杜仲愈伤组织中绿原酸的含量

杜仲愈伤组织中绿原酸的含量王俊丽陈丕铃(河北大学生物技术研究中心保定071002)李会肖(河北省辛集市林业局辛集052360)杜仲EucommiaulmoidesOliv.是我国名贵的药用植物,具有补肝肾、强筋骨、降血压等功效。目前已有从杜仲叶片中提取绿原酸纯品的报道[1],本文对离体培养愈伤组织中绿原酸含量进行了分析测定,以便为高纯度绿原酸的分离提取提供参考。1材料和方法1.1材料:所用材料为本研究室培养的杜种愈伤组织。1.2愈伤组织的培....     

茜草转录组分析及其蒽醌类化合物合成相关基因的挖掘

目的获得茜草Rubia cordifolia转录组学信息及挖掘其蒽醌类化合物生物合成的关键酶基因,为茜草的功能基因克隆与分析提供参考。方法采用Illunima Hiseq TM 2000 150PE高通量测序技术对茜草进行转录组测序,使用Trinity软件完成Unigene的de novo拼接,基于BLAST实现Unigene的分类、功能注释、代谢通路分析和蛋白功能注释等。结果最终获得7.3 Gb数据,通过de novo拼接注释得到Unigene 66 646条,平均长度为1 424 bp,所有Unigene能被NCBI nonredundant protein sequences(NR)、NCBI nucleotide sequences(NT)、kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)、A manually annotated and reviewed protein sequence database(Swissprot)、gene ontology(GO)、eu Karyotic ortholog groups(KOG)和protein family(Pfam)数据库所注释,注释成功率100%,找到与茜草蒽醌类化合物生物合成相关的基因64条。结论首次对茜草转录组进行了分析,并获得了茜草蒽醌类化合物生物合成相关的候选基因,为茜草的分子生物学研究提供了丰富的数据资源,也为后期开展茜草蒽醌类化合物次生代谢途径解析奠定了基础。     

多穗柯转录组分析及黄酮类化合物合成相关基因的挖掘

多穗柯具有甜味和保健功效,其中黄酮类化物是主要活性物质。为获取多穗柯转录组数据库以及黄酮类化合物生物合成相关基因,该研究用RNA-Seq中的Illumina Hi Seq 4000对多穗柯嫩叶进行转录组测序,共获得6 Gb数据,拼接后得到41 043条Unigene,与7个基因数据库进行比对,可归类于51个GO分类中,涉及到237个KEGG标准代谢通路。找到黄酮合成相关基因28条。通过Micro Satallite(MISA)软件分析筛选到18 161个SSR,其中单碱基重复最丰富,有7 346个。此研究得到大量转录本信息,为多穗柯的分子生物学研究提供了宝贵的转录组数据库资源。     

刺五加与其愈伤组织中皂苷合成关键酶基因表达的差异分析

目的:分析刺五加叶片、叶柄及其愈伤组织中SS、SE和bAS基因表达量的差异。方法:以刺五加叶片和叶柄为外植体,诱导获得愈伤组织。实时荧光定量PCR检测SS、SE和bAS基因的表达量。结果:刺五加SS、SE和bAS基因在刺五加叶片、叶柄及其愈伤组织中都有表达,SS、SE和bAS基因在叶片愈伤组织中的表达量分别为叶片中的89.3%、73.8%和83.4%,在叶柄愈伤组织中的表达量分别为叶柄中表达量的80.2%、87.7%和70.9%。结论:刺五加愈伤组织中SS、SE和bAS基因的表达量显著低于植株中的表达量。     

基于高通量测序的玄参根部转录组学研究及萜类化合物合成相关基因的挖掘

该研究应用新一代测序技术Illumina HiSeq~(TM)4000在转录水平上对药用植物玄参根部进行测序,结合生物信息学方法开展基因功能注释和SSR位点搜索。通过测序,共获得65 602 036条原始序列。利用生物信息学软件拼接和组装序列,获得73 983条unigene,平均长度823 bp。序列同源性比较表明,56 389条unigene与其他物种具有不同程度的同源性。通过Swiss-Prot,GO,KEGG,COG比对注释,发现520条编码玄参次生代谢途径关键酶基因和191个相关转录因子。利用MISA软件在所有unigenes中共搜索到11 659个SSR位点,重复类型以二核苷酸为主。该研究所获得的参与次生代谢的关键基因可为研究玄参药用成分的生物合成和调控机制奠定基础,获得的大量SSR位点为后续研究玄参种质鉴定及遗传多样性研究提供参考。     

基于红花不同组织转录组数据的转录因子分析

目的注释并分类红花Carthamus tinctorius中转录因子家族,分析其在不同组织间的表达水平差异。方法使用红花不同组织转录组测序数据组装Unigene,利用Nr数据库中转录因子信息比对并注释红花转录因子,同时对MYB转录因子家族的基因表达、蛋白保守结构域及系统发育树等内容重点分析。结果红花转录组测序数据中共获得731个转录因子,分属42个转录因子家族。MYB转录因子家族成员的表达及蛋白结构分析显示,MYB转录因子家族在花冠中表达差异显著,氨基酸序列中存在3个保守的蛋白核心结构,系统发育树分析显示聚为2类MYB亚族。结论红花MADs-box、b HLH、MYB、AP2转录因子家族成员最多,在不同组织间表达差异显著,MYB转录因子家族具有一定保守性。     

夏枯草的转录组测序与次生代谢产物生物合成相关基因的挖掘

目的获得夏枯草转录组信息,探索夏枯草次生代谢产物生物合成的分子基础。方法利用Illumina HiSeq 2000高通量测序技术对夏枯草果穗、茎和叶等部位进行转录组测序,经Trinity软件组装后获得Unigene,并进行系统的生物信息学分析。结果共获得77 863条Unigene,平均长度为716.72 nt。通过与NR、Swiss-Prot、COG等7个公共数据库进行BLAST比对,共有41 367个Unigene获得注释,注释率为53.13%。在KEGG数据库中,有1 406条Unigene被注释到次生代谢产物合成。通过对转录组数据深入挖掘发现,参与夏枯草三萜类骨架合成的Unigene共有60个,参与酚酸类合成的Unigene共有24个,参与次生代谢后修饰的Unigene共有259个,参与其他次生代谢合成的Unigene共有118个。结论夏枯草转录组数据为探索夏枯草次生代谢产物的生物合成机制提供了重要的资源,也为利用代谢工程增加夏枯草中重要次生代谢产物含量提供了基础信息。     

岗梅全长转录组测序及其三萜皂苷生物合成相关基因的挖掘

目的:获得岗梅全长转录组数据库,为深入挖掘岗梅功能基因奠定基础。方法:采用基于PacBio Sequel平台的单分子实时测序技术获取岗梅的根、茎、叶样品的转录组数据,并利用非冗余蛋白(NR)、核苷酸序列(NT)、SwissProt蛋白序列数据库、京都基因与基因组百科全书(KEGG)、真核生物相邻类的聚簇(KOG)、蛋白家族(Pfam)、基因本体(GO)进行注释,分析并鉴定编码三萜皂苷生物合成的关键酶的转录本。结果:全长转录组共获得89629个转录本,其中81313个在公共数据库进行了注释。KEEG代谢通路富集分析表明,623个转录本参与岗梅中三萜皂苷合成相关的3条代谢通路,其中263个转录本编码了三萜皂苷生物合成途径的21个关键酶。此外,还预测了2471个转录因子、40421个简单重复序列位点、22119个长链非编码RNA(lncRNA)和29131个mRNA。结论:丰富了岗梅的转录组数据,并为鉴定参与三萜皂苷和其他次生代谢物生物合成的候选基因提供参考,促进其分子生物学和基因组学的研究。     

杜仲愈伤组织与悬浮细胞中黄酮和绿原酸积累研究

目的:比较杜仲愈伤组织和悬浮细胞生长及其次生代谢产物黄酮和绿原酸的积累.方法:将杜仲无菌苗真叶诱导的愈伤组织进行悬浮培养,研究了悬浮培养物生长的动态和总黄酮类及绿原酸产量积累的动态.结果:杜仲愈伤组织中黄酮和绿原酸最高分别达到13.46,1.712 mg·g~(-1),而悬浮细胞中黄酮和绿原酸最高分别达到16.63,3.93 mg·g~(-1).结论:与愈伤组织相比,悬浮细胞具有生长周期短、速率快、黄酮和绿原酸积累量高的优势.     

高效液相色谱法测定杜仲愈伤组织和悬浮细胞中绿原酸

目的建立高效液相色谱法测定杜仲愈伤组织和悬浮细胞中绿原酸含量。方法利用Hypersil C18-ODS柱（250mm×4．6mm，5μm）色谱柱，乙腈-水-磷酸溶液（12：87．9：0．1）为流动相，检测波长为327nm，流速1．0ml／min，柱温为25％。结果绿原酸在2．216～55．4μg/ml范围内线性关系良好，r=0．9981，愈伤组织和悬浮细胞中绿原酸的平均加样回收率分别为100．69％和97．62％，RSD分别为2．42％和2．71％。结论该方法快速简便，准确可靠。杜仲愈伤组织和悬浮细胞中绿原酸含量分别为1．528mg／g和3．949mg／g。     

杜仲皮化学成分研究

目的研究杜仲Eucommia ulmoides皮的化学成分。方法采用正相硅胶柱色谱、反向ODS柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱、制备HPLC等手段对杜仲皮化学成分进行分离纯化,并根据HR-ESI-MS、NMR等波谱数据进行结构鉴定。结果从杜仲皮95%乙醇提取物中分离得到9个化合物,鉴定为甘草黄酮B(1)、3,5,4′-三羟基-7,3′-二甲氧基黄酮(2)、甘草素(3)、formononetine(4)、(+)-4′-O-methylglabridin(5)、paratocarpin E(6)、龙血素C(7)、threo-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1-methoxy-2-{4-[1-formyl-(E)-vinyl]-2-methoxyphenoxy}-3-propanol(8)、diospyrosin(9),其中7个黄酮和2个苯丙素类。结论化合物1～9均首次从杜仲属植物中分离得到。     

杜仲叶和果实中内生真菌的分离及抑菌活性

目的从杜仲Eucommia ulmoides叶和果实中分离具有抑菌作用的内生真菌。方法采用平板培养法从杜仲叶片和果实中分离内生真菌,通过对峙法和生长速率法考察这些内生真菌的抑菌活性,并通过HPLC法考察其具有代谢产生杜仲有效活性成分的能力。对具有良好抑菌效果和能够代谢杜仲活性成分的内生真菌进行ITS序列测定,鉴定其归属。结果从健康叶片和果实中分离到52株内生真菌,其中2个菌株的提取液中含有绿原酸,11个菌株至少对4种病原菌具有抑制作用,其中29号菌株(链格孢属Alternaria sp.)对芽孢杆菌Fusarium graminearum的抑制效果最好,其抑制率高达82.6%。通过与Gen Bank数据比对,这些内生真菌分别属于链格孢属Alternaria、黑孢属Niqrospora和座囊菌纲(Dothideomycetes)。结论从杜仲叶和果实中分离到11株具有抑菌作用的内生真菌,这些具有抑菌作用的内生真菌可用于生物制药和农业产业。     

杜仲的血清药物化学研究

目的对杜仲Eucommia ulmoides进行血清药物化学研究。方法采用UHPLC-Q-TOF-MS技术,通过比较杜仲提取物、给药组及空白组大鼠血清的指纹图谱,确定口服杜仲提取物后大鼠血中移行成分。结果给药组大鼠血清指纹图谱与空白组血清指纹图谱对比有明显不同。含药血清中出现7个移行成分,与杜仲提取物指纹图谱在相同保留时间出峰,为原型成分。采用对照品对照,确定5个色谱峰所表征的化学成分为原型吸收入血成分,依次为京尼平苷酸、原儿茶酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷。通过查阅文献,推断了2个色谱峰所表征的化学成分可能为1-羟基松脂醇二葡萄糖苷、杜仲醇。结论血中移行成分可能为杜仲的体内直接作用物质,为明确杜仲药效物质基础提供了科学依据。     

基于ITS2序列的杜仲及其主要混伪品的鉴定

目的 分析杜仲及其混伪品的ITS2条形码序列,探讨杜仲及其混伪品鉴定的新方法,为杜绝市售商品药材混乱现象提供技术支撑。方法 提取样品DNA,利用PCR方法对样品进行核基因ITS2 片段扩增,采用DNA克隆测序技术对ITS2基因进行双向测序,所得序列经Seqman程序拼接后,用软件MEGA 4.1进行相关数据分析,并构建邻接（Nighbor-joining, NJ）树。利用网站已建立的ITS2数据库预测ITS2二级结构。结果 杜仲种内最大K2P遗传距离远远小于其与混伪品的种间最小K2P遗传距离;由构建的系统聚类树图可以看出,不同来源的杜仲样品聚成一支,表现为单性系,并与其他混伪品明显分开;比较ITS2二级结构发现,杜仲与其混伪品在4个螺旋区的茎环数目、大小、位置以及螺旋发出时的角度均有明显差异。结论 ITS2序列作为DNA条形码可以有效地鉴别杜仲及其混伪品,为其种质资源鉴定及临床安全用药提供了重要分子依据。     

杜仲板皮和枝皮中4种有效成分差异性比较

目的采用RP-HPLC法测定杜仲板皮和枝皮中桃叶珊瑚苷、绿原酸、京尼平苷和松脂醇二葡萄糖苷的量。方法采用Cosmosil C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,以乙腈-0.1%磷酸水溶液进行梯度洗脱,体积流量0.8 m L/min,检测波长208 nm,柱温25℃。结果杜仲板皮中桃叶珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷量大于枝皮,枝皮绿原酸、京尼平苷量大于板皮;在不同产地来源上,杜仲板皮和枝皮中桃叶珊瑚苷、绿原酸、京尼平苷和松脂醇二葡萄糖苷平均质量分数有一定差异性。结论该方法简便、快速、准确可靠,为更全面合理科学地对杜仲药材质量的评价提供了技术支撑。     

杜仲生态种植探讨及对其健康产业发展的启示

杜仲既是我国特有的名贵药材，又是天然橡胶资源，同时也是维护生态安全、实现绿色种植的重要树种。规模化种植是杜仲产业发展的必由之路。生态种植遵循“整体、协调、循环、再生”原则，保障生态与经济良性循环，是如今积极倡导的一种种植方式。开展杜仲生态种植对其整个产业的发展有重要意义。通过梳理杜仲不同空间尺度上自然生境及地理分布信息，结合现有栽培模式，对其生态种植工作进行梳理总结，以期为杜仲生态种植及后续产业发展提供参考。     

杜仲毛状根培养条件优化及其桃叶珊瑚苷药用成分的研究

目的:诱导杜仲毛状根的发生及筛选优良毛状根系.方法:利用发根农杆菌C58C1诱导杜仲不同外植体产生毛状根,并利用HPLC测定桃叶珊瑚苷含量.结果:采用杜仲无菌苗胚轴经菌液浸染20 min,共培养3 d可得到最佳转化效果.液体培养的生长量优于固体培养,最有利于毛状根生物量和药用成分的积累,并筛选到桃叶珊瑚苷高产根系E_1.结论:可通过毛状根的培养来获得桃叶珊瑚苷药用成分.     

利用转录组分析款冬萜类化合物生物合成关键酶基因及表达特征

目的挖掘与款冬萜类化合物生物合成途径相关的关键酶基因。方法利用Illumina HiSeq2500测序平台对野生款冬花蕾和叶进行转录组测序,使用Trinity软件de novo从头组装,并通过基因功能注释、差异表达基因分析等生物信息学方法进行分析,挖掘款冬中萜类化合物生物合成途径相关的酶基因。结果转录组测序获得39 912 371条高质量reads(SRA号:SRR9113366,SRR9113367),组装获得91 118条Unigene,55 830条Unigene在NR、Swiss-Prot、GO、COG、KEGG等数据库得到注释。鉴定出参与款冬萜类化合物生物合成相关酶基因的129个Unigene,包括91个参与三萜骨架生物合成酶基因,32个萜类合成酶基因,6个细胞色素P450基因,其中差异表达基因25个,涉及上游MVA途径的4个差异基因在花蕾中表达量高于叶,MEP途径的5个差异基因在叶中表达高于花蕾,另外还有10个基因在叶中高表达,9个基因在花蕾中高表达。根据差异基因HMGR、TPS、AS、CYP450基因在花蕾中高表达,推测可能与花蕾中萜类物质含量高有关。结论从款冬转录组数据库中初步获得了可能参与萜类化合物生物合成途径的候选关键酶基因,为进一步阐明款冬萜类化合物生物合成的分子机制奠定基础。     

杜仲TIFY转录因子鉴定与表达分析

目的 从全基因组水平对杜仲（Eucommia ulmoides）TIFY基因家族进行鉴定与表达分析,以期为EuTIFYs基因功能深入研究奠定基础。方法 以杜仲基因组数据库为基础,通过美国国立生物技术信息中心（NCBI）,MEME,PlantCare,白质分析专家系统（ExPASy）及TBtools等生物信息学分析软件,对杜仲TIFY基因家族进行鉴定,系统分析该基因家族的理化性质、系统进化、基因结构、启动子顺式作用元件及其在叶片发育及杜仲胶形成中的表达模式。结果 该研究从杜仲基因组中共鉴定到14个EuTIFYs（EuTIFY1~EuTIFY14）,氨基酸数目介于102~357,理论等电点分布在4.99~10.06,相对分子质量区域为10.8~39.14 kDa,亚细胞定位预测在细胞核中,均为亲水性蛋白,14个EuTIFYs分布在13条染色体上。系统进化分为TIFY,JAZ,ZML和PPD 4个亚家族,分别包含3个,4个,5个和2个EuTIFYs蛋白。EuTIFYs启动子区域含有多种光周期及非生物胁迫响应元件,参与植物杜仲生长发育和非生物胁迫。表达模式分析显示,EuTIFYs在杜仲叶片不同发育时期存在表达差异,大部分基因在叶片发育的早期阶段表达量较高,正调控杜仲胶的形成,EuTIFYs蛋白间存在多种互作关系。结论 该研究从杜仲全基因组水平鉴定到14个EuTIFYs,对其结构特点和表达模式进行全面的生物信息学分析,为进一步研究杜仲TIFYs基因功能提供参考。