抗坏血酸/聚已酸内酯生物材料修复新西兰白兔软骨缺损

目的 探讨抗坏血酸复合聚已内酯(PCL-AA)生物材料在关节软骨缺损修复过程中的作用.方法 将8只雄性6月龄新西兰白兔完全随机分成3组,每只动物于双侧膝关节股骨膑股关节面制备直径3.5 mm、深3 mm的单纯软骨缺损模型,不钻通骨髓腔.A组:PCL-AA;B组:单纯PCL材料;C组:单纯手术空白对照,其中A、B两组填充材料后加入制备好的纤维蛋白胶(10 μg)和凝血酶原(10 μg)混合物以固定材料,空白对照组制备缺损仅冲洗缝合,不予特殊处理.于术后6周和12周,取材,进行大体观察、HE染色、番红固绿染色、Wakitani修复效果评分以及相关定量分析.结果 6周标本外观上A组修复效果明显优于B组,C组未见软骨缺损修复,边界清楚,中央凹陷明显.A组缺损被白色半透明坚硬组织修复,富有光泽.Wakitani评分A组优于B、C两组(P＜0.05).12周A组番红固绿染色显示软骨修复情况优于6周A组标本.HE染色各组均未见急慢性炎症细胞浸润.新生软骨面积百分数和新生软骨细胞数定量分析提示PCL-AA组均明显大于单纯PCL材料组(P＜0.05),C组未见明显软骨长出.结论 PCL-AA生物材料具有良好的生物相容性,可以有效修复兔关节软骨损伤,可能成为关节软骨损伤治疗新的治疗方法.     

软骨细胞与骨髓间充质干细胞隔离共培养构建组织工程化软骨

目的探讨隔离共培养条件下,软骨细胞诱导骨髓间充质干细胞（BMSCs）向软骨细胞分化并形成软骨组织的能力。方法分别提取并培养兔BMSCs和耳软骨细胞,以5．0×10^7／ml的终浓度接种于聚羟基乙酸／聚乳酸（PGA／PLA）支架上并置于Transwell室内。实验组Transwell下方为贴壁软骨细胞,对照组Transwell下方为DMEM培养液（含10％胎牛血清）。两组BMSCs-支架复合物体外培养8周后植入裸鼠皮下,继续培养6周后取材。通过大体观察、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测、组织学及免疫组织化学等相关检测对新生组织进行评价。结果体外培养期间,实验组和对照组BMSCs在支架上黏附良好并能分泌细胞外基质,RT-PCR检测示实验组Ⅱ型胶原和蛋白聚糖有较强的表达,而对照组两者的表达较低或检测不到。裸鼠皮下培养6周,实验组BMSCs-支架复合物能基本保持原形,组织学染色及免疫组织染色显示新生组织有明显的软骨陷窝形成并表达软骨特异性细胞外基质。对照组BMSCs-支架复合物逐渐皱缩变形,未见形成软骨样组织。结论采用Transwell隔离共培养的方法,软骨细胞能够诱导BMSCs向软骨细胞分化。     

软骨细胞与骨髓基质细胞共培养体外软骨形成的实验研究

目的探讨软骨细胞与骨髓基质细胞(BMSC)共培养体外构建软骨的可行性,以阐明软骨细胞能否诱导BMSC向软骨细胞分化并形成软骨组织. 方法分别培养猪的BMSC与耳软骨细胞,将2种细胞按82(BMSC软骨细胞)比例混匀,以5.0×107/ml的终浓度接种于聚羟基乙酸/聚乳酸支架(PGA/PLA,直径9 mm,高3 mm)作为共培养组,相同终浓度的单纯软骨细胞和单纯BMSC分别接种于相同支架作为阳性对照及阴性对照,1.0×107/ml(相当于共培养组中软骨细胞数)的单纯软骨细胞接种作为低浓度软骨细胞对照.每组各接种6例标本,每例接种细胞悬液200 μl.全部标本均于体外培养8周后取材,通过大体观察、湿重测定、蛋白多糖含量测定、组织学及免疫组织化学等相关检测对新生软骨进行评价. 结果各组细胞均与材料支架黏附良好.共培养组及阳性对照组(软骨细胞组)体外培养8周后均形成了成熟的软骨组织,并基本保持了复合物初始的大小和形状,2组新生软骨外观及组织学特征基本相同,免疫组织化学也显示2组均表达软骨特异性细胞外基质Ⅱ型胶原.定量测定结果表明,共培养组的平均湿重和蛋白多糖含量均达到阳性对照组的80%以上.阴性对照组(单纯BMSC组)在体外培养过程中逐渐皱缩变形,仅在组织块边缘的局部区域形成了极少量软骨样组织.低浓度软骨细胞组在体外培养过程中也出现了明显的皱缩变形,新生软骨平均湿重仅达到阳性对照组的40%左右,组织学显示只在局部形成了不连续的软骨组织. 结论软骨微环境在BMSC成软骨分化及体外软骨形成中具有重要作用,软骨细胞能有效地诱导BMSC向软骨细胞分化并促进BMSC体外软骨形成.     

人髁突软骨细胞培养方法探讨

目的探讨人胚髁突软骨细胞培养方法。方法分离出人胚髁突软骨组织,分别采用组织块培养法、传统两次酶消化法、改良酶消化法进行髁突软骨细胞原代培养,倒置相差显微镜下进行细胞形态学观察,甲苯胺蓝和HE染色鉴定软骨细胞。结果倒置相差显微镜观察发现,采用组织块培养法,未见细胞从组织块爬出;而传统的两次酶消化法可获细胞数为10^5／mL,但使用的胶原酶浓度高,消化时间较长;改良的Ⅱ型胶原酶消化联合胰蛋白酶法,对原代髁突软骨细胞分离取得了优良而稳定的效果,可收获细胞数为10^7／mL。结论改良的Ⅱ型胶原酶消化联合胰蛋白酶法是一种良好的人髁突软骨细胞培养的方法。     

脱钙松质骨复合同种异体软骨细胞修复兔关节骨软骨缺损的实验研究

目的评价脱钙松质骨（DCB）复合同种异体软骨细胞构建组织工程软骨修复兔关节骨软骨缺损的效果。方法分离1月 龄雄性新西兰兔关节软骨细胞,原代培养后复合制备的DCB体外培养2周构建组织工程软骨。4~5月龄新西兰兔30只双侧股 骨内髁制作直径3 mm、深3 mm,穿透软骨下骨板的骨软骨缺损模型,20只右侧关节缺损处植入构建的组织工程软骨（A组）,左 侧缺损处植入DCB（B组）,10只双侧骨软骨缺损未予处理作为空白对照（C组）。分别于术后1、3、6月取修复组织标本,进行大 体形态、组织学及Ⅱ型胶原染色;并对6月修复组织进行组织学评分,比较各组修复效果差异。结果制备的DCB为三维多孔的 海绵结构,孔隙大小约为100~500 μm,相互交通。DCB植入体内后1月开始降解,3月完全吸收。术后6月A组缺损处修复组织 主要为透明样软骨,与周围正常软骨厚度基本一致,修复交界区整合良好,不易辨认。修复组织深层细胞在软骨陷窝内,呈柱状 排列,基质蛋白多糖和Ⅱ型胶原染色接近正常软骨,软骨下骨板完整。B组缺损处以纤维软骨样组织修复为主。C组以纤维组 织填充。组织学评分显示术后6月A组除软骨下骨板重建与B组比较无统计学差异外, 其它各项评分均优于B组和C组,差异 有统计学意义（P<0.05）。结论DCB是一种较好的软骨组织工程支架材料,复合同种异体软骨细胞能修复关节骨软骨缺损,修 复组织为透明样软骨。     

在动态旋转系统中构建小口径组织工程化血管的实验研究

目的探索在动态旋转系统中构建小口径组织工程化血管的可行性。方法将新型可降解材料聚羟基丁酸酯（PHB）做成多孔状PHB＋胶原包埋管形支架。采用酶消化法和组织块法分别培养人脐静脉血管内皮细胞、人脐动脉血管平滑肌细胞和人成纤维细胞的混合细胞悬液接种于胶原包埋的PHB内腔面,采用动态旋转系统下培养3周,行大体观察和扫描电镜观察。结果在动态旋转系统中构建的小口径组织工程化血管,在细胞结构上形成均匀血管组织。结论在动态旋转系统下构建组织工程化血管是可行的,为下一步行混合种植后行组织工程化血管移植试验打下基础。     

乳兔关节软骨细胞的分离、培养及生物学特性的观察

目的：建立乳兔软骨细胞分离及培养的方法,观察软骨细胞在体外培养中的生物学特性.方法：采用两步消化法,将乳兔关节软骨进行分离、培养.采用苏木精伊红染色和甲苯胺蓝染色对软骨细胞进行鉴定,用MTT法绘制生长曲线、并在倒置显微镜观察各代软骨细胞形态、通过免疫组化染色、逆转录聚合酶反应（RT PCR）法观察其生物学特性.结果：通过两步酶消化法,成功分离出乳兔关节软骨细胞,培养24 h后细胞贴壁呈短梭形.培养2周左右软骨细胞聚集似“铺路石”样.MTT法显示细胞生长曲线近似“S”形.甲苯胺蓝呈阳性结果,并随代数增加阳性结果呈减弱趋势.通过免疫组化染色和RT PCR显示随代数增加软骨细胞Ⅰ型胶原表达增强,Ⅱ型胶原表达减弱.结论：本研究采用两步酶消化法,成功从乳兔软骨内获取大量活性好、纯度高的软骨细胞,3代以内软骨细胞生长良好,并保持其生物学特性,适于软骨组织工程的应用.3代以后开始出现去分化现象.     

胶原凝胶包埋软骨细胞接种骨胶原基质支架体外构建组织工程软骨

目的探讨复合应用胶原凝胶和骨胶原基质（BCM）支架作为软骨细胞载体体外构建组织工程软骨的有效性和可行性.方法将胶原凝胶包埋的软骨细胞接种BCM支架并在体外培养,应用倒置相差显微镜和扫描电镜观察软骨细胞的粘附、生长和增殖情况,培养14d,行HE、TB（甲苯胺蓝）染色观察软骨组织形成情况.结果软骨细胞在支架上粘附、生长和增殖良好,体外培养14d能形成较成熟的软骨组织.结论胶原凝胶复合BCM支架可作为软骨细胞的载体体外构建组织工程软骨.     

In vivo chondrogenesis of induced human marrow mesenchymal stem cells in nude mice]

OBJECTIVE: To investigate the feasibility of generating cartilage tissues from human bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) cultured and induced in vitro using tissue engineering technique. METHODS: Human bone marrow MSCs were isolated from the ribs of patients receiving chest surgeries and induced into cartilage cells in serum culture-free medium. The cells were then seeded on perchloroethylene (PCE) as the scaffold material for the formation of cell-PCE composite, which was implanted under the dorsal skin of nude mice. Specimens of the implants were harvested 6 weeks after implantation and subjected to gross morphological observation and histological examination. RESULTS: Gross observation showed subcutaneous lump with considerable tenacity, and histologically, large amount of cartilage cells in clusters were seen to have evolved, in the presence of some scaffold material failing to be degraded, indicating that cartilage formation from the MSCs occurred approximately 6 weeks after the implantation of the induced MSCs. CONCLUSION: Human MSCs can be induced into chondrocytes in vitro, and the MSC-PCE composite possesses the potential to develop into cartilage in nude mice. Human MSCs can therefore be used as the seed cells to construct tissue-engineered cartilage.     

诱导的人骨髓间充质干细胞在裸鼠体内生成软骨的实验研究

目的探讨利用组织工程方法,将人骨髓间充质干细胞(MSCs)在体外诱导、培养后,再造软骨组织的可能性。方法从胸外科手术所获得的肋骨骨髓腔中分离得到人MSCs,经无血清培养基诱导培养为软骨细胞,接种于支架材料上,埋植于裸鼠体内,6周后取材进行大体及组织学观察。结果大体观察见裸鼠皮下形成包块,触之有韧性;组织学观察可见有大量软骨细胞成堆形成,但尚有部分未降解的支架材料残留。结论人MSCs在体外经定向诱导后成为软骨细胞,与支架材料复合物可在裸鼠体内形成软骨组织;人MSCs可能成为组织工程软骨的“种子细胞”。