TRAIL联合水飞蓟素对人肝癌Huh7细胞凋亡的影响

目的探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)联合水飞蓟素(Sili)对人肝癌Huh7细胞凋亡的影响。方法 CCK8法检测细胞增殖抑制;分光光度法检测细胞caspase-3、caspase-8、caspase-9相对活性;Western blot检测细胞表面死亡受体4(DR4)、死亡受体5(DR5)的表达。结果 Sili与TRAIL联合作用Huh7细胞后,联合用药组与对照组及单独用药组相比,Huh7细胞的增殖率明显下降;caspase-3、caspase-8、caspase-9的相对活性明显提高。Sili作用Huh7细胞后能明显提高DR4、DR5蛋白表达。结论 Sili可通过上调死亡受体DR4、DR5表达而促进TRAIL诱导的Huh7细胞凋亡,为肝细胞癌的临床治疗提供了新的思路和方法。     

乙型肝炎病毒X基因促TRAIL诱导Huh7细胞凋亡的机制

目的探讨乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)X基因(HBX)促肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF relatedapoptosis inducing ligand,TRAIL)蛋白诱导人肝癌细胞Huh7凋亡的机制。方法应用脂质体转染法将pcDNA3.1-HBX、pcDNA3.1分别转染Huh7细胞,建立稳定表达HBX的细胞模型Huh7-HBX和空载体对照细胞模型Huh7-3.1;运用TRAIL蛋白分别作用Huh7-HBX细胞、Huh7-3.1及Huh7细胞后,采用CCK8、流式细胞术检测细胞增殖和凋亡情况;Western blot检测死亡受体4(deathreceptor 4,DR4)和死亡受体5(death receptor 5,DR5)的表达情况;分光光度法检测细胞caspase8和caspase3活性。结果 RT-PCR及Western blot证实成功构建细胞株Huh7-HBX;CCK8和流式细胞术检测结果均显示Huh7-HBX细胞的凋亡率明显高于Huh7-3.1及Huh7(P<0.05);Western blot显示Huh7-HBX细胞的DR4、DR5的表达量明显高于Huh7-3.1及Huh7细胞(P<0.05);caspase活性检测结果显示,Huh7-HBX细胞caspase8及caspase3的活性明显高于Huh7-3.1及Huh7(P<0.05)。结论 HBX能够通过上调Huh-7细胞表面死亡受体DR4、DR5的表达,进而促进TRAIL蛋白诱导的细胞凋亡,为进一步研究HBX的促凋亡机制提供实验依据。     

告达庭增强TRAIL诱导的HepG2细胞凋亡

目的:研究C21甾体苷元告达庭对肿瘤坏死因子凋亡诱导配体(TRAIL)诱导的Hep G2肝癌细胞增殖和凋亡的影响,并进一步明确其作用机制。方法:采用MTT法和细胞集落形成实验检测告达庭与TRAIL联合对细胞增殖的影响;TUNEL染色法检测细胞凋亡的变化;免疫印迹实验分析蛋白的表达水平。结果:告达庭与TRAIL联合作用Hep G2细胞24 h后,细胞活力明显下降,细胞增殖受到抑制;同时,两者联用后细胞凋亡数目明显增加,显著高于告达庭和TRAIL单用诱导的细胞凋亡率;与对照相比,告达庭与TRAIL联用促进了caspase-3、caspase-7、caspase-9和PARP的活性切割,而凋亡抑制蛋白survivin的表达则下调。结论:告达庭能够增强TRAIL诱导Hep G2细胞凋亡,其机制可能与激活caspase家族因子的活性切割和抑制survivin的表达相关。     

AZD5363诱导肝癌细胞凋亡与自噬的实验研究

目的:研究新型Akt抑制剂AZD5363对人肝癌HepG2和Huh7细胞活力、凋亡和自噬的影响,并探讨其抗肿瘤活性的分子机制。方法:采用不同浓度AZD5363作用于体外培养的HepG2和Huh7细胞,MTT法检测细胞活力;TUNEL标记法检测肝癌细胞凋亡的变化;Western blot实验分析细胞凋亡相关蛋白多腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose) polymerase,PARP]及自噬标志蛋白LC3-II的表达水平;细胞转染GFP-LC3绿色荧光蛋白融合表达质粒检测细胞自噬。结果:AZD5363能够剂量依赖性地抑制HepG2和Huh7细胞活力,并通过促进PARP的切割而诱导肝癌细胞发生凋亡;肝癌细胞给予AZD5363后,细胞内GFP-LC3融合蛋白斑点增多,同时LC3-II的表达水平增加(P 0.05);当用氯喹阻断自噬后,AZD5363对肝癌细胞凋亡的诱导作用明显增强。结论:AZD5363可促进HepG2和Huh7细胞发生凋亡和保护性自噬。抑制自噬促进了AZD5363诱导的肝癌细胞凋亡。     

CP466722抑制HepG2细胞增殖并诱导细胞凋亡

目的:研究共济失调毛细血管扩张症突变蛋白(ATM)抑制剂CP466722对人肝细胞癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响及其可能的分子机制。方法:MTT法检测CP466722对HepG2细胞活力的抑制作用,细胞集落形成实验观察CP466722对细胞增殖的影响,流式细胞术分析细胞周期的变化,TUNEL染色观察CP466722对细胞凋亡诱导作用,Western blotting检测细胞内蛋白的表达水平。结果:CP466722能够剂量依赖性地抑制HepG2细胞活力与细胞增殖;HepG2细胞经CP466722作用24 h后,细胞周期明显阻滞于G_2/M期,同时磷酸化细胞分裂周期蛋白2(p-Cdc2)、细胞分裂周期蛋白25 C(Cdc25C)和磷酸化Cdc25C(p-Cdc25C)的蛋白水平下降,而p27的蛋白表达则上调。较高浓度的CP466722诱导HepG2细胞发生凋亡,促进胱天蛋白酶3(caspase-3)和多腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)的剪切。此外,CP466722抑制β-联蛋白(β-catenin)及其下游因子生存素(survivin)的表达,上调p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)的磷酸化水平。结论:CP466722抑制HepG2细胞增殖并诱导细胞发生凋亡,其机制可能与其抑制β-catenin信号途径和激活p38 MAPK相关。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体抑制卵巢癌3AO细胞增殖并促进细胞凋亡北大核心CSCD

目的研究肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导卵巢癌3AO细胞凋亡的分子机制。方法用(12.5、25.0、50.0)ng/mL的重组人TRAIL蛋白与卵巢癌3AO细胞共孵育72 h,观察细胞的形态变化,在不同时间段收集细胞,MTT法检测细胞生长增殖,计算细胞的生长抑制率,annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期,原位末端标记法(TUNEL)观察凋亡形态特征,Western blot法检测凋亡相关蛋白caspase-3蛋白表达。结果各浓度组的TRAIL都可以引起3AO细胞形态学改变,对细胞增殖均有抑制作用(P<0.05),25 ng/mL和50 ng/mL TRAIL处理的3AO细胞出现明显的细胞凋亡和周期阻滞,随着药物作用时间的延长,G1期细胞比例逐渐增多,而S期和G2/M期细胞比例减少,caspase-3蛋白呈高表达,但两组之间的凋亡率和凋亡蛋白的表达无显著性差异(P>0.05)。结论 TRAIL是通过抑制细胞周期、阻滞DNA合成、活化caspase-3诱导卵巢癌3AO细胞凋亡。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体抑制卵巢癌3AO细胞增殖并促进细胞凋亡

目的研究肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导卵巢癌3AO细胞凋亡的分子机制。方法用(12.5、25.0、50.0)ng/mL的重组人TRAIL蛋白与卵巢癌3AO细胞共孵育72 h,观察细胞的形态变化,在不同时间段收集细胞,MTT法检测细胞生长增殖,计算细胞的生长抑制率,annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期,原位末端标记法(TUNEL)观察凋亡形态特征,Western blot法检测凋亡相关蛋白caspase-3蛋白表达。结果各浓度组的TRAIL都可以引起3AO细胞形态学改变,对细胞增殖均有抑制作用(P0.05),25 ng/mL和50 ng/mL TRAIL处理的3AO细胞出现明显的细胞凋亡和周期阻滞,随着药物作用时间的延长,G1期细胞比例逐渐增多,而S期和G2/M期细胞比例减少,caspase-3蛋白呈高表达,但两组之间的凋亡率和凋亡蛋白的表达无显著性差异(P0.05)。结论 TRAIL是通过抑制细胞周期、阻滞DNA合成、活化caspase-3诱导卵巢癌3AO细胞凋亡。     

力达霉素诱导人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞凋亡和周期阻滞

目的研究力达霉素(LDM)的抗骨髓瘤作用,并探讨抗骨髓瘤的作用机制。方法处于对数增殖期人多发性骨髓瘤细胞RPMI 8226细胞随机分为空白对照组及0.1、0.5和1 nmol/L LDM组,用MTS法和流式细胞术检测细胞增殖率、细胞周期分布和凋亡情况,采用Western blot法检测凋亡相关蛋白和周期相关蛋白的表达量。结果细胞培养48 h后,不同浓度LDM组细胞增殖数显著低于空白对照组数(P0.05),LDM组S期和G2/M期的细胞数显著高于对照组数(P0.05),细胞凋亡率显著高于空白对照组数(P0.05),LDM的增殖抑制作用和凋亡诱导作用呈剂量依赖性。不同浓度LDM组细胞caspase-3、caspase-7、caspase-9和poly ADP-ribose polymerase(PARP)的蛋白被切割明显高于对照组(P0.05),P21和P27蛋白的表达量明显高于对照组数(P0.05)。结论 LDM能诱导人多发性骨髓瘤细胞RPMI 8226细胞凋亡并诱导S期和G2/M期阻滞,其诱导凋亡和周期阻滞的机制有待于进一步深入研究。     

枸橘苷对胃癌细胞抑制作用及其机制研究

目的:探究枸橘苷对AGS胃癌细胞抑制作用及其机制。方法:MTT实验检测枸橘苷对AGS细胞活力的影响;流式细胞术分析细胞周期分布以及细胞凋亡;细胞核染色分析AGS细胞在枸橘苷处理之后的形态学变化;Western blot检测枸橘苷对AGS细胞中外源性凋亡通路相关蛋白FasL、caspase-8、caspase-3和PARP,以及内源性凋亡相关蛋白Bak、Bcl-xL、Bax和caspase-9蛋白水平的影响。结果:MTT实验表明枸橘苷抑制AGS胃癌细胞活力,并且呈时间、剂量依赖性(P0.05);流式细胞术分析结果表明枸橘苷使细胞停滞在G_1期,凋亡数量增加(P0.05);核染色结果说明,与对照组相比,150μmol/L枸橘苷处理后细胞核明显浓缩,细胞凋亡数量增加;Western blot实验表明枸橘苷上调FasL,激活caspase-8和caspase-3,促使活化的caspase-3底物PARP切割(P0.05),而对线粒体调节的内源性凋亡通路相关蛋白没有影响。结论:枸橘苷通过激活外源性凋亡通路促使AGs细胞凋亡,抑制胃癌细胞增殖,从而发挥抗肿瘤作用,在临床上可能成为治疗胃癌的新型药物。     

七叶皂苷钠通过抑制Akt和ERK信号通路诱导HeLa细胞凋亡及对死亡受体表达的影响

 目的:探讨七叶皂苷钠诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡的作用及其分子机制。方法:采用MTT法检测七叶皂苷钠对宫颈癌HeLa细胞的生长和增殖抑制作用;倒置显微镜观察细胞形态改变;利用annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡率;采用DAPI单染法荧光显微镜下观察细胞核变化情况; 利用Western blotting检测凋亡相关蛋白［聚(ADP-核糖)聚合酶（PARP）、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9、pro-caspase-3］和细胞存活相关信号通路（Akt、ERK）以及TRAIL受体（DR4、DR5）的变化情况。结果:七叶皂苷钠以剂量依赖的方式显著抑制宫颈癌HeLa细胞的生长和增殖;七叶皂苷钠作用于HeLa细胞后,可见典型的凋亡细胞形态学特征,细胞凋亡率显著增加;随着七叶皂苷钠浓度升高,cleaved PARP、cleaved caspase-8和cleaved caspase-9明显增多,pro-caspase-3显著减少,p-Akt和p-ERK激活减少,细胞内DR4和DR5总蛋白水平上调。结论:七叶皂苷钠通过抑制细胞存活相关信号通路,上调死亡受体水平,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。     

欧前胡素通过上调细胞表面死亡受体5的数量增强TRAIL对乳腺癌细胞的杀伤活性

目的:探讨中药活性成分欧前胡素对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)的协同抗乳腺癌效应及分子机制。方法:将人乳腺癌细胞T-47D和MCF-7按对照组、欧前胡素组、TRAIL组、欧前胡素+TRAIL组及欧前胡素+TRAIL+死亡受体5(DR5)siRNA组进行分组,MTT法检测T-47D和MCF-7细胞活力,流式细胞术检测T-47D细胞凋亡和线粒体膜电位,Western blot实验和流式细胞术检测T-47D细胞表面DR5的表达水平及caspase-8、caspase-3的活化水平。结果:MTT实验结果显示,欧前胡素联合用药能显著提高各浓度TRAIL对T-47D和MCF-7细胞的杀伤活性;流式细胞术和Western blot结果显示欧前胡素处理能显著提高T-47D细胞DR5的表达水平和活性氧簇产生水平(P0.05)。另外,流式细胞术和Western blot结果还显示,欧前胡素联合用药能显著增强TRAIL促进T-47D细胞线粒体膜电位损伤、caspase-8和caspase-3活化及凋亡的作用。结论:欧前胡素通过上调乳腺癌细胞DR5的表达水平发挥对TRAIL的协同抗乳腺癌效应。     

Ectopic expression of Bcl-2 and Bcl-xL inhibits apoptosis induced by TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) through suppression of caspases-8, 7, and 3 and BID cleavage in human acute myelogenous leukemia cell line HL-60.

Tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) is one of the latest members of the TNF superfamily known to induce apoptosis in a wide variety of tumor cells. Some cell types, however, are quite resistant to TRAIL. We investigated the effect of ectopic expression of Bcl-2 and Bcl-xL on TRAIL-induced apoptosis in human acute myelogenous leukemia HL-60 cells. We found that HL-60 cells, which express TRAIL receptors (also called death receptor, DR) DR4, DR5, and Dc (decoy) R2, are highly sensitive to TRAIL-induced cytotoxicity. Greater than 90% killing occurred within 24 h of TRAIL treatment. The expression of Bcl-2 and Bcl-xL, however, completely abolished the TRAIL-induced cytotoxic effects. Treatment of HL-60 cells with TRAIL induced caspase-8 activation within 2-4 h, but no activation could be seen in Bcl-2-expressing or Bcl-xL-expressing cells. TRAIL also induced cleavage of BID, which was also abolished by Bcl-2 and Bcl-xL. Similarly, TRAIL activated caspase-3 and caspase-7 in control cells but not in cells expressing Bcl-2 or Bcl-xL. Cleavage of the caspase-3 substrate poly(ADP-ribose) polymerase (PARP), was abrogated by ectopic expression of Bcl-2 and Bcl-xL. Inhibition of caspases by the pan-caspase inhibitor, benzyloxycarbonyl-valine-alanine-aspartate-fluoromethylketone (zVAD-fmk) abolished the TRAIL-induced apoptosis. Overall, these results indicate that TRAIL-induced apoptosis involves activation of caspase-8, caspase-7, caspase-3, and BID cleavage, and Bcl-2 and Bcl-xL prevents TRAIL-induced apoptosis by abrogating caspase activation and BID cleavage.     

阻断Sonic Hedgehog信号对不同人肝癌细胞生长的影响

 目的: 研究阻断Sonic Hedgehog (Shh)信号对不同人肝癌细胞生长的影响,探讨阻断Shh信号抑制肝癌细胞生长的机制。方法: RT-PCR法检测Shh信号分子在3株人肝癌细胞(BEL-7402、Huh7和HepG2)中的表达,并检测Shh阻断抗体作用后BEL-7402细胞Shh信号效应分子表达变化;MTT法检测人肝癌细胞增殖活性;流式细胞术检测人肝癌细胞凋亡;Western blot 检测凋亡相关蛋白表达。结果: Shh信号分子在3株人肝癌细胞中均有表达,Shh阻断抗体可以下调Shh信号效应分子patched (Ptch)、Gli1和Gli2的表达;Shh阻断抗体可以抑制3株肝癌细胞生长,增加G₀/G₁期细胞,并诱导细胞凋亡;Shh阻断抗体作用后,BEL-7402细胞pro-caspase-3、pro-caspase-8和pro-caspase-9蛋白表达水平下降,cleaved caspase-3、cleaved caspase-8和cleaved caspase-9蛋白表达水平升高。结论: 阻断Shh信号可抑制Shh高表达的人肝癌细胞生长,阻滞细胞周期于G₀/G₁期,并诱导肝癌细胞凋亡。     

Interactive effects of histone deacetylase inhibitors and TRAIL on apoptosis in human leukemia cells: involvement of both death receptor and mitochondrial pathways

In the present study, we aimed to elucidate the mechanism responsible for the interactive effects of histone deacetylase (HDAC) inhibitors [suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA), MS-275, m-carboxycinnamic acid bishydroxamide (CBHA), and trichostatin-A (TSA)] and tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) on apoptosis in leukemia cells. HDAC inhibitors enhance the apoptosis-inducing potential of TRAIL in leukemia cells (HL60, Jurkat, K562, and U937) through multiple mechanisms; up-regulation of DR4, DR5, Bak, Bax, Bim, Noxa and PUMA, down-regulation of IAPs, Mcl-1, Bcl-2, Bcl-XL and cFLIP, release of mitochondrial proteins (cytochrome c, Smac/DIABLO and Omi/Htr2) to the cytosol, induction of p21WAF1/CIP1 and p27KIP1, activation of caspase-3 and cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase (PARP). The sequential treatment of cells with HDAC inhibitors followed by TRAIL was more effective in inducing apoptosis than the concurrent treatment or single agent alone. The up-regulation of death receptors and inhibition of cFLIP by HDAC inhibitors will increase the ability of TRAIL to induce apoptosis, due to enhance activation of caspase-8, cleavage of Bid, and release of mitochondrial proteins to the cytosol, and subsequent activation of caspase-9 and caspase-3. Thus, the combination of HDAC inhibitors and TRAIL can be used as a new therapeutic approach for the treatment of leukemia.     

TNF相关的凋亡诱导配体与肿瘤

TNF相关的凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL），属于TNF 超家族成员，又称为Apo-2L，TRAIL能诱导多种肿瘤细胞的凋亡，而正常的细胞却对其不敏感，TRAIL主要通过与其受体结合激活caspase-8，启动非线粒体和线粒体依赖途径导致细胞凋亡。部分肿瘤细胞对TRAIL的敏感性较差，其原因与TRAIL的受体、信号转导途径激酶以及相关蛋白存在密切联系。     

Perifosine通过抑制PI3K/Akt途径调节人胶质瘤U251细胞增殖、凋亡与自噬

 目的: 探讨Akt激酶抑制剂perifosine对人胶质瘤U251细胞凋亡、细胞周期和自噬的影响,确定perifosine诱导的细胞自噬与其促进胶质瘤细胞凋亡的相关性。方法: Perifosine处理U251细胞后,采用MTT法检测细胞活力;流式细胞术分析perifosine对U251细胞周期的影响;Annexin V-FITC/PI双标法检测perifosine对胶质瘤细胞凋亡的作用;免疫印迹法检测细胞内P21、P27和cyclin B1等细胞周期调控相关蛋白以及caspase-9、PARP等细胞凋亡相关蛋白的表达水平;通过观察细胞内自噬标志分子LC3-Ⅱ的分布与表达来确定perifosine对自噬的诱导作用。结果: Perifosine剂量依赖性地抑制U251细胞活力,能够通过抑制cyclin B1的表达而阻滞胶质瘤细胞周期于G₂期。Perifosine促进了U251细胞内caspase-9和PARP的剪切,抑制survivin表达,从而诱导胶质瘤细胞发生凋亡。同时,perifosine与自噬抑制剂氯喹联用后,U251细胞凋亡数量明显增加。结论: Perifosine能够抑制U251细胞的增殖,同时诱导细胞发生凋亡与自噬,抑制自噬促进了perifosine诱导的胶质瘤细胞凋亡。     

PI3K/mTOR双重抑制剂PF-04691502诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡

 目的：检测PI3K/mTOR双重抑制剂PF-04691502对人胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响及可能的分子机制。方法：MTT法检测细胞活力;流式细胞术分析细胞周期变化;Annexin V-FITC/PI双标法测定细胞凋亡;免疫印迹分析细胞内蛋白表达的变化。结果：PF-04691502处理SGC-7901细胞后,降低细胞的活力并促进细胞阻滞于G1期,同时抑制cyclin D1的表达并上调p21的蛋白水平。PF-04691502可明显诱导SGC-7901细胞凋亡,其机制与其促进caspase家族成员的活化并切割聚（腺苷二磷酸核糖）聚合酶［poly(ADP-ribose)polymerase, PARP］ 底物密切相关。结论：PI3K/mTOR 双重抑制剂PF-04691502能够通过阻滞细胞周期来抑制SGC-7901细胞的增殖,同时能够激活细胞内caspase,使PARP发生剪切而诱导细胞凋亡。