miR-451通过Akt负向调控糖尿病肾病患者组织上皮间质转分化

目的研究微小RNA-451(miR-451)对糖尿病肾病组织上皮间质转分化(EMT)的影响。方法取健康人肾脏组织和糖尿病患者肾脏组织,RT-qPCR检测肾组织mi-451、Akt和EMT相关基因(E-钙黏素、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白)的表达;Western blot和免疫组织化学染色(IHC)检测Akt和EMT相关蛋白的表达。结果糖尿病肾病肾脏组织中miR-451和E-钙黏素mRNA表达量显著低于正常肾组织(P<0.05);Akt、vimentin和α-SMA mRNA表达量显著增多(P<0.05);Akt、vimentin和α-SMA蛋白表达量显著增高(P<0.05);E-钙黏素蛋白表达量显著降低(P<0.05)。结论糖尿病肾病时miR-451很可能通过Akt负向影响肾脏上皮间质转分化。     

肾小球系膜细胞与氧化应激

肾小球系膜细胞是最活跃的细胞固有成分,其在多种因素如高糖、血管紧张素-Ⅱ、醛固酮、机械牵拉、炎症反应、脂质沉积等刺激下表现为氧化应激(活性氧类产生过多和清除减少),促进肾小球硬化(包括糖尿病肾病)的发生和发展.干预治疗如噻唑烷二酮、血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂、醛固酮受体拮抗剂、他汀类药物、抗氧化剂等...     

肾小球系膜细胞增殖在糖尿病肾病肾小球硬化中作用的研究进展

糖尿病肾病(DN)是糖尿病患者常见的微血管慢性并发症.系膜细胞(MC)是肾小球内主要的细胞成分.高糖刺激可通过降低细胞内源性硫化氢的浓度、激活转化生长因子β(TGF-β)超家族和影响长链非编码RNA(Ln-cRNA)水平促进系膜细胞增殖.系膜细胞的异常激活在糖尿病肾小球硬化的进程中起重要推动作用.     

miR-21通过NF-κB信号通路影响血管紧张素Ⅱ诱导的肾小球系膜细胞炎症因子表达

目的探讨miR-21对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导肾小球系膜细胞增殖和炎症因子的影响。方法以AngⅡ诱导体外培养人肾小球系膜细胞HMC,在AngⅡ诱导的HMC细胞中转染miR-21模拟物。采用实时荧光定量PCR检测miR-21表达水平,噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖能力,Western blot检测NF-κB信号通路核心分子IκBα和p65蛋白及磷酸化水平,酶联免疫吸附法(ELISA)检测炎症相关因子白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量。采用NF-κB信号通路激活剂PMA处理,检测对炎症因子表达的影响。结果 AngⅡ组HMC细胞中miR-21表达水平较Control组降低(P<0.05),细胞增殖能力明显升高(P<0.05),炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表达升高(P<0.05)。进一步在AngⅡ组过表达miR-21后,IκBα和p65蛋白磷酸化水平显著降低(P<0.05),细胞增殖能力明显降低(P<0.05),IL-6、IL-1β和TNF-α的表达亦降低(P<0.05)。NF-κ...     

miR-92b-5p通过靶向HMGB1减轻糖尿病肾病大鼠肾损伤和炎症反应

目的:探讨微小RNA-92b-5p(miR-92b-5p)对糖尿病肾病(DN)大鼠肾损伤和炎症反应的作用及机制。方法:将大鼠分为对照组、DN组、慢病毒阴性对照(LV-NC)组、LV-miR-92b组、LV-高迁移率族蛋白B1(HMGB1)组和miR-92b+HMGB1组,每组15只。禁食12 h后,模型大鼠腹膜内注射60 mg/kg链脲佐菌素,对照大鼠腹膜内注射等体积柠檬酸盐缓冲液。3 d后,各处理组大鼠分别或联合静脉注射100μL LV-NC、LV-miR-92b和LVHMGB1(1×10¹¹U/L),每周2次,连续8周。全自动生化分析仪检测尿蛋白、血糖、血尿素氮和血清肌酐;RT-qPCR检测miR-92b-5p和HMGB1 mRNA的表达;双萤光素酶报告基因实验验证miR-92b-5p和HMGB1的靶向关系;Western blot法检测肾组织中HMGB1蛋白表达;HE染色观察肾损伤;流式细胞术检测肾细胞凋亡;ELISA检测肾组织中白细胞介素6(IL-6)、IL-1β和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的水平。结果:DN模型大鼠中miR-92b-5p低表达,HMGB...     

黄芩苷通过影响miR-141上调Sirt1表达而抑制高糖诱导的小鼠肾小球系膜细胞凋亡

目的:探讨黄芩苷在高糖环境下对小鼠肾小球系膜细胞凋亡的影响,并从微小RNA-141(miR-141)/沉默信息调节因子1(Sirt1)通路深入阐释黄芩苷对糖尿病肾病的治疗机制。方法:高糖(25 mmol/L葡萄糖)培养小鼠肾小球系膜细胞系SV40-MES-13模拟构建糖尿病肾病细胞模型,并分为正常对照组、高糖组、黄芩苷组和高糖+黄芩苷组。q PCR检测miR-141的表达水平,Western blot检测Sirt1的表达水平。双萤光素酶实验检测Sirt1与miR-141的调控关系。流式细胞术检测细胞凋亡。结果:与正常对照组相比,高糖条件下培养的系膜细胞内miR-141表达水平明显上调,Sirt1蛋白表达水平明显下调,细胞凋亡水平显著增加(P0.01);与高糖组比,高糖+黄芩苷组的细胞凋亡和miR-141表达水平明显降低,Sirt1蛋白表达水平明显升高(P0.01)。敲减Sirt1表达可以逆转下调miR-141对系膜细胞细胞凋亡和细胞内Sirt1蛋白水平的作用。过表达miR-141可以逆转黄芩苷抑制高糖对Sirt1蛋白水平和细胞凋亡的作用;过表达miR-141对系膜细胞的作用可以进一步被Sirt1的过表达所逆转。结论:黄芩苷可以通过抑制miR-141过表达,促进Sirt1表达水平上升,最终缓解高糖诱导的小鼠肾小球系膜细胞凋亡,达到治疗糖尿病肾病的作用。     

白细胞介素10基因转移抑制肾小球系膜细胞诱生炎症细胞因子

目的：通过建立白细胞介素１０（ＩＬ－１０）的重组逆转录病毒载体基因转移系统,观察ＩＬ－１０对脂多糖（ＬＰＳ）诱导的大鼠肾小球系膜细胞（ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒｍｅｓｅｎｇｉａｌｃｅｌ,ＧＭＣ）中细胞因子的产生及其基因表达的影响。方法：通过构建的重组逆转录病毒载体ｐＬＸ（ＩＬ－１０）ＳＮ将外源基因ＩＬ－１０转移至大鼠ＧＭＣ：（１）应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）,反转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）和ＥＬＩＳＡ检测ＩＬ－１０基因的整合和表达;（２）以ＲＴ－ＰＣＲ观察ＩＬ－１０基因转移对ＬＰＳ诱导的ＧＭＣ肿瘤坏死因子－α（ＴＮＦ－α）的ｍＲＮＡ表达的影响,以ＥＬＩＳＡ测定白细胞介素－１β（ＩＬ－１β）和ＴＮＦ－α的蛋白质表达。结果：外源性ＩＬ－１０基因已整合到靶细胞染色体ＤＮＡ并有效地表达,它能抑制ＬＰＳ诱生ＧＭＣ过度产生ＩＬ－１β,ＴＮＦ－α。结论：外源性ＩＬ－１０基因可以转移到ＧＭＣ并稳定表达,它能抑制ＧＭＣ炎症效应中细胞因子的产生及其基因表达。     

IgA肾病患者血清IgA1诱导正常人肾小球系膜细胞钙离子释放、转化生长因子β表达上调和纤连蛋白分泌

目的:研究IgA肾病患者血清IgA₁对正常人肾小球系膜细胞(HMC)活化及分泌炎症硬化因子的刺激作用,比较与正常人IgA₁的差异,探讨IgA肾病患者血清IgA₁病理生理作用。方法:亲和层析提取血清IgA₁,加热聚合(aIgA₁),激光共聚焦显微镜检测细胞内游离钙离子(Ca²⁺)释放,RT-PCR法检测细胞内TGF-β mRNA表达,间接竞争ELISA法检测细胞上清纤连蛋白(Fn)含量。结果:IgA肾病患者aIgA₁呈时间依赖性诱导正常HMC细胞内游离Ca²⁺释放、TGF-β mRNA表达和Fn分泌,作用趋势与正常人aIgA₁相同,高峰时间分别为孵育后60 s、24-36 h和36-48 h,但作用强度显著高于正常人aIgA₁;在作用高峰时间,患者组和正常人组Fluo-3最大相对荧光强度增加值分别为(95.83±11.43)和(55.88±12.72),TGF-β／GAPDH的比值分别为0.96±0.06和0.74±0.02,Fn含量分别为(6.45±0.18)μg/L和(5.54±0.43)μg/L,均有显著差异(P<0.05)。结论: IgA肾病患者血清IgA₁可以诱导体外培养的正常HMC活化并分泌炎症硬化因子,其作用较正常人IgA₁强,提示患者血清IgA₁分子与肾小球系膜细胞直接相互作用可能是IgA肾病发病机制之一。     

大黄素干预高糖培养大鼠肾小球系膜细胞的凋亡

背景：前期工作已经证实中药复方消可宁(制大黄、制附子、生黄芪)能有效防治早期糖尿病肾病并获得国家专利(专利号：200410064899X)。 目的：观察大黄主要活性成分大黄素对高糖培养的SD大鼠肾小球系膜细胞凋亡的影响。 方法：用20,40,80 μmol/L大黄素刺激高糖培养的SD大鼠肾小球系膜细胞,苏木精-伊红染色观察凋亡细胞形态,4',6-二脒基-2-苯基吲哚荧光染色观察细胞核凋亡情况,流式细胞仪观察细胞凋亡率。 结果与结论：苏木精-伊红染色及4',6-二脒基-2-苯基吲哚染色结果显示大黄素对高糖培养的肾小球系膜细胞的凋亡有影响,且与浓度与时间成正相关,细胞凋亡率组间差异有显著性意义(P < 0.05)。提示大黄素可诱导肾小球系膜细胞凋亡,且与药物浓度及时间成正相关。     

白细胞介素-13对肾小球系膜细胞炎症反应的拮抗作用

目的:探讨白细胞介素-13(IL-13)对肾小球系膜细胞(MC)炎症反应的调节作用。方法:ELISA法测定体外培养MC上清中TNF-α浓度。流式细胞术检测MC膜表面ICAM-1表达。逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)评估MCTNF-αmRNA及ICAM-1mRNA表达。结果:未受刺激的MC无TNF-αmRNA及其蛋白表达。经脂多糖(LPS)(10mg/L)刺激后,MC可高表达TNF-αmRNA及其蛋白。IL-13浓度为1μg/L、10μg/L时显著抑制LPS诱导MC表达TNF-αmRNA及其蛋白。IL-13(0.1μg/L)无抑制作用,IL-13(100μg/L)时完全抑制LPS诱导MC分泌TNF-α。无任何刺激时,MC低表达ICAM-1。TNF-α(100μg/L)诱导MC高表达ICAM-1mRNA及其蛋白。IL-13(10μg/L)和TNF-α(100μg/L)共作用MC,各时点均显示IL-13对TNF-α诱导MC表达ICAM-1mRNA及蛋白有抑制作用。结论:IL-13既抑制LPS刺激MC分泌TNF-α,也抑制TNF-α诱导MC表达膜糖蛋白ICAM-1。提示IL-13能从多个环节抑制MC的炎症反应。     

丹酚酸B对高糖诱导的肾小球系膜细胞表型转化及细胞外基质分泌的影响

目的:研究丹酚酸对高糖诱导的肾小球系膜细胞表型转化及细胞外基质分泌的影响及其机制。方法:培养人肾小球系膜细胞(HGMCs),随机分为正常对照组、高糖组及高糖+丹酚酸B高、中、低剂量组,高糖组和丹酚酸B各组用含高浓度(33.3 mmol/L)葡萄糖的培养基培养72 h,丹酚酸B各组同时加人相应浓度丹酚酸B共同孵育。Western blot法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达水平,ELISA法检测细胞Ⅰ型胶原(ColⅠ)、Ⅲ型胶原(ColⅢ)、纤维连接蛋白(FN)和层粘连蛋白(LN)的分泌水平,Western blot法检测转化生长因子β1(TGF-β1)的表达及Smad2和p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的磷酸化水平。结果:高糖孵育72 h后,肾小球系膜细胞α-SMA的蛋白表达水平明显升高,ColⅠ、ColⅢ、FN及LN蛋白的分泌水平显著增加(P 0.01),TGF-β1的表达及Smad2、p38 MAPK的磷酸化水平也明显升高(P 0.01);与丹酚酸B共同孵育可明显降低α-SMA蛋白的表达水平,ColⅠ、ColⅢ、FN和LN的分泌明显减少,TGF-β1的表达及Smad2、p38 MAPK的磷酸化水平显著下降(P 0.01或P 0.05)。结论:丹酚酸B可明显抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞表型转化,减少ColⅠ和ColⅢ等细胞外基质分泌,其机制与抑制TGF-β1/Smad信号通路及p38 MAPK活化有关。     

Three-dimensional analysis of increased vasculature around the glomerular vascular pole in diabetic nephropathy

In diabetic nephropathy, several small vessels are frequently observed around the glomerular vascular pole in addition to the usual afferent and efferent arterioles. To elucidate the morphology of these abnormal small vessels, a three-dimensional study was performed by using computer-aided reconstruction techniques. In the present study, the renal tissue samples of 21 biopsy and 73 autopsy cases of diabetic glomerulonephropathy were examined. In addition to ordinary light microscopic observations, three series of serial sections from one autopsy and two biopsy cases were analysed. Five glomeruli with increased numbers of vessels around the vascular pole were reconstructed three-dimensionally. The vasculature in and around the glomerulus was analysed in detail by rotating and viewing in different planes via computer-generated three-dimensional images. These vessels anastomose to the lobular structure of the intraglomerular capillary network, mainly to the afferent branches through the widened vascular hilus. The distal end of the vessels anastomoses to the peritubular capillary. The increased vasculature is interpreted as neoangiogenesis resulting from diabetes, which may have a functional role in facilitating efferent blood flow from the glomerulus.Dr. Wen Min is a visiting research fellow from Norman Bethune University of Medical Sciences, China     

低氧下K562细胞向红系分化进程中GATA-1与miR-451a表达的相关性研究

目的:探讨低氧下人慢性髓细胞性白血病K562细胞向红系分化进程中GATA结合蛋白1(GATA binding protein-1,GATA-1)与微小RNA-451a(microRNA-451a,miR-451a)表达的相关性。方法:将K562细胞分为常氧组和低氧(1%O₂)组,经40μmol/L氯化血红素分别诱导分化至48和72 h。RT-qPCR检测γ-珠蛋白(γ-globin)的mRNA表达,联苯胺染色观察细胞血红蛋白生成情况,流式细胞术检测CD235a的表达水平,验证K562细胞红系分化模型是否复制成功。在K562细胞向红系分化的不同时点,采用Western blot检测两组细胞GATA-1的蛋白表达情况;采用RT-qPCR检测两组细胞GATA-1 mRNA和miR-451a的表达水平并进行相关性分析。检测GATA-1过表达组、干扰组和阴性对照组K562细胞的红系分化指标,同时采用瑞氏-吉姆萨染色法分析上述组别细胞形态学的变化,明确GATA-1过表达和抑制后K562细胞的红系分化情况。RT-qPCR检测GATA-1过表达和抑制后miR-451a的表达变化。...     

氢分子对高糖状态下肾小球系膜细胞凋亡相关蛋白及Nrf2信号通路的影响

目的:探讨氢分子对高糖状态下肾小球系膜细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和cleaved caspase-3表达水平的影响及其可能的机制。方法:体外培养小鼠肾小球系膜细胞,实验分为正常对照组(C组,5.5 mmol/L葡萄糖)、甘露醇组(G组,5.5 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇)、高糖组(H组,25 mmol/L葡萄糖)和高糖+富氢水组(HH组,25 mmol/L葡萄糖+富氢水),培养48 h。采用Western blot法检测Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶1(HO-1)和NAD(P)H:醌氧化还原酶1(NQO-1)的蛋白水平;RT-PCR检测HO-1和NQO-1的mRNA表达;超氧化物阴离子荧光探针二氢乙啶检测活性氧簇(ROS)的水平;总超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒(WST-8法)检测SOD活性。结果:与C组比较,H组Bax和cleaved caspase-3的蛋白水平增加,Bcl-2蛋白表达减少(P0.05),而HH组上述蛋白表达水平与C组的差异均无统计学显著性;与H组比较,HH组的Bax和cleaved caspase-3蛋白下调,Bcl-2蛋白上调(P0.05)。H组细胞内的ROS水平较C组明显增高,SOD活性较C组明显降低(P0.05),而HH组的SOD活性与C组比较差异无统计学显著性;HH组细胞内的ROS水平较H组明显降低,SOD活性明显高于H组(P0.05)。与C组比较,H组的Nrf2蛋白以及HO-1和NQO-1 mRNA及蛋白表达均减少(P0.05);HH组的Nrf2、HO-1和NQO-1蛋白以及HO-1和NQO-1的mRNA表达均明显高于H组(P0.05)。结论:氢分子可抑制高糖状态下肾小球系膜细胞促凋亡蛋白的表达,同时诱导其抗凋亡蛋白的表达,其机制可能与激活Nrf2信号通路有关。     

保护素D1 通过抑制肾脏炎症及足突细胞上皮-间充质转化而抑制早期 糖尿病肾病小鼠肾纤维化

 目的：保护素D1 (PD1) 是一个潜在的抗炎症脂蛋白分子,本实验探讨其治疗早期糖尿病肾病（DN）肾纤维化的作用及机制。方法：用链脲佐菌素125 mg/kg 2次腹腔注射C57BL/6J雌性小鼠,建立早期DN小鼠模型。糖尿病模型成功后,用PD1（0.08 mg·kg-1·d-1）腹腔注射治疗,设正常鼠及DN鼠为对照。治疗8周后检测各组小鼠24 h尿蛋白及尿白蛋白定量、体重、肾重、肾重/体重比、血清及尿肌酐和肌酐清除率;用PAS染色法检测肾小球系膜区基质/肾小球面积比,用免疫荧光染色法检测肾皮质中巨噬细胞的数量,用Western blotting检测肾小球纤连蛋白（FN）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达,以及肾小球足突细胞特异性上皮标志蛋白zonula occludens-1(ZO-1)和P-cadherin的表达;同时,体外用高糖刺激小鼠巨噬细胞株RAW264.7,检测PD1对其分泌肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素1β（IL-1β）的抑制作用。体外用转化生长因子β1（TGF-β1）刺激小鼠足突细胞株,用Western blotting检测PD1对其诱导足突细胞上皮-间充质转化(EMT)中上皮细胞标志蛋白P-cadherin 和ZO-1减少的恢复作用,及间充质细胞标志蛋白成纤维细胞特异性蛋白1（FSP1） 和α-SMA过表达的抑制作用。结果：PD1能减少DN小鼠肾小球系膜基质的积聚、24 h尿蛋白及尿白蛋白定量、体重、肾重和肾重/体重比,抑制异常增高的肌酐清除率。PD1能减少DN小鼠肾皮质中巨噬细胞的数量,抑制DN小鼠肾小球FN和α-SMA的表达,恢复足突细胞特异性上皮标志蛋白ZO-1和P-cadherin的表达。PD1能抑制高糖诱导RAW264.7分泌TNF-α和IL-1β,能抑制TGF-β1诱导足突细胞FSP1和α-SMA表达的增加以及ZO-1和P-cadherin表达的减少。结论：PD1能减轻早期DN小鼠肾纤维化,其部分机制可能通过抑制肾脏的炎症及足突细胞EMT。