去抗原异种松质骨与骨髓基质干细胞相容性研究

目的：了解去抗原异种松质骨（AEXCB）对骨髓基质干细胞增殖的影响，为细胞移植载体的选择提供依据。方法：取新生小牛股骨下端松质骨经物理化学处理，制成去抗原异种松质骨载体，与兔骨髓基质干细胞（BMSC）体外复合培养，通过扫描电镜、MTT测试法、考马斯亮蓝和碱性磷酸酶（ALP）活性检测法，观察去抗原异种松质骨材料对细胞生长、增殖及功能表达的影响。结果：骨髓基质干细胞能在AEXCB材料上粘附、增殖，细胞形态良好。去抗原异种松质骨与BMSC作用后ALP活性的吸光收（OD）值，与对照组比较无显差异。结论：去抗原异种松质骨材料无细胞毒性作用，具有良好的细胞相容性。可用作骨组织工程的支架材料。     

去抗原异种松质骨移植的免疫反应研究

料,因存在剧烈的免疫排斥反应,而限制了其在临床的应用。第四军医大学西京医院骨科罗卓荆等采用经植入物体内致敏的淋巴细胞体外二次刺激增殖实验、酶联免疫吸附实验及组织学观察的方法,研究了大块型及颗粒型两种去抗原处理的牛松质骨在植入BALB/c小鼠体内后的细胞、体液免疫及局部组织反应。 结果表明,未经去抗原处理的新鲜牛松质骨在植入早期即可检测到小鼠脾淋巴细胞的增     

去抗原异种松质骨的生物相容性研究

目的：了解去抗原异种松质骨（antigen—extracted xenogeneic cancellousbone,AEXCB）对骨髓基质细胞增殖的影响,为细胞移植载体的选择提供依据。方法：取新生小牛股骨下端松质骨,经物理化学处理,制成去抗原异种松质骨载体,与兔骨髓基质细胞bone marrow stromalcells,BMSC）体外复合培养,通过扫描电镜、MTF测试法、考马斯亮蓝和碱性磷酸酶（ALP）活性检测法,观察去抗原异种松质骨材料对细胞生长、增殖及功能表达的影响。结果：骨髓基质细胞能在AEXCB材料上粘附、增殖,细胞形态良好。去抗原异种松质骨与BMSC作用后ALP活性的吸光度（OD）值,与对照组比较无显著差异。结论：去抗原异种松质骨材料无细胞毒性作用,具有良好的细胞相容性,可用作骨组织工程的支架材料。     

兔骨髓间充质干细胞分离培养及向成骨细胞表型的诱导分化

目的观察兔骨髓间充质干细胞(MSC)体外培养增殖的生长特征及体外诱导条件下的成骨能力情况.方法抽取兔髂骨及胫骨的骨髓液,经密度梯度离心分离出MSC,用塑料培养板贴壁培养进一步纯化MSC,并培养增殖.观察MSC的生长特征,测定其生长曲线及贴壁率.对第2代MSC进行成骨矿化诱导,测定其碱性磷酸酶(ALP)活性及成骨矿化情况.结果MSC为贴壁生长,以均一的梭形的成纤维细胞样生长,增殖能力强.在成骨诱导剂作用下,MSC具有成骨能力,诱导后ALP活性明显提高,并且出现矿化结节.结论获得的兔骨髓MSC生长增殖旺盛,分离培养MSC是可行的,且MSC具成骨分化潜能.     

诱导兔骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞和软骨细胞的研究

目的 探讨兔骨髓间充质干细胞(MSC)体外分离培养、增殖，以及向成骨细胞和软骨细胞定向诱导分化的条件，为骨、软骨缺损的修复和重建提供种子细胞。方法 抽取兔髂骨及胫骨的骨髓液，经密度梯度离心法及塑料板贴壁培养法分离纯化出MSC，并增殖。对第2代MSC进行成骨矿化诱导，测定其碱性磷酸酶(ALP)活性及成骨矿化情况。并对第2代MSC进行软骨特定培养液诱导，对诱导细胞进行甲苯胺蓝染色，测定诱导后的软骨细胞表型。结果 MSC为梭型的成纤维细胞样贴壁生长，增殖能力强。在成骨诱导剂作用下，MSC具有成骨能力，诱导后ALP活性明显提高，并且出现矿化结节沉积。在成软骨诱导剂作用下，可见细胞由成纤维样的梭形变为椭圆形及肾形，并分泌基质，甲苯胺蓝染色呈阳性，表现为软骨细胞分化特点。结论 在特定诱导条件下，兔骨髓MSC体外定向诱导分化为成骨细胞和软骨细胞，为骨和软骨组织工程的修复和重建提供实验依据。     

脱细胞保鲜异种骨移植免疫反应的实验研究

目的　研究脱细胞保鲜异种骨移植的免疫排斥反应。方法　以大鼠为动物模型 ,分别植入脱细胞保鲜牛皮质骨(PBCTB)和松质骨 (PBCCB)、新鲜骨 (FBC)、去抗原牛松质骨 (BCB) ,采用体外二次刺激增殖实验 ,酶联免疫吸附实验及局部组织学观察 ,研究移植后大鼠体内的细胞免疫、体液免疫及宿主对该移植物的局部病理反应。结果　保鲜牛皮质骨、松质骨显著降低了异种骨的抗原性、其中保鲜松质骨尤佳 ,与BCB相比较 ,没有统计学差异。结论　脱细胞处理的保鲜松质骨显著降低了细胞的免疫原性 ,同时可以避免化学毒物的残留 ,是一种理想的植骨材料。     

成骨细胞复合去抗原异种松质骨再造骨组织的实验研究

目的:用胶原修饰去抗原牛松质骨载体表面,与成骨细胞复合进行体内异体移植,观察体内成骨效果,探讨其临床应用价值.方法:新鲜牛松质骨经脱脂、H2O2浸渍及部分脱钙处理,制成去抗原牛松质骨载体(antigen-extracted massive bovine cancellous bone carrier,MBC).载体表面经胶原处理后,与兔骨膜成骨细胞复合后体外共同培养,4 w后将复合材料进行异体桡骨移植,于移植后2 w、4 w、8 w和16 w取材,经HE染色观察.结果:植入2 w时,复合材料表面及孔内有成骨组织细胞黏附生长,材料周围可见大量软骨细胞分化,炎症反应不明显;4 w时有新骨成熟成岛状分布;8 w时有骨板形成;到16 w时,骨缺损就已完全修复,MBC部分降解,但在新骨中仍能见到残留体.结论:MBC载体表面经胶原处理后与成骨细胞的生物相容性更强,该材料复合成骨细胞后移植显示出了良好的骨诱导性和成骨活性及生物可降解性,有一定的临床应用价值.     

同种异体成骨细胞-煅烧骨复合物动物体内植入

目的 观察同种异体煅烧骨－成骨细胞复合物植入动物体内后成骨性能。方法 以牛松质骨制成煅烧骨（TBC）为载体，培养兔骨膜成内细胞（POB）构建复合物，把该复合物移植到BALB／c裸鼠皮下和兔臀部肌袋内，以单纯TBC植入做为对照，28d后取材，制成不脱钙组织切片、HE染色。结果 裸鼠实验组TBC材料内部：成纤维细胞大量增生。细胞排列紧密，形态多样，有的已变为软骨细胞，TBC表面有排列成行的成骨细胞环绕。组织间有散在淋巴细胞浸润。同时可见片状类骨质。兔子实验组TBC材料内部有结缔组织及细小血管长入，孔内充满软骨细胞并可软骨组织钙化、崩裂、成骨现象、有片状骨组织形成；而单纯TBC对照组孔隙内有大量结缔组织及细小血管长入，未见骨组织形成。结论 将TBC－POB材料植入体内后，成骨细胞能存活并产生软骨组织和骨组织。     

兔骨髓基质细胞在去抗原牛松质骨载体上生长状态的观察

目的 牛松质骨具有天然的多孔结构,微孔规则,相互贯通,是骨组织工程载体的选择之一。本研究观察了体外状态下表面不加修饰的去抗原牛松质骨载体的生物相容性,为骨组织工程研究寻找新的载体提供实验依据。方法 将牛四肢骨干骺端松质骨锯成0．6～0．8cm^3的松质骨块,经过反复水洗(40～50℃)、脱脂、超声振荡、离心、脱蛋白过程,清除牛松质骨内的细胞成份、油脂、骨髓组织及残留血液。选择孔隙直径约为300～700μm,孔隙均匀的骨块,风干后再经砂轮仔细打磨精修,制成约0．5cm^3的去抗原牛松质骨骨块。用兔骨髓基质细胞与载体复合,体外培养7、14d行扫描电镜观察了解细胞的生长情况。结果 1．去抗原牛松质骨载体表面干涩不平,洞沟遍布;2．培养第一周的载体壁上,细胞较少,形态不规则,大小不一,散在于孔壁上,细胞分布不均,无突起伸展贴壁,并可见有细胞死亡后崩解的碎片散在于细胞之间。培养第二周载体孔壁上细胞数量更少,提示有细胞死亡并脱落。结论 体外状态下表面不加修饰的去抗原牛松质骨载体不适于MSC贴壁生长。     

冻存骨髓基质细胞体外成骨潜能的实验研究

目的 观察冻存骨髓基质细胞（BMSC）的体外生长特点及诱导与非诱导条件下的成骨能力。方法 取冻存11个月犬BMSC复苏后进行体外扩增培养，传代培养中加入10^-8mol／L地塞米松、50mg／L Vit C和10mmol／L β-甘油磷酸钠进行诱导分化，观察细胞形态、细胞诱导前后增殖情况、细胞碱性磷酸酶（ALP）含量以及形成矿化结节能力的改变。结果 冻存BMSC复苏后呈成纤维样表现，增殖力强。在诱导液的作用下冻存BMSC增殖性能降低，ALP活性增加，诱导5d后可见矿化结节。结论 冻存BMSC增殖能力强，经诱导后表现出明显的成骨活性，可作为骨组织工程的种子细胞。     

鸵鸟羟基磷灰石陶瓷支架负载骨髓基质细胞异位成骨性能

目的:观察鸵鸟羟基磷灰石陶瓷支架负载骨髓基质细胞后植入裸鼠皮下的成骨性能. 方法:获取兔髂骨松质骨骨髓基质细胞,体外分离、扩增、诱导后接种于鸵鸟羟基磷灰石支架. 支架/细胞复合物植入裸鼠背部皮下,支架单纯植入作为对照. 植入后3, 6 wk取材,通过大体、组织学观察评价成骨活性. 结果:支架/细胞复合物植入后3 wk,以软骨为主的大量未成熟骨在材料表面及孔隙内形成;植入后6 wk,更多的成熟骨形成. 在支架材料和骨组织的邻接区域见成骨细胞及破骨细胞,部分区域有血管和多核巨细胞分布,可见软骨内成骨方式. 结论:支架/细胞复合物显示良好的成骨活性,鸵鸟羟基磷灰石陶瓷可以用于骨组织工程支架材料.     

BMSCs胶原刮膜对松质骨缺损的修复

目的 研究成骨蛋白-2(hBMP-2)基因转染骨髓间充质千细胞(BMSCs)胶原刮膜对兔股骨髁松质骨缺损的修复能力。方法 应用影像学、组织学、形态计量学和生物力学等方法,观察未经诱导、OS液诱导和hBMP-2基因转染BMSCs胶原刮膜植入兔股骨髁部直径6 mm、深12 mm松质骨缺损后的修复情况。结果 未经处理的兔股骨髁缺损不能自行愈合;细胞刮膜植入对股骨髁松质骨缺损的修复能力,在8和12周时hBMP基因转染BMSCs组>OS液诱导BMSCs组>未诱导BMSCs组(P<0.05),12周时hBMP基因转染BMSCs组的骨缺损区生物力学强度接近正常松质骨。结论 hBMP基因转染BMSCs胶原刮膜是治疗大块松质骨缺损的理想修复材料。     

去抗原牛松质骨块/bBMP复合材料修复兔长骨骨缺损

探讨大块异种骨的制备及其在修复节段性骨缺损中的作用。方法将大块的牛松质骨制备成消除抗原性的载体,与牛骨形态发性蛋白（ＢＭＰ）组合构成去抗原牛松质骨块／ｂＢＭＰ复合材料,采用兔桡骨１５ｍｍ节段性骨缺损模型,研究去抗原质骨块／ｂＢＭＰ复合材料在修复骨缺损中的作用。     

牛骨形态发生蛋白的提取及异位诱导成骨的研究

本研究从1kg牛长骨中提取出部分纯化的牛骨形态发生蛋白(bBMP)160mg.电泳显示其主要区带分子量在33.7～13.4ku(34.0～13.5kd)之间,包括bBMP的生物活性成份18.1ku(18.2kd)蛋白质。将bBMP植入NIH小鼠肌肉内,5天诱导出软骨细胞,10天形成骨组织,14天出现骨髓。软骨或骨的诱发率87.5%。作者观察到bBMP诱导成骨的方式是软骨内成骨,其过程可分为间质细胞增生期、软骨细胞演变期和骨形成期。     

幼年和成年猪松质骨脱细胞基质有机成分和成骨诱导能力的比较

目的：比较幼年和成年猪松质骨脱细胞基质（DCBM）的成骨特性。方法：制备幼年和成年猪DCBM并验证脱细胞效果。胶原和糖胺聚糖（GAGs）定量检测、Masson三色和阿利新蓝染色评估脱细胞前后胶原和GAGs含量及分布。免疫组化检测松质骨基质中骨形态发生蛋白-2（BMP-2）、基质金属蛋白酶-13（MMP-13）和骨钙蛋白（OCN）的分布情况。qPCR检测幼年和成年DCBM诱导复植间充质干细胞（MSC）的I型胶原（Col-I）、碱性磷酸酶（ALP）、BMP-2和OCN等成骨分化指标的基因表达。纳米液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析DCBM的蛋白组成。结果：定量分析显示,幼年松质骨较成年松质骨在脱细胞前后胶原和GAGs含量更高。幼年松质骨脱细胞前后BMP-2、MMP-13、OCN等的表达均高于成年松质骨。成骨诱导实验显示复植于幼年DCBM的MSC,ALP、Col-I等的mRNA的表达量高于复植于成年DCBM。蛋白质谱GO分析和丰度分析显示幼年DCBM较成年DCBM肽链种类丰富,包含成纤维细胞生长因子、转化生长因子、胰岛素样生长因子等促骨生长细胞因子。结论：同等条件下制备的幼年DCBM与成年猪DCBM比较含有更丰富的促骨生长细胞因子,具有更强的成骨诱导性能。     

重组合异种骨移植同源抗原刺激对脾细胞上清液中IL-2的影响

为探讨重组合异种骨（RBX）移植对机体免疫功能的影响，以RBX、牛BMP、经处理的同源松质骨粒、羟基磷灰石移植建立4组BALB／C小鼠股后肌袋模型．术后2、7、14、28、42天杀鼠取脾细胞．留取上清液．3H-TdR掺入法时体内植骨及体外同源抗原刺激后IL-2生物学活性进行了研究．结果表明：①RBX（BMP）移植后2天IL－2一过性升高；②术后7、14天IL-2水平显著降低；③体外抗原刺激各时间点3H-TdR掺入cpm值明显降低，且与抗原量呈剂量依赖关系．上述结果提示，RBX移植对T淋巴细胞和IL－2诱导CTLL增殖有明显的抑制效应，可能对IL-2也有直接的抑制作用．作者认为，本研究对用RBX移植后既能成骨及不发生明显免疫排异的机理是一种有意义的探讨，为临床使用提供了免疫学上的依据．     

诱导的人骨髓间充质干细胞在裸鼠体内生成软骨的实验研究

目的探讨利用组织工程方法,将人骨髓间充质干细胞(MSCs)在体外诱导、培养后,再造软骨组织的可能性。方法从胸外科手术所获得的肋骨骨髓腔中分离得到人MSCs,经无血清培养基诱导培养为软骨细胞,接种于支架材料上,埋植于裸鼠体内,6周后取材进行大体及组织学观察。结果大体观察见裸鼠皮下形成包块,触之有韧性;组织学观察可见有大量软骨细胞成堆形成,但尚有部分未降解的支架材料残留。结论人MSCs在体外经定向诱导后成为软骨细胞,与支架材料复合物可在裸鼠体内形成软骨组织;人MSCs可能成为组织工程软骨的“种子细胞”。     

人骨形态发生蛋白-2基因腺病毒载体异位成骨

目的：评价人骨形态发生蛋白2(hBMP-2)基因腺病毒表达载体(recombinant adenoviral vector carrying the human BMP-2 gene, AdBMP-2)成骨能力并探讨其成骨机制。方法：应用 AdBMP-2体外感染兔骨髓间质干细胞（BMSC），7 d后观察hBMP-2和碱性磷酸酶(ALP)的表达,21 d后观察感染细胞钙结节形成能力。同时将AdBMP-2行裸鼠腓 肠肌组织内注射，术后20 d取材，观察hBMP-2的表达及肌组织内异位成骨情况。结果：AdBMP-2可高效感 染BMSC并获得hBMP-2的有效表达，ALP表达增高并形成钙结节。AdBMP-2在体内同样表达hBMP-2， 并且以软骨化骨的方式启动成骨。结论：感染AdBMP-2的BMSC向成骨细胞分化，AdBMP-2在体内有着良好的成骨能力。     

补肾活血方对激素性股骨头坏死大鼠BMSCs分化影响的研究

目的 探讨补肾活血方含药血清对激素性股骨头坏死大鼠股骨近端骨髓间充质细胞体外分化的影响.方法 建立激素性股骨头坏死大鼠模型后,提取股骨近端骨髓单个核细胞,随机分为4组培养,空白血清对照组(A组)、补肾活血方含药血清低(B组)、中(C组)、高(D组)浓度组,分别加入重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)诱导下的骨髓间充质细胞的培养体系,观察各组的细胞形态学、细胞内ALP含量及TGF-β基因表达.结果 补肾活血方含药血清能增强rhBMP-2的活性,促进股骨近端骨髓体外成骨细胞的分化增殖(P＜0.01),促进分化中的骨髓间充质细胞表达TGF-β1 mRNA(P＜0.01).结论 补肾活血方通过增强rhBMP-2活性及TGF-β1 mRNA的表达在骨坏死的修复中起关键作用.