一氧化氮对香烟烟雾提取物诱导大鼠肺泡巨噬细胞核因子кB活化的影响

目的:探讨一氧化氮(NO)对香烟烟雾提取物(CSE)诱导的大鼠肺泡巨噬细胞(AM)中核因子κB(NF—κB)活化的影响及机 制。方法:将大鼠AM与不同浓度的NO前体左旋精氨酸(L-Arg)或iNOS特异性抑制剂N6-(1-亚氨乙基)赖氨酸(L-NIL)及CSE共同培养,用免疫细胞化学染色法检测NF-κB,用Western blot检测I-κB蛋白含量,用Griess法测定培养上清液中NO的水平。结果:CSE可使NF-κB活化细胞的百分率增加,I-κB的水平下降。加入CSE和低浓度L-Arg培养的AM,NF-κB活化细胞的百分率显著高于只加入CSE的AM;而I-κB的水平显著低于只加入CSE的AM。加入CSE和高浓度L-Arg培养的AM,NF-κB活化细胞的百分率显著低于只加入CSE的AM,而I-κB的水平无显著变化。加入CSE和不同浓度的L-NIL培养的AM,NF-κB活化细胞的百分率显著低于只加入CSE的AM;而I-κB的水平则显著高于只加入CSE的AM,并呈浓度依赖(P<0.01)。结论:内源性NO对香烟烟雾所致NF-κB的活化具有双向调控作用。     

香烟烟雾提取物通过蛋白激酶C-核因子相关因子2调节大鼠气道上皮细胞血红素加氧酶1表达

 目的：探讨蛋白激酶C（PKC）-红系衍生的核因子相关因子2 (Nrf2)对香烟烟雾提取物（CSE）诱导的大鼠气道上皮细胞血红素加氧酶1（HO-1）表达的影响。方法：通过CSE刺激雄性SD大鼠气道上皮细胞,使用PKC抑制剂RO318220和Nrf2 siRNA,将细胞分为对照组、CSE 3 h组、RO318220组、Nrf2 siRNA组和RO318220+Nrf2 siRNA组,用Western blotting法分别检测HO-1、Nrf2和p-PKC蛋白表达,免疫细胞化学法观察HO-1蛋白表达,逆转录－聚合酶链反应（RT-PCR）法检测HO-1 mRNA表达,免疫荧光法检测Nrf2蛋白定位,测定HO-1活性。结果：暴露CSE 3 h后,Nrf2蛋白主要表达在胞核, 胞核蛋白表达增强,p-PKC蛋白、HO-1的mRNA和蛋白高表达,HO-1活性增强。预先给予RO318220,PKC蛋白、Nrf2胞浆和胞核蛋白、HO-1的mRNA和蛋白表达均明显减弱,HO-1活性显著降低。预先用siRNA沉默Nrf2,胞浆和胞核的 Nrf2蛋白表达均减弱,HO-1活性、mRNA和蛋白水平明显降低。RO318220联合Nrf2 siRNA处理后,PKC蛋白、Nrf2胞浆和胞核蛋白、HO-1 mRNA和蛋白表达均明显降低,HO-1活性明显降低。结论：CSE通过PKC激活Nrf2,诱导Nrf2核转位,从而上调HO-1的表达水平。     

香烟烟雾提取物对人外周血单个核细胞IL-8 mRNA表达的影响

目的 探讨香烟烟雾提取物(CSE)对人外周血单个核细胞(PBMC)IL-8 mRNA表达的影响及其细胞内信号途径。方法 体外应用CSE与健康者PBMC共同培养，用RT-PCR检测IL-8 mRNA的表达，用免疫细胞化学染色法检测核因子κB(NF-κB)的表达；并观察NF-κB抑制剂和酪氨酸蛋白激酶抑制剂对CSE诱导的：PBMC IL-8基因表达的影响。结果 加入CSE培养的人PBMC，IL-8 mRNA的表达增加，作用24h最高，NF-κB活化细胞百分比增加；NF-κB抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂均使CSE诱导的IL-8 mRNA表达水平下降。结论 吸烟使人PBMC的IL-8 mRNA表达水平显著增加，与NF-κB和酪氨酸激酶有关。     

香烟烟雾提取物经aPKC√ζ-NRF2上调大鼠气道上皮细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶表达

目的 观察香烟烟雾提取物（CSE）是否通过不典型蛋白激酶Cι/ζ (aPKCι/ζ) -红系衍生的核因子相关因子2（NRF2）信号通路调控大鼠气道上皮细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）。方法 用Western blot法检测γ-GCS、NRF2和p-aPKCι/ζ蛋白,免疫细胞化学法观察γ-GCS蛋白表达,反转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测γ-GCS mRNA,免疫荧光法检测NRF2蛋白。结果 NRF2蛋白在CSE 3h组主要表达在胞核,其胞核蛋白高表达。p-aPKCι/ζ蛋白在CSE 3h组显著高于对照组（P＜0.05）。γ-GCS蛋白及其mRNA在CSE 3h组较对照组显著增强（P＜0.05）。预先加入aPKCι/ζ抑制剂RO813220,NRF2胞质蛋白表达增强,p-aPKCι/ζ蛋白、γ-GCS蛋白及其mRNA均明显低于CSE 3h组（均P <0.05）。相关性分析显示NRF2与γ-GCS、p-aPKCι/ζ呈正相关,p-aPKCι/ζ与NRF2、γ-GCS呈正相关（P＜0.05）。结论 CSE可能通过aPKCι/ζ-NRF2调节γ-GCS表达。     

香烟烟雾提取物下调小鼠C2C12成肌细胞组蛋白去乙酰化酶2表达并增强炎性细胞因子释放

目的观察香烟烟雾暴露后,小鼠C2C12成肌细胞内炎症介质、组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)和核因子κB(NF-κB)的变化。方法培养小鼠C2C12成肌细胞,用香烟烟雾提取物(CSE)进行处理。采用MTT法观察CSE对细胞生长的影响,以确定作用于细胞的合适浓度。将培养6~7 d的C2C12细胞接种到6孔板,分为对照组和(6.25、12.50、25.0)mL/L CSE组,培养24h。ELISA测定各组细胞上清液白细胞介素8(IL-8)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量;实时定量PCR(qRT-PCR)检测各组细胞HDAC2 mRNA的表达;Western blot法检测各组细胞中HDAC2的蛋白相对表达量;免疫共沉淀技术检测细胞内HDAC2/NF-κB复合物。结果 MTT结果提示终浓度为50 mL/L的CSE抑制C2C12细胞的生长;CSE刺激24h后,C2C12细胞IL-8和TNF-α释放增加,HDAC2的mRNA及蛋白相对表达量减少,并在一定程度上具有浓度依赖性;免疫共沉淀技术证实存在HDAC2/NF-κB复合物。结论 CSE下调C2C12细胞HDAC2表达,引起炎症因子释放增加。     

辛伐他汀对香烟烟雾提取物诱导的人脐静脉内皮细胞表达sEPCR和mEPCR的影响

目的: 研究辛伐他汀对香烟烟雾提取物(CSE)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs) 表达可溶性内皮细胞蛋白C受体(sEPCR)和膜联内皮细胞蛋白C受体(mEPCR)的干预作用。方法: 体外培养的4~6代HUVECs 随机分为对照组、5%CSE组、不同浓度辛伐他汀组及辛伐他汀干预组,辛伐他汀组分别加入50、100、200 μmol/L辛伐他汀液孵育24 h,辛伐他汀干预组先以50、100、200 μmol/L辛伐他汀预处理细胞2 h,再与5%CSE孵育24 h。收集各组细胞及上清液,ELISA法检测上清液中sEPCR蛋白含量,实时定量PCR法检测各组细胞中mEPCR mRNA的表达。结果: (1)5%CSE组sEPCR蛋白含量高于对照组,mEPCR mRNA表达低于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05);(2)100 μmol/L与200 μmol/L辛伐他汀组sEPCR蛋白含量均高于对照组,低于5%CSE组,其mEPCR mRNA表达均低于对照组,高于5%CSE组,差异均有统计学意义(均P<0.05);(3)各辛伐他汀干预组sEPCR蛋白含量均低于5%CSE组,但高于对照组及相应浓度的辛伐他汀组;相反,各辛伐他汀干预组mEPCR mRNA表达均高于5%CSE组,低于对照组及相应浓度的辛伐他汀组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论: 在体外,辛伐他汀通过上调HUVECs mEPCR mRNA的表达,降低sEPCR的分泌,对CSE介导的内皮细胞凝血功能障碍可能具有一定的改善作用。     

上调miR-181a抑制香烟提取物诱导的支气管上皮细胞致炎因子生成与collagen IV、fibronectin和α-SMA表达

目的:探讨微小RNA-181a(miR-181a)对香烟提取物(cigarette smoke extract,CSE)诱导的人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial cells, HBECs)致炎因子生成与IV型胶原蛋白(collagen IV)、纤连蛋白(fibronectin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的影响,并分析其可能的机制。方法:RT-qPCR检测CSE诱导下HBECs中miR-181a的表达情况。转染miR-181a mimic后经ELISA检测肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6和转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的水平;Western blot检测collagen IV、fibronectin和α-SMA的表达;并进一步评估NF-κB/TGF-β1/Smad3信号通路的活性。结果:CSE可显著增加HBECs中致炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β1的生成,显著上调collagen IV、fibronectin和α-SMA的表达,同时细胞内miR-181a的表达明显降低(P0.05);转染miR-181a mimic可显著抑制CSE诱导的HBECs致炎因子生成及collagen IV、fibronectin和α-SMA表达(P0.05)。此外,Western blot的结果显示转染miR-181a mimic可抑制CSE诱导的NF-κB/TGF-β1/Smad3信号活性(P0.05)。结论:上调miR-181a表达可部分逆转CSE诱导的HBECs致炎因子的释放及collagen IV、fibronectin和α-SMA表达,其作用机制可能与抑制NF-κB/TGF-β1/Smad3信号通路的活化有关。     

自噬参与香烟烟雾提取物诱导的肺动脉内皮细胞凋亡

目的:探讨自噬在香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract,CSE)诱导人肺动脉内皮细胞(human pulmonary artery endothelial cells,HPAECs)凋亡中的作用。方法:常规培养HPAECs,分为对照组、CSE组、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)组和3-MA+CSE组,应用Hoechst 33342染色和Annexin V/PI流式细胞术检测细胞凋亡,单丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine,MDC)染色观察细胞自噬泡形成,Western bolt测定自噬相关蛋白beclin-1、LC3与cleaved caspase-3的水平。结果:MDC染色示CSE处理可以诱导细胞产生自噬泡,Western blot结果示自噬相关蛋白LC3及beclin-1表达升高,3-MA预处理后抑制上述蛋白的表达。Hoechst 33342染色和Annexin V/PI流式结果显示CSE组细胞凋亡率较对照组明显增加,在3-MA+CSE组,细胞凋亡率较CSE组进一步升高;同时,CSE组细胞cleaved caspase-3蛋白水平较对照组明显升高(P0.05),3-MA+CSE组的caspase-3表达较CSE组进一步升高。结论:CSE能诱导HPAECs发生自噬和凋亡,抑制自噬能够进一步促进CSE对HPAECs的凋亡作用,这种作用可通过激活caspase-3实现。     

基于Nrf2/ARE信号通路探讨辛伐他汀减轻脂多糖诱导的大鼠急性肺损伤的作用

目的:探讨辛伐他汀对脂多糖(LPS)诱导的大鼠急性肺损伤(ALI)的保护作用及其对核因子E2相关因子2(Nrf2)/抗氧化反应元件(ARE)信号通路的调控机制.方法:SD大鼠随机分为4组:正常组、模型组、实验组、阳性对照药地塞米松干预组(DXMS),每组10只,实验组、DXMS组分别腹腔注射1 ml辛伐他汀溶液(5 m...     

香烟烟雾提取物对气道上皮细胞粘附迁移的影响及其机制研究

目的： 研究香烟烟雾提取物（CSE）对气道上皮细胞粘附迁移的影响及其作用机制。方法：利用不同浓度的CSE刺激气道上皮细胞观察其粘附迁移情况，以RT-PCR和Western blotting分别检测CSE对气道上皮细胞FIP200（FAK-family interacting protein of 200 kD） mRNA和FIP200蛋白表达水平的影响。结果：CSE干预的气道上皮细胞粘附率和迁移速度均明显降低，FIP200 mRNA和蛋白表达水平显著增高，而且这些变化均随CSE浓度的增大而增大；气道上皮细胞FIP200 mRNA和蛋白表达水平的增高与气道上皮细胞粘附迁移的降低呈显著正相关。结论：CSE显著抑制气道上皮细胞的粘附和迁移，FIP200的高表达及FIP200对FAK的抑制可能是其作用机制之一。     

香烟提取物对支气管哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖的影响

目的： 探讨香烟提取物（CSE）对支气管哮喘(简称哮喘)大鼠气道平滑肌细胞（ASMCs）增殖作用及可能机制。方法: 16只SD大鼠随机分为对照组和哮喘组,各8只。原代培养大鼠ASMCs,取第3-6代细胞,分为对照组、对照+CSE组、哮喘组、哮喘+CSE组、哮喘+CSE+嘧啶基-苯磺酰胺（GW8510,细胞周期蛋白依赖激酶-4抑制剂）组、哮喘+GW8510组。用流式细胞术、四甲基偶氮唑盐（MTT）法及增殖细胞核抗原（PCNA）免疫细胞化学技术检测ASMCs增殖;用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白质印迹（Western blotting）检测细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的表达。结果: （1）哮喘组ASMCs与对照组ASMCs相比,在S+G2/M期比例、吸光度（A）值和PCNA表达率上明显增高,差异显著（P＜0.01）。（2）哮喘组ASMCs S+G2/M期比例、吸光度（A）值和PCNA表达率分别为(18.30±1.12)%、0.512±0.110、(55.1±3.7)%;哮喘+CSE组分别为（32.12±1.17）%、0.801±0.210、（90.2±7.3）%;哮喘+CSE+GW8510组分别为(17.21±0.95)%、0.508±0.009、(54.3±4.8)%;哮喘+GW8510组分别为(11.16±1.48)%、0.345±0.078、(40.6±5.4)%。除哮喘组、哮喘+CSE+GW8510组两组比较差异无显著外,其余两两比较差异均显著（P＜0.01）。（3）哮喘组、哮喘+CSE组、哮喘+CSE+GW8510组、哮喘+GW8510组ASMCs cyclin D1 mRNA A值比值和蛋白表达A值比值分别为0.236±0.045、0.271±0.002;0.369±0.124、0.379±0.002;0.231±0.075、0.261±0.002;0.165±0.064、0.193±0.002。除哮喘组、哮喘+CSE+GW8510组两组比较差异无显著外,其余两两比较差异均显著（P＜0.01）。结论: 正常与哮喘大鼠ASMCs在CSE干预后增殖明显加快,cyclin D1表达明显增加。CSE可能是通过cyclin D1参与调控哮喘大鼠ASMCs的增殖。     

烟曲霉菌提取物对人支气管上皮细胞Muc5ac表达的影响

目的： 探讨烟曲霉菌对呼吸道上皮细胞的黏液蛋白Muc5ac表达的影响及其可能机制。方法: 分别应用不同浓度(0、8、16、20 mg/L) 的烟曲霉菌提取物（AFE）作用体外培养人支气管上皮细胞16HBE-14o不同的时间。实验还应用热处理的AFE（HT-AFE）、丝氨酸蛋白酶抑制剂（抑肽酶）和蛋白激酶激活受体-2（PAR-2）阻断剂（FSLLRY-NH2）。应用细胞免疫组织化学和酶联免疫法(ELISA)检测细胞Muc5ac蛋白量,同时应用RT-PCR检测Muc5ac mRNA 的表达。结果: 正常未给予AFE刺激培养条件下的对照组细胞仅表达少量Muc5ac,而给予不同浓度的AFE作用后,细胞合成和分泌Muc5ac的量明显高于对照组（P＜0.01）,并呈明显的时间和浓度依赖性。丝氨酸蛋白酶抑制剂和PAR-2特异性阻断剂可以明显抑制AFE的上述作用。另外,热处理的AFE蛋白酶活性完全灭活,不能促进细胞Muc5ac表达增加。结论: AFE依赖其蛋白酶活性激活受体PAR-2,促进呼吸道上皮细胞Muc5ac表达增加,使黏液分泌增加。     

香烟提取物通过减少HDAC2表达诱导小鼠C2C12成肌细胞衰老

目的:探讨香烟提取物(CSE)能否引起小鼠C2C12成肌细胞衰老,并研究成肌细胞衰老与组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)的关系。方法:培养C2C12细胞株,分化为成熟成肌细胞,观察CSE干预对成肌细胞衰老和HDAC2表达的影响,采用real-time PCR和Western blot方法分别检测HDAC2 mRNA和蛋白的表达;β-半乳糖苷酶染色检测衰老细胞的百分率。结果:MTT法测定最佳CSE浓度与干预时间分别为60 m L/L和24 h。CSE干预后β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数增加,同时伴有HDAC2 mRNA和蛋白表达的减少。四溴苯三唑(TBB)在促进HDAC2 mRNA和蛋白表达的同时,β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数减少;用HDAC2的特异性阻滞剂丙戊酸抑制HDAC2 mRNA和蛋白的表达时,β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数增加。结论:香烟提取物可通过减少小鼠C2C12成肌细胞HDAC2的表达促进细胞老化。     

香烟提取物和脂多糖对人胚肺成纤维细胞TGF-β1 mRNA及蛋白表达的影响

目的:探讨香烟提取物(CSE)和脂多糖(LPS)对体外培养的人胚肺成纤维细胞(HELF)转化生长因子-β₁(TGF-β₁)mRNA及其蛋白表达的影响。方法:应用不同浓度的CSE(1∶50、1∶25和1∶10)、LPS(0.1 mg/L、1 mg/L和10 mg/L)及CSE(1∶25)与LPS(1 mg/L)联合作用于HELF, 37℃作用24 h后, 提取细胞总RNA, 应用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)及免疫细胞化学技术检测TGF-β₁ mRNA和蛋白表达的变化。结果:CSE低浓度(1∶50和1∶25)时可增加HELF TGF-β₁ mRNA及蛋白的表达(Ｐ＜0.05), 高浓度(1∶10)时未引起TGF-β₁ mRNA及蛋白表达增强(Ｐ＞0.05)。不同浓度的LPS均引起HELF TGF-β₁ mRNA及蛋白表达增强(Ｐ＜0.05)。CSE与LPS联合作用也可增加HELF TGF-β₁ mRNA及蛋白的表达(Ｐ＜0.05)。结论：一定浓度的CSE和LPS可上调肺成纤维细胞TGF-β₁ mRNA及蛋白表达。