连蛋白和多聚-L-鸟氨酸对神经干细胞生长迁移的影响。【结果】与未用以上两种基质处理的对照组相比，处理组都有细胞迁移，但多聚-L-鸟氨酸的效果比人血浆纤连蛋白的效果明显，二者协同作用对神经干细胞迁移效果更显著。【结论】生长基质对体外培养神经干细胞的贴壁生长及细胞迁移中具有重要作用。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及分化研究

目的:研究大鼠胚胎神经干细胞体外分离、培养的条件及增殖、分化特性。方法:取胎龄15~17 d的SD大鼠胎脑海马及室周组织,在含碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF),表皮生长因子(EGF),B27、N2添加剂的无血清培养基中培养,用有限稀释法进行克隆、传代,免疫细胞化学法鉴定神经干细胞克隆球及诱导分化后的细胞。结果:大鼠胎脑能在体外培养获得大量神经干细胞,并分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论:胚胎脑组织有丰富的神经干细胞,可在体外长期培养并保持干细胞特性,能分化为神经元、胶质细胞等终末细胞。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

利用无血清培养和细胞克隆技术从孕鼠(14d)胚胎中分离出神经干细胞，并进行传代培养，采用免疫细胞化学技术检测神经巢蛋白和成熟脑细胞特异性抗原神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表达，同时采用H-E染色法鉴定神经细胞类型。证实从大鼠胚胎大脑皮质分离出的细胞具有连续的克隆能力，并表达神经巢蛋白，分化的细胞表达神经元和神经胶质细胞的特异性抗原，为中枢神经系统的干细胞。     

人胚神经干细胞的长期体外培养

目的：建立人胚神经千细胞（human Neural Stem Cells、hNSC）的体外培养体系。方法：选取3个月～4个月大的引产胎儿，分离原代人胚神经千细胞、添加碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、N2促进hNSC的增殖，使用免疫细胞化学方法与诱导分化实验鉴定其神经千细胞的特性。结果：成功培养出人胚神经干细胞、原代培养的hNSC悬浮生长，似桑椹状，表达巢蛋白（Nestin）抗原，诱导分化后可表达神经元与神经胶质细胞特异抗原βⅢ与神经胶质细胞特异抗原GFAP，并能自我增殖：目前已成功传代10余次（5月余）。结论：使用本方法可以获得大量纯化hNSC？为临床实验提供适合的移植材料。     

新生大鼠神经干细胞的体外分离和培养

目的改进大鼠神经干细胞的分离和培养方法。方法用出生1～3d的新生大鼠，取脑用刀片剁碎和吸管吹打的机械分离法代替酶消化法。用免疫细胞化学法鉴定神经干细胞、神经元和星形胶质细胞。结果用机械分离法从新生大鼠脑组织分离神经干细胞的获得率较高，并培养出较多的神经球，还能分化成神经元和星形胶质细胞。结论该方法简便，能得到较多的神经球，细胞获得率也较高。     

人脑神经干细胞的分离培养和鉴定

目的 探讨人脑神经干细胞的分离培养和鉴定方法。方法 采用无血清培养液从人胚胎脑皮质分离和培养神经干细胞，并应用免疫荧光技术进行细胞自我更新能力、巢蛋白表达和多向化潜能的鉴定。结果 鉴定表明从人胚胎脑皮质分离培养的细胞具有神经干细胞的特征，并可在体外增殖，经诱导可分化为神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞。结论 从人胚胎脑皮质成功分离培养了神经干细胞，它是研究细胞诱导分化的良好模型。     

组织块法体外培养人胚胎神经干细胞

目的：探讨体外分离、培养人胚胎脑组织神经干细胞的实用方法。方法：从人胚胎脑额叶皮层分离组织块，采用DMEM／F12＋N2无血清培养基，进行体外培养、传代。采用免疫细胞化学法鉴定神经干细胞和分化后的其他细胞表型。结果：从人胚胎脑额叶皮层分离的细胞具有增殖和多向分化潜能，可进行传代培养，获得的细胞中大部分为Nestin表达阳性的细胞。诱导分化后可以出现NSE、GFAP表达阳性的细胞。结论：用上述方法分离培养的细胞具有神经干细胞的特性，并表达Nestin蛋白，认为是神经干细胞。此方法是一种具有实用价值的体外培养人胚胎脑神经干细胞的技术。     

人胚脑神经干细胞的分离、培养和鉴定

目的：探讨人胚脑神经干细胞的体外生长特性、分化情况和培养条件，为相关实验研究提供条件。方法：利用神经干细胞的条件培养基，对从9周和12周胚龄的自然流产胎儿分离的前脑、后脑进行神经干细胞培养，并比较其生长特性。以免疫荧光细胞化学技术检测神经上皮干细胞蛋白(Nestin)和分化后神经细胞抗原的表达。结果：两胚龄前、后脑组织中均分离出神经干细胞，他们均表达Nestin抗原阳性。血清诱导分化后，表达神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原。9周胚龄的脑组织原代培养形成细胞克隆的比例高于12周胚龄的脑组织。在条件培养基存在的情况下，后脑组织分离的神经干细胞比前脑组织来源的更容易分化。结论：从人胚脑组织中的前、后脑中分离出神经干细胞，较小胚龄的脑组织原代培养时细胞克隆的形成比例较高，后脑组织分离的神经干细胞比前脑组织来源的更容易分化。     

胰酶和Ⅳ型胶原酶在人胚胎干细胞传代中的作用特点

目的对比人胚胎干细胞(hESC)培养过程中不同的酶消化细胞的特点,探讨适合hESC长期体外培养的消化传代方法。方法将正常生长在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)滋养层上的hESC分别用0.05%胰酶-EDTA和Ⅳ型胶原酶消化,重新接种,了解两种酶消化后的细胞存活率、克隆形成数量、细胞产量、冻存-复苏后细胞的存活率以及长期传代后细胞核型情况。结果用0.05%胰酶-EDTA消化传代后形成的克隆大小均一,每代第3d可获得碱性磷酸酶(AP)阳性克隆数(21.2±3.5)个/10倍视野,每次传代时hES细胞产量可达(4.56±1.29)×105/cm2,传代时细胞存活率高达95.60%,经冻存-复苏后也有81.20%细胞存活率。用Ⅳ型胶原酶消化组每代仅可获得低浓度胰酶消化组AP阳性克隆数的一半,克隆大小不均,细胞产量也比低浓度胰酶消化组少,传代时细胞存活率和复苏后细胞存活率和低浓度胰酶组相似。分别用两种酶处理传代十余代,核型均无异常。结论两种酶消化均适用于hESC培养,二者作用特点不完全相同,分别适用于不同的实验需要。     

人胚胎海马神经干细胞体外培养方法的建立

为建立人胚胎海马神经干细胞的体外培养方法 ,防止神经干细胞在培养过程中的分化 ,确立最佳的传代时机和方法 ,分离 1 6周人胚海马组织 ,采用无血清培养基对所分离的神经干细胞进行体外培养 ,比较不同培养条件与方法所获得的神经球数量的差异。结果 :建立了人胚胎海马神经干细胞体外培养的优化条件 ,确立了最佳传代方法与时机。提示 :人胚胎海马神经干细胞在体外抑制分化的条件下可以长期处于未分化状态增生 ,并且可多次传代。     

大鼠胚胎神经干细胞培养方法的比较

用多种方法培养大鼠胚胎神经干细胞并诱导其分化 ,应用相差显微镜和免疫荧光染色方法对其进行观察和比较。发现在培养液中同时加入bFGF和EGF ,并采用较高的细胞种植密度 ,干细胞增生速度最快。提示 2种神经生长因子对加快干细胞的增生具有协同作用 ,适当提高干细胞的种植密度可加快其增生速度     

Culture and Identification of Human Amniotic Mesenchymal Stem Cells

Objective To establish the method of isolation, purification, and identification of human amniotic mesenchymal stem cells （hAMSCs）. Methods hAMSCs were isolated from human amniotic membrane by trypsin-collagenase digestion, and cultured in Dulbecco＇s modified Eagle＇s medinm/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum. Phenotypic characteristics of these cells were analyzed by means of immunocytochemistry and flow cytometry. Results The cells successfully isolated from human amniotic membrane expressed representative mesenchymal cell surface markers CD44, CD90, and vimentin, but not CD45. Conclusions This study establishes a potential method for isolation of hAMSCs from human amnion, in vitro culture, and identification. The isolated cells show phenotypic characteristics of mesenchymal stem cells.     

大鼠胚胎脊髓源性神经干细胞的培养和分化

目的探讨大鼠脊髓源性胚胎神经干细胞体外分离培养增殖及分化,为进一步的实验研究提供基础。方法取孕14~16 d的SD大鼠胚胎脊髓在条件培养基中培养增殖传代分化,用神经干细胞特异性抗体—巢蛋白(Nestin)鉴定克隆细胞,用特异性的单克隆抗体鉴定克隆球诱导分化后的细胞。用Brdu免疫荧光对神经干细胞传代能力检测。结果获得了大量能自我增殖并分化的神经干细胞,分化后主要产生神经元特异性微管相关蛋白染色阳性的神经元质纤维酸性蛋白阳性的星型胶质细胞和少突胶质细胞三种神经组织细胞。Brdu免疫荧光显示神经球中绝大多数细胞为Brdu阳性细胞,其细胞核中可见荧光标记物。结论大鼠胚胎脊髓能分离、培养出神经干细胞,并能诱导分化为神经元、星型胶质细胞和少突胶细胞。     

新生大鼠海马神经干细胞的分离培养和鉴定

目的建立神经千细胞分离、培养方法。方法从新生大鼠海马组织分离神经干细胞，进行体外培养、传代，应用免疫荧光细胞化学方法观察鉴定神经干细胞和分化后神经细胞抗原的表达。结果从海马组织中分离出的神经千细胞具有增殖能力，可进行传代培养，获得的细胞克隆表达Nestin阳性，分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原。绪论分离堵养的细胞具有自我更新、增殖和多分化潜能，是神经干细胞。