鹿源类中药材DNA序列分析及马鹿和梅花鹿的PCR鉴定

目的采用特异引物PCR扩增鉴定马鹿和梅花鹿源中药材。方法从马鹿、梅花鹿等国内11种鹿的鹿血和鹿茸中提取DNA,用通用引物L1091和H1478调取细胞线粒体12SrRNA基因片段,在该片段核苷酸序列比对的基础上,设计马鹿和梅花鹿高特异性PCR鉴定引物对,并进行PCR特异性鉴定。结果12SrRNA基因片段能较好地在种的水平上将不同的种区分开来;特异引物对(EP-1/H1478和EP-2/H1478)PCR可准确地鉴定出马鹿和梅花鹿等。结论特异引物PCR适宜马鹿、梅花鹿等珍贵中药材的鉴定。     

鹿茸、鹿角的位点特异性PCR鉴别

目的:建立一种快速、高效、简便的鹿茸、鹿角位点特异性聚合酶链式反应(PCR)鉴别方法。方法:通过比较梅花鹿、马鹿及其混伪品的COI,Cytb基因序列差异,根据Cytb片段上的3个SNP (single nucleotide polymorphism)变异位点设计出一对鹿茸的特异性鉴别引物LR-238上游和LR-238下游,并对影响PCR结果的主要因素退火温度,PCR循环次数,模板DNA浓度,Taq酶用量和及影响重复性的Taq酶种类和PCR仪型号等进行方法学考察和优化。结果:进行方法学考察确定最优鉴别条件的基础上,当PCR退火温度为56℃,循环次数为35次的条件下,鹿茸、鹿角正品均能扩增出约250 bp片段,其他9种混伪品麋鹿、白唇鹿、水鹿、坡鹿、黇鹿、骡鹿、驯鹿、驼鹿、狍及阴性对照无条带。不同来源的药用的马鹿亚种东北马鹿、塔河马鹿、天山马鹿、阿拉善马鹿、阿勒泰马鹿、新西兰马鹿,梅花鹿亚种东北梅花鹿、华南梅花鹿样品使用建立的位点特异性PCR鉴别方法均产生约250 bp特异性鉴别条带。结论:该文设计的鉴别引物具有高度的专属性,所建立的位点特异性PCR鉴别方法可用于鹿茸、鹿角的准确鉴别。     

虻虫的PCR-RFLP鉴别研究

目的:建立简单、准确的虻虫DNA分子标记鉴别方法。方法:扩增并分析虻虫及7种常见伪品的细胞色素C氧化酶I亚基基因(CO I)序列,根据差异片段设计聚合酶链反应-限制性内切酶酶切长度多态性(PCR-RFLP)引物,使用限制性内切酶进行酶切鉴别。结果:引物对Meng Chong-Dig.F/Meng Chong-Dig.R可扩增虻虫及其伪品CO I序列,产生约490 bp条带,限制性内切酶Dra I可以识别虻虫及其伪品的差异序列,仅虻虫的CO I片段可被酶切形成两个片段,从而特异性鉴别是否为虻虫。结论:本实验建立的PCR-RFLP可以作为虻虫的DNA鉴定方法。     

基于COI与SRY序列建立梅花鹿、马鹿及其杂交鹿茸的分子鉴别方法

为了建立梅花鹿、马鹿及其杂交鹿茸的特异性PCR鉴别方法。采集不同来源的梅花鹿、马鹿鹿及其杂交鹿的鹿角或鹿茸样品共48份,其中24份为市场流通的待测样品。分别利用COI与SRY基因序列作为其父母本的鉴别标记,对已知样品的COI与SRY基因进行扩增、测序,进行同源比对后根据其变异位点设计特异鉴别引物,分别基于COI与SRY基因建立对梅花鹿、马鹿及其杂交鹿的鹿茸的特异PCR鉴定方法,并随机对市场流通的24份待测鹿茸样品进行鉴别分析。该实验所构建双位点特异PCR体系,基于COI的鉴别位点,可通过PCR扩增获得232 bp的梅花鹿特异片段,而产生518 bp的马鹿特异片段;而基于SRY的鉴别位点,通过PCR扩增获得803 bp的梅花鹿特异片段,而产生425 bp的马鹿特异片段。随机抽取市场流通中的24个待测鹿茸样品,经鉴定有3个样品属于马·花杂交的鹿茸样品。该实验建立对梅花鹿、马鹿及其杂交鹿的鹿茸的PCR鉴别方法简便、可靠。     

塔里木马鹿特异性PCR及PCR-RFLP鉴定

目的:建立能够快速、准确地进行塔里木马鹿的基因鉴定方法。方法:采用通用引物对L1091/H1478调出3种不同马鹿的线粒体12S rRNA片段进行比对分析,根据差异片段设计能够鉴别出塔里木马鹿的特异性引物对进行PCR鉴别,并寻找出一个能够识别差异片段的限制性内切酶进行酶切鉴别。结果:使用设计的特异性引物对CEYS/CEYA进行PCR,只有塔里木马鹿的基因组DNA可以获得扩增条带,可以很好的鉴别出塔里木马鹿;限制性内切酶PshBⅠ可以识别塔里木马鹿与其它马鹿的差异序列,只有塔里木马鹿的12S rRNA片段可以被切成2个小片段,可以鉴别是否为塔里木马鹿。结论:本实验建立的特异性PCR及PCR-RFLP可以作为塔里木马鹿的基因鉴定方法。     

基于细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ序列位点特异性聚合酶链反应鉴别鹿茸及其伪品

目的:基于细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)序列建立一种新的PCR鉴定方法,以快速鉴别出梅花鹿、马鹿茸片与驯鹿茸片。方法:采集不同来源的鹿茸片共60批。通过比较梅花鹿、马鹿与驯鹿等其他伪品的COⅠ基因序列差异,根据SNP鉴别位点设计梅花鹿茸、马鹿茸同驯鹿茸的鉴别引物Cne-F、Rt-F、Co-R,并对影响聚合酶链反应(PCR)结果的主要因素变性时间、退火温度、退火时间、延伸时间等进行方法学考察和优化。结果:该实验构建的双位点特异PCR鉴别体系,基于COⅠ的鉴别位点,可通过PCR扩增获得294 bp的梅花鹿、马鹿特异片段,而产生514 bp的驯鹿特异片段,伪品及阴性对照无条带。结论:该实验建立对梅花鹿、马鹿及驯鹿等其他伪品鹿茸的PCR鉴别方法简便、可靠。     

天南星、半夏的PCR-RFLP鉴别

目的：近年来,随着半夏和天南星的野生资源急剧下降、药材栽培技术不成熟等问题出现,市场的混伪品频繁出现,而其主要鉴别特征在药材流通中大多消失。因此,迫切需要建立一种可以快速、有效鉴别天南星和半夏特异性的分子鉴定方法。方法：通过比对天南星、半夏及其混伪品的rbc L序列,分别选择了天南星和半夏的特异性酶切位点HaeⅢ和DraⅠ,采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）进行鉴定,建立并优化了PCR-RFLP反应主要体系条件,并对其耐用性和正品、掺杂品及混伪品的检出能力进行了考察。结果：建立了天南星和半夏药材的PCR-RFLP鉴别方法,在退火温度为54℃、循环次数为35个,DNA模板量为3～30 ng时,天南星和半夏经过特异性引物扩增后,分别能被HaeⅢ和DraⅠ限制性内切酶酶切,产生两片段或切开的小片段,并在100～250 bp出现单一条带,而混伪品无法酶切,且均在250 bp出现条带,该方法对天南星或半夏的掺杂品和混伪品具有高度准确的鉴别能力。结论：该研究建立的PCR-RFLP方法可以快速鉴别天南星、半夏。     

位点特异性PCR方法的建立及对近源种鹿茸药材的鉴别研究

目的:针对正品鹿茸与近源种鹿茸药材饮片鉴别的难点,建立一种简便、快速、准确的近源种鹿茸药材分子鉴别方法.方法:根据鹿科鹿属种动物cytb全序列比对分析,设计1对能准确鉴别正品鹿茸(包括梅花鹿和马鹿)和其他近源种鹿茸的引物,在此基础上建立鹿茸药材位点特异性PCR鉴别方法,并对影响PCR结果的主要因素退火温度、Taq用量、循环次数以及模板用量和重复性等进行方法学考察和优化.结果:在方法学考察的基础上,在μL PCR反应体系,退火温度为65℃的条件下,能准确扩增出约323 bp大小的阳性DNA条带,经测序验证结果表明,系正品鹿茸原动物的Cytb基因序列片段,而伪品鹿茸未扩增出条带.结论:所建立的位点特异性PCR方法,能将正品鹿茸与其他近源种鹿茸药材鉴别开来,具有较高的特异性、重复性,可广泛应用于鹿类药材的鉴别.     

鹿茸饮片的DNA条形码鉴别研究

 目的 建立一种快速、准确和标准化的鹿茸饮片DNA条形码鉴别方法,并分析鹿茸药材原动物间的亲缘关系。方法 通过下载GenBank鹿类动物线粒体细胞色素C氧化酶亚基 I(COI基因,经比对分析,在靠近COI 基因5′端设计了一对鹿科动物DNA条形码通用引物,对来源于鹿科动物3个属共计19份样本的鹿茸进行了PCR扩增和序列分析,并构建系统进化树。结果 通过遗传距离和分子系统树分析显示DNA条形码鉴别方法能够在属水平和种水平将鹿科3属9种鹿成功的鉴别开来,对90%的鹿茸样本可进行有效地鉴定,而梅花鹿、马鹿中各一个样本未得到准确鉴定,具体原因有待进一步研究。结论 所建立的鹿茸药材DNA条形码鉴别方法,准确可靠,可用于正品鹿茸马鹿和梅花鹿及其混伪品进行准确鉴定。     

聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法对太白贝母鉴别检验的适用性探讨

目的：探讨聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法（PCR-RFLP）对于太白贝母的适用性。方法：采集太白贝母野生及栽培品,收集市场上太白贝母伪品,利用性状、PCR-RFLP鉴别法、DNA序列分析三种方法分析太白贝母与常见伪品的区别。结果：从性状上看,太白贝母栽培品与伪品往往非常相似,较难辨别;通过PCR-RFLP方法可以正确、客观的鉴别太白贝母与常见伪品,基于ITS2 的DNA条形码方法进一步验证了PCR-RFLP法的准确性。市场上太白贝母的伪品多为伊犁贝母。结论：PCR-RFLP鉴别法可准确鉴别太白贝母与其伪品;市场上太白贝母伪品较多,应加强监管。     

鹿鞭的微量DNA提取及序列鉴定

采用微量DNA提取技术,从梅花鹿血、毛、鹿鞭、鹿茸、牛鞭、驴鞭中提取DNA,以线粒体DNA细胞色素b通用引物L14841和H15149扩增约307bpDNA片段,扩增产物纯化后采用双脱氧链终止法测定其序列。结果证明:梅花鹿毛、血和鹿鞭的DNA序列完全一致;而所谓的“鹿茸”则与其有较大的差异。用所测序列以简约法PAUP3.1.1程序构建的分子系统树与传统分类系统相吻合。说明此方法鉴定鹿鞭是科学而准确的。     

基于叶绿体DNA条形码的披麻草药材及其混伪品的分子鉴定

目的：分析trnV-atpE、psaC-ndhE序列变异特点,并通过该序列鉴别披麻草不同基原植物与其混伪品。方法：分别提取披麻草3种基原植物及其混伪品的总DNA,以trnV-atpE、psaC-ndhE为DNA条形码候选序列进行聚合酶链式反应（PCR）扩增和测序。采用DnaSP、MEGA软件统计其片段长度、鸟嘌呤（G）+胞嘧啶（C）占比、变异位点个数、简约信息位点、插入或缺失位点,并计算样品K2-P (Kimura 2-parameter)遗传距离和构建邻接法（NJ）系统发育树。结果：trnV-atpE、psaC-ndhE序列长度分别为373～381、491～534 bp,简约信息位点分别为18、15个。trnV-atpE和psaC-ndhE序列中披麻草3种基原植物最大遗传距离均小于与混伪品之间的最小遗传距离。基于2个序列构建的NJ系统发育树显示,披麻草与其混伪品能明显区分。结论：综合分析序列特点和种内、种间变异性,trnV-atpE和psaC-ndhE序列均可将披麻草3种基原植物与其混伪品区分开。     

梅花鹿茸和马鹿茸多肽化学性质及生物活性比较

目的 :比较梅花鹿茸多肽和马鹿茸多肽化学组成及生物活性异同。方法 :用相同工艺提取梅花鹿茸和马鹿茸多肽组分 ;采用电泳和质谱等分离分析手段比较多肽组分的化学性质 ;用 [³H]TdR参入细胞DNA比较两种鹿茸多肽的促细胞增殖活性。结果 :梅花鹿茸和马鹿茸多肽组分的电泳图谱和质谱有明显差异 ,而中国的东北马鹿茸和新西兰马鹿茸多肽的图谱十分相近 ;梅花鹿茸和马鹿茸多肽对软骨细胞和表皮细胞分裂都有促进作用 ,但马鹿茸多肽对表皮细胞的增殖作用比梅花鹿茸多肽强。结论 :梅花鹿茸和马鹿茸多肽的化学性质和生物活性有较大差异。     

红花天冬氨酸激酶基因片段的分离及表达分析

目的克隆红花种子中的天冬氨酸激酶(aspartokinase,AK)基因并研究其在种子不同发育时期的表达量。方法根据红花转录组文库注释信息筛选与红花天冬氨酸激酶(Ct AK)基因相关的Unigenes,设计引物,以红花种子总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增Ct AK基因片段并连接到克隆载体上,经PCR及酶切鉴定,筛选阳性克隆进行测序。同时利用荧光定量PCR技术对其进行基因表达量的分析。结果克隆了红花Ct AK基因的核心片段,分离到486 bp的基因序列。根据Ct AK基因片段设计引物,对不同品种不同发育时期红花种子进行荧光定量PCR分析,Ct AK基因在红花品种川红1号初花后13 d表达量最高。结论系统发育树分析表明,该基因与其他物种的AK基因具有较高的同源性。     

应用PCR-RFLP方法鉴定梅花鹿茸与马鹿茸

目的 建立一种应用限制性片段长度多态性技术鉴别梅花鹿茸与马鹿茸的方法。方法 提取各种鹿茸样品的基因组DNA,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)对正品鹿茸的特异性片段进行扩增,鉴别鹿茸的真伪,然后对正品鹿茸利用动物通用引物进行PCR扩增,并通过限制性片段长度多态性分析进一步对正品鹿茸的种属来源进行确证。结果 通过对特异性片段的PCR扩增,可将梅花鹿茸及马鹿茸与驯鹿、麋鹿、新西兰鹿等伪品鹿茸加以区分,通过对限制性内切酶Msp I 进行酶切后的片段长度进行分析,可进一步区分梅花鹿茸与马鹿茸。结论 本实验建立了一种基于限制性片段长度多态性技术快速、准确的鉴别鹿茸真伪及种属鉴定的方法,为解决中药易混品种难以鉴定的问题提供了又一个新方法。     

少棘蜈蚣的DNA指纹图谱鉴别研究

目的：建立基于2个引物组合的DNA指纹图谱技术,鉴别少棘蜈蚣药材及其混伪品。方法：收集蜈蚣属少棘蜈蚣及11个易混淆种共39批样品,使用通用鉴别引物12S-L1091/12S-H1478和16S-L3428/16S-H3667扩增并进行短串联重复序列（STR）分型,获得DNA指纹图谱。结果：少棘蜈蚣12S迁移峰为420.1 bp或424.7～426.8 bp,16S迁移峰为175.5～175.6 bp,均不同于其他物种。结论：基于荧光STR分型原理建立了一种简单快捷、可用于蜈蚣药材及其混伪样品的通用DNA指纹图谱鉴别,能够完成对少棘蜈蚣药材的鉴定,并且通过2个引物结合能够鉴别蜈蚣属其他物种。     

基于多基因组片段构建枸杞属药用植物DNA条形码

目的采用核基因组核糖体DNA ITS区、叶绿体基因组9个DNA片段和线粒体基因组2个DNA片段构建国产枸杞属药用植物DNA条形码。方法采集枸杞属黑果枸杞Lycium ruthenicum、黄果枸杞L.barbarum var.auranticarpum、宁夏枸杞L.barbarum、枸杞L.chinense和新疆枸杞L.dasystemum 5个分类群标本及实验样品,测定各样品的核糖体ITS区,叶绿体mat K、rbc L、rpo C1、trn L(UAA)intron、psb A-trn H、atp B-rbc L、trn S(GCU)-trn G(UCC)、rpl20-rps12、trn L(UAA)-trn F(GAA)和线粒体nad1第2内含子、nad5第4内含子序列;以全萼秦艽Gentiana lhassica为外类群,进行系统学分析。结果共获得108条序列,ITS区变异位点最为丰富;筛选出6个叶绿体DNA片段;2个线粒体DNA片段可作为该属3个物种的条形码推荐序列;构建各物种多基因组多片段组合DNA条形码。结论 ITS区及筛选的6个叶绿体DNA片段均具有物种鉴别意义;2个线粒体DNA片段具有一定鉴别意义;为枸杞类物种鉴定及遗传背景分析提供基础资料。     

阳春砂的ITS序列分析

目的：用ITS全序列鉴别各地产阳春砂及常见伪品。方法：从各地产阳春砂及常见伪品绿壳砂和海南砂中提取总DNA，以核基因组通用引物ITS为引物进行扩增，扩增产物经纯化后，用PCR产物直接法进行测序。结果：各样品的ITS序列总长度均为626bp，其中ITS－1序列长度为248bp,5.8S序列长度为155bp，ITS－2序列长度为223bp；6个阳春砂和绿壳砂的ITS－2序列完全一致，各样品的5．8S序列完全一致，在ITS-1可各样品却有不同的碱基位点。结论：ITS－1序列可对阳春砂的道地性作出鉴别，明显区分其伪品。     

蝙蝠蛾拟青霉及金水宝胶囊的DNA条形码鉴定

目的:由于传统方法对发酵菌丝体鉴定困难,采用DNA条形码技术对金水宝胶囊原料菌种蝙蝠蛾拟青霉及相关产品进行快速鉴定。方法:采用内转录间隔区(ITS)序列对收集的蝙蝠蛾拟青霉及其易混淆物种共8种168份样品进行条形码鉴定,并基于ITS序列设计蝙蝠蛾拟青霉特异引物对相关产品进行快速鉴定。结果:44份不同来源蝙蝠蛾拟青霉的ITS序列长度均为499 bp,无变异位点。基于ITS序列可对蝙蝠蛾拟青霉及其7种易混伪品进行区别;通过ITS序列设计的蝙蝠蛾拟青霉特异性引物(ITS-BF/ITS-BR)可特异扩增得到长度102 bp的短片段,采用该片段可快速鉴别蝙蝠蛾拟青霉与其他虫草菌,并可区分市场上相关产品。结论:通过ITS序列及特异性引物可以实现蝙蝠蛾拟青霉及其相关产品的快速鉴定,为金水宝胶囊的生产及质量控制提供参考。     

桑黄肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析

目的 对桑黄肌动蛋白(Actin)基因进行克隆及序列分析.方法 搜索网上已知数据库中Actin基因,与本实验室测得的桑黄转录组数据进行生物信息学比对,找到转录组数据中与Actin相似性最高的片段,并根据其设计引物,提取桑黄菌丝体总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增Actin基因片段并对PCR产物进行测序.结果 得到一段839 bp的序列,序列分析表明,该片段编码279个氨基酸,与其他物种Actin基因核苷酸序列同源性在87％以上.结论 首次从桑黄中克隆出了Actin基因,为有效利用该基因奠定了基础.