CaMK Ⅱ通过程序性细胞坏死通路加重H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤

目的 探讨钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMK Ⅱ)在H9c2心肌细胞缺氧/复氧(H/R)模型中的作用.方法 将H9c2心肌细胞分为4组:正常对照组(Control)、H/R组、CaMK Ⅱ抑制剂KN-93+ H/R组和KN-93组.H/R组是对H9c2心肌细胞进行缺氧4h,再复氧6h处理;后两组是先用KN-93(终浓度1μmol/L)预处理2h后再进行/不进行H/R损伤.采用MTT法检测各组细胞活力,碘化丙啶(PI)染色观察细胞坏死情况,Western blot法检测受体相互作用蛋白激酶(RIPK)3、磷酸化混合谱系蛋白激酶样结构域蛋白(pMLKL)和pCaMK Ⅱ蛋白的表达.结果 与Control组比较,H/R组细胞活力显著降低,PI阳性细胞数明显增多,RIPK3、pMLKL和pCaMK Ⅱ的表达水平显著增加(P＜0.01);与H/R组比较,KN-93+ H/R组细胞活力显著增加,PI阳性细胞数明显减少,RIPK3、pMLKL和pCaMKⅡ蛋白表达明显下调(P＜0.01);而KN-93组的各项指标与Control组相比无显著性差异(P＞0.05).结论 CaMK Ⅱ可通过程序性细胞坏死通路加重H9c2心肌细胞的H/R损伤.     

HBSP抑制缺氧复氧心肌H9C2细胞Omi/HtrA2胞内转位及细胞凋亡

目的探讨促红细胞生成素衍生肽(HBSP)对缺氧复氧心肌细胞Omi/Htr A2胞内转位及细胞凋亡的影响。方法将乳鼠心肌细胞(H9C2细胞)分为对照(Ctrl)组、缺氧复氧(H/R)组、HBSP组和EPO组。培养结束后MTS法检测细胞存活率,酶标仪检测细胞上清液中LDH释放率,Western blot检测细胞内cleaved caspase-3表达,TUNEL法检测心肌细胞凋亡;分离H9C2细胞胞质及线粒体,Western blot分别检测线粒体及细胞质Omi/Htr A2表达。结果与Ctrl组相比,H/R组细胞存活率下降(P0.05),LDH释放、cleaved caspase-3表达、心肌细胞凋亡及Omi/Htr A2胞内转位均明显上升(P0.05);与H/R组相比,EPO组的细胞存活率升高(P0.05),LDH释放降低、cleaved caspase-3表达减弱、心肌细胞凋亡减少、Omi/Htr A2线粒体转位明显减少(P0.05);随着HBSP浓度的增加,各组细胞存活率逐渐上升,LDH释放、cleaved caspase-3表达、心肌细胞凋亡及Omi/Htr A2胞内转位率逐渐下降(P0.05)。结论 HBSP具有与EPO类似的保护作用,可抑制经H/R诱导的心肌细胞凋亡,其机制可能是通过减少Omi/Htr A2蛋白的胞内转位,抑制caspases通路激活,进而发挥细胞保护作用。     

右美托咪定对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的 观察右美托咪定对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用。方法 H9C2心肌细胞随机分为三组:正常对照组（Control）、缺氧/复氧组（H/R）、Dex（5 μmol/L）干预H/R组。Dex干预H/R组先用Dex预处理6 h后,再经缺氧/复氧处理。采用倒置显微镜观察各组H9C2心肌细胞形态的变化,检测各组细胞培养基中LDH的含量,CCK-8法检测各组H9C2心肌细胞的存活率,试剂盒检测caspase-3活性,TUNEL法检测细胞凋亡并计算凋亡指数。结果 与Control组相比,H/R组细胞皱缩,大量死亡,细胞活力降低,培养基中LDH含量增加,caspase-3活性增加,细胞凋亡指数增加,统计学意义显著（P＜0.01）;Dex预处理可明显改善H/R处理后细胞形态,提高细胞活力,减少LDH含量和caspase-3活性,降低细胞凋亡指数,统计学意义显著（P＜0.01）。结论 Dex可通过减少H9C2心肌细胞缺氧/复氧引起的细胞凋亡减轻损伤。     

左卡尼汀通过抑制钙/钙调素依赖蛋白激酶Ⅱ信号通路抑制过氧化氢诱导的大鼠心肌细胞凋亡

 目的： 观察左卡尼汀对过氧化氢（H2O2）诱导的大鼠心肌细胞凋亡的保护作用及其机制。方法：利用200 μmol/L H2O2刺激12 h,建立体外原代培养新生乳鼠心肌细胞凋亡模型。Ca2+螯合剂1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N, N, N′, N′-四乙酸(BAPTA)、钙调素依赖蛋白激酶II (CaMKII)特异性抑制剂KN93及左卡尼汀分别于加入H2O2前30 min或1 h加入,以检测这3种药物对H2O2刺激下心肌细胞活力、细胞凋亡、细胞内静息钙浓度（［Ca2+］i）及磷酸化CaMKII (p-CaMKII)表达的影响。利用MTT比色法检测心肌细胞活力;流式细胞仪检测细胞凋亡率;利用激光共聚焦扫描检测［Ca2+］i;蛋白质免疫印迹法检测cleaved caspase-3及p-CaMKII的表达。结果：模型组经200 μmol/L H2O2作用12 h后,细胞活力显著下降,细胞凋亡率显著增加。BAPTA、KN93及左卡尼汀预处理显著抑制上述细胞损伤。进一步研究发现,H2O2 诱导的 ［Ca2+］i水平升高、cleaved caspase-3及p-CaMKII的表达增加均可被上述3种药物不同程度地抑制。结论：左卡尼汀可抑制H2O2所致的心肌细胞凋亡,该心肌保护作用可能与其抑制Ca2+/CaMKⅡ信号通路有关。     

抗衰老Klotho蛋白减轻大鼠乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤

目的:观察抗衰老Klotho蛋白对大鼠乳鼠原代心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤的作用并探讨其作用机制。方法:建立大鼠乳鼠心肌细胞H/R模型,并将心肌细胞分为正常对照组、H/R模型组和不同浓度(0.1μmol/L、1μmol/L和10μmol/L)Klotho作用H/R组。观察各组心肌细胞H/R前后搏动频率变化,利用MTT方法检测细胞存活率;测定各组心肌细胞H/R后LDH、CK、AST的漏出量及MDA含量、SOD活性;流式细胞术检测各组心肌细胞的凋亡率;real-time PCR检测各组心肌细胞中内质网应激标记及凋亡相关分子GRP78、CRT和CHOP和caspase-12 mRNA的表达情况;Western blot法检测心肌细胞内内质网应激凋亡蛋白CHOP和caspase-12蛋白表达及Akt磷酸化水平。结果:与正常对照组相比,H/R模型组中心肌细胞搏动频率和细胞存活率显著下降,细胞凋亡率显著升高(P0.05);LDH、CK、AST和MDA含量升高而SOD活性显著降低(P0.05);GRP78、CRT、CHOP和caspase-12 mRNA表达显著增高(P0.05);CHOP和caspase-12蛋白表达随之增高而Akt的磷酸化水平显著降低(P0.05)。与H/R模型组相比,抗衰老Klotho蛋白作用H/R心肌细胞后,心肌细胞搏动频率和细胞存活率显著升高,细胞凋亡率逐渐降低(P0.05),LDH、CK、AST和MDA含量下降而SOD活性显著增高(P0.05),GRP78、CRT、CHOP和caspase-12 mRNA的表达逐渐降低(P0.05),CHOP和caspase-12蛋白表达也随之降低,而Akt磷酸化水平显著增加(P0.05)。结论:抗衰老Klotho蛋白能够提升H/R损伤后心肌细胞的存活率,抑制细胞凋亡,通过抵抗氧化应激和过度内质网应激反应发挥作用,并与激活Akt磷酸化有关。     

转录因子ZFP580在缺氧预处理抗大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤中的作用

 目的：通过观察缺氧预处理对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用及锌指核转录因子ZFP580表达的改变,探讨ZFP580的作用及机制。方法：培养大鼠H9c2心肌细胞,分为3组：（1） 缺氧/复氧(H/R)组：H9c2心肌细胞换用模拟缺血溶液(pH=6.2)缺氧(95% N2 + 5% CO2)培养3 h,复氧培养2 h;（2） 缺氧预适应(HPC)组：H9c2心肌细胞经3个循环的短暂缺氧(10 min)/复氧(20 min)处理后,进行同上H/R实验;(3) 对照(C)组：正常培养的H9c2心肌细胞。通过MTT染色及LDH水平判定HPC的作用。Western blotting方法观察心肌细胞中转录因子ZFP580表达及ERK1/2磷酸化情况,以及ERK1/2磷酸化抑制剂PD98059对ZFP580表达的影响。分别构建高/低表达ZFP580的慢病毒载体并转染H9c2心肌细胞,经H/R实验后利用Annexin V-PE/7-AAD染色及流式细胞术检测H9c2细胞凋亡情况,Western bloting方法观察caspase-3活化情况。结果：HPC能显著改善H/R处理后H9c2心肌细胞存活率降低和LDH漏出的现象。Western blotting结果显示,HPC组心肌细胞中ZFP580表达及ERK1/2磷酸化程度较H/R处理组明显上升,且PD98059预处理明显抑制HPC诱导的ZFP580的表达上调。慢病毒介导的基因转染实验发现,ZFP580高表达的H9c2心肌细胞在H/R损伤后凋亡率降低且细胞中活化caspase-3表达下降。结论：HPC可引起心肌细胞中转录因子ZFP580表达上调,ZFP580作为ERK1/2通路的下游靶分子发挥抗心肌细胞凋亡的作用。ZFP580表达上调可能作为内源性保护机制之一介导了HPC的细胞保护作用。     

多巴胺受体2减轻离体大鼠心肌缺血/再灌注损伤

目的 观察多巴胺受体2(DR2)对离体大鼠心肌缺血/再灌注(I/R)损伤的影响及其可能机制.方法 将大鼠40只,每组n=10,随机分成对照组(control)、I/R组、10 pmol/L Bromocriptine(DR2激动剂)组(Bro),10 μmol/L Haloper-idol(DR2抑制剂)组(Hal).用Langendorff离体灌流装置,复制大鼠心肌I/R损伤模型.Powerlab生理记录仪记录心功能;比色法测定冠脉流出液LDH、CK活性和心肌组织匀浆SOD活性以及MDA含量;TUNEL染色检测心肌细胞凋亡;Western blot检测DR2、Bcl-2、caspase-3和caspase-9蛋白的表达.结果 与对照组比较,I/R组DR2、Bcl-2、caspase-3和cmpase-9蛋白表达、LDH和CK活性、MDA含量和细胞凋亡率均增加(P＜0.01),唯有SOD活性降低,心功能减弱(P＜0.01).与I/R组比较,Bro降低LDH和CK活性、MDA含量、细胞凋亡率、caspase-3和caspase-9的表达,升高SOD活性,改善心功能和进一步增加Bcl-2的表达(P ＜0.01);Hal对上述指标影响不显著.结论 DR2可减轻心肌I/R损伤,其机制与抗氧化、清除自由基、上调Bcl-2表达以及下调caspase-3和caspase-9的表达有关.     

成纤维细胞生长因子19改善缺氧/复氧心肌细胞H9c2损伤

目的:研究成纤维细胞生长因子19(FGF19)对缺氧/复氧心肌细胞H9c2损伤的改善作用。方法:将心肌细胞H9c2分为Control组(常规方法培养)、H/R组(细胞经缺氧/复氧处理)、NC+H/R组(细胞转染pcDNA 3.1后再经缺氧/复氧处理)和FGF19+H/R组(细胞转染pcDNA 3.1-FGF19后再经缺氧/复氧处理)。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白印迹(Western blot)检测各组FGF19 mRNA和蛋白表达水平,ELISA检测各组细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)含量和细胞中丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)、LDH、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平,流式细胞术测定各组细胞凋亡,Western blot检测各组细胞中活化的半胱天冬酶-3(C-Caspase-3)、活化的半胱天冬酶-9(C-Caspase-9)蛋白表达和胞浆中细胞色素C(Cyt C)蛋白水平,JC-1法检测各组细胞线粒体膜电位变化。结果:与H/R组和NC+H/R组比较,FGF19+H/R组心肌细胞中FGF19 mRNA和蛋白表达水平均显著升高(P均<0.01)。H/R组与NC+H/R组心肌细胞中FGF19 mRNA和蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。与Control组比较,H/R组细胞培养液中LDH水平升高(P<0.01),细胞中MDA和ROS水平升高(P<0.01),SOD、CAT和GSH-Px活力降低(P<0.01),细胞凋亡率、C-Caspase-3、C-Caspase-9和Cyt C蛋白水平升高(P<0.01),线粒体膜电位降低(P<0.01)。与NC+H/R组比较,FGF19+H/R组细胞培养液中LDH水平降低(P<0.01),细胞中MDA和ROS水平降低(P<0.01),SOD、CAT和GSH-Px活力升高(P<0.01),细胞凋亡率、C-Caspase-3、C-Caspase-9和Cyt C蛋白水平降低(P<0.01),线粒体膜电位升高(P<0.01)。结论:FGF19可能通过减少细胞凋亡和氧化损伤改善缺氧/复氧心肌细胞H9c2损伤。     

松香酸通过诱导自噬减轻AGEs诱导的心肌H9c2细胞凋亡和内质网应激反应

目的:本文旨在探索松香酸(abietic acid,AA)对晚期糖基化终末产物(advanced glycosylation end products,AGEs)诱导的心肌H9c2细胞凋亡和内质网应激的影响及其相关机制。方法:H9c2细胞分为5组:对照组加入生理盐水处理24 h;AGEs处理组加入AGEs(100 mg/L)处理24 h;AGEs+AA(10、25和50μmol/L)组同时加入AGEs(100 mg/L)和AA(10、25和50μmol/L)处理24 h。MTT法检测H9c2细胞活力。Western blot分析肌红蛋白(myoglobin,Mb)、肌酸激酶MB同工酶(creatine kinase MB isoenzyme,CK-MB)、心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,c Tn I)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)、cleaved caspase-12、GADD34、Bi P、LC3、P62和beclin 1的蛋白水平。ELISA检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性。流式细胞术分析细胞凋亡。结果:低浓度(低于50μmol/L)的松香酸对H9c2细胞活力无明显影响,高浓度(高于50μmol/L)的松香酸会降低H9c2细胞活力。AGEs组Mb、CK-MB和c Tn I蛋白表达及LDH的水平明显高于对照组(P0.05);与AGEs组相比,AGEs+AA(10、25和50μmol/L)组Mb、CK-MB和c Tn I的蛋白表达及LDH的表达水平明显降低(P0.05)。松香酸(10、25和50μmol/L)可抑制AGEs诱导的心肌细胞凋亡、CHOP和cleaved caspase-12蛋白水平的升高及GADD34和Bi P表达的降低(P0.05)。而且,松香酸(10、25和50μmol/L)可抑制AGEs诱导的心肌细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和beclin 1表达的降低及P62表达的升高(P0.05)。自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤可逆转松香酸对心肌细胞LC3、Mb、cleaved caspase-12和Bi P蛋白水平的影响(P0.05)。结论:松香酸通过诱导自噬减轻AGEs诱导的心肌H9c2细胞凋亡和内质网应激反应。     

Apelin-13通过PI3K/Akt信号通路抑制尼古丁诱导的H9c2细胞凋亡

目的:研究小分子活性肽apelin-13对尼古丁诱导的心肌细胞凋亡的作用,探讨其可能的调节机制。方法:建立尼古丁诱导的大鼠H9c2细胞凋亡模型,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot法检测凋亡相关蛋白的表达。结果:(1)与正常对照组相比,尼古丁组细胞凋亡率明显增加(P0.01),凋亡相关蛋白Bax和cleaved caspase-3的表达显著上调, Bcl-2、p-Akt、p-PI3K和APJ蛋白的表达显著下调(P0.01);(2)与尼古丁组相比,apelin-13+尼古丁组细胞的凋亡率明显降低(P0.01),Bax和cleaved caspase-3的表达显著降低(P0.01), Bcl-2、p-Akt、p-PI3K和APJ蛋白的表达显著升高(P0.01);(3)与apelin-13+尼古丁组相比,apelin-13+尼古丁+PI3K/Akt抑制剂LY294002组细胞凋亡率明显增加(P0.01),Bax和cleaved caspase-3的表达显著增加(P0.01), Bcl-2、p-Akt和p-PI3K蛋白的表达显著下调(P0.01)。结论:Apelin-13通过PI3K/Akt信号通路抑制尼古丁诱导的H9c2细胞凋亡。     

CaMK Ⅱ活性对H_2O_2所致SK-N-SH细胞氧化应激损伤的影响

目的:评价钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)活性对过氧化氢所致人源性神经母细胞瘤细胞氧化应激损伤的影响。方法:SK-N-SH细胞生长至对数期时,接种于96孔培养板或6孔培养板,采用随机数字表法,将其分为4组:正常对照组,培养基中添加H_2O_2组(H_2O_2组),培养基中只添加CaMKⅡ活性抑制剂KN93组(KN93组),培养基中同时添加H_2O_2和KN93组(H_2O_2+KN93组),倒置显微镜观察细胞形态学,采用CCK-8法测定细胞活力,采用Fura-2/AM荧光法检测细胞内Ca~(2+)浓度([Ca~(2+)]_i),采用免疫印迹测定CaMKⅡ和磷酸化CaMKⅡ的表达,采用RT-PCR法检测CaMK mRNA表达。结果:与正常对照组比较,H202组细胞体呈圆形的细胞和脱落细胞增加,细胞突起长度缩短,细胞存活率降低,[Ca~(2+)]_i升高,磷酸化CaMKⅡ表达上调,CaMKⅡmRNA表达下调。与H_2O_2组比较,H_2O_2+KN93组脱落细胞明显减少,突起变长,细胞存活率增加,[Ca~(2+)]_i降低,磷酸化CaMKⅡ表达下调,CaMKⅡmRNA表达水平上调。结论:CaMKⅡ增强了H_2O_2诱导的人源性神经母细胞瘤细胞氧化应激损伤。     

RIP3/CaMKⅡ信号通路对重症病毒性心肌炎小鼠心脏功能及生存曲线的影响

目的:观察RIP3/CaMKⅡ信号通路对柯萨奇病毒B3(CVB3)诱导的重症病毒性心肌炎小鼠心脏功能及生存曲线的影响,并探讨CaMKⅡ特异性抑制剂KN-93对心肌损伤的作用。方法:将60只雄性BALB/c小鼠分为正常对照组、CVB3组、CVB3+KN-93组和CVB3+KN-93+Ti(活性氧簇特异性抑制剂)组,以上小鼠腹腔及尾静脉注射药物连续7 d。采用双抗体夹心免疫法检测小鼠心肌细胞坏死标志物,心脏超声技术检测小鼠心脏结构和功能,绘制Kaplan-Meier生存曲线,观察KN-93对小鼠心肌的保护作用。结果:CVB3+KN-93组小鼠心肌细胞坏死较CVB3组显著减轻,心脏功能和生存曲线改善(P<0.01);CVB3+KN-93组小鼠心肌组织H2O2含量较CVB3组显著下降(P<0.01);加入Ti后,CVB3+KN-93+Ti组H2O2含量较CVB3+KN-93组轻度下降(P<0.05),但无论是心脏功能还是生存曲线均无显著差异。结论:RIP3/CaMKⅡ信号通路在CVB3诱导的急性重症病毒性心肌炎小鼠心肌细胞损伤中起到主导作用;KN-93能阻断这种作用并可能产生新的治疗方式,其效果可能是通过对CaMKⅡ的直接抑制和对活性氧簇的间接抑制而实现的。     

钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ抑制剂KN-93对兔心衰模型心室肌细胞晚钠电流的影响

目的:探讨异丙肾上腺素(isoproterenol,ISO)诱导兔心衰(heart failure,HF)时,兔心室肌细胞晚钠电流(late sodium current,I_(Na L))的变化及钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca~(2+)/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,Ca MKⅡ)抑制剂KN-93对I_(Na L)的影响。方法:经兔耳缘静脉注射ISO(300μg·kg~(-1)·d~(-1),连续15 d)诱导兔HF模型;1月后行心脏彩超检查和HE染色观察心肌形态改变来评价HF模型;Western blot分析Na_V1.5、Ca MKⅡδ和磷酸化Ca MKⅡδ的蛋白水平;经Langendorff装置灌注消化生理盐水(normal saline,NS)组和HF组的兔心室肌细胞,采用全细胞膜片钳技术记录I_(Na L)。结果:与NS组相比,HF组兔心率增加(P0.01),心室腔增大(P0.05),心功能明显降低(P0.01);心肌细胞排列紊乱,呈空泡样变性,细胞间质存在水肿,纤维组织增多。HF组的Na_V1.5、Ca MKⅡδ及磷酸化Ca MKⅡδ的蛋白水平与NS组相比均明显增加(P0.01)。HF组的I_(Na L)与NS组相比明显增加(P0.01);加入海葵毒素Ⅱ(sea anemone toxinⅡ,ATXⅡ)后,HF组及NS组I_(Na L)均明显增加,且HF组比NS组增加更明显(P0.01);在ATXⅡ诱导电流增加稳定后,加入KN-93,NS组及HF组中I_(Na L)均明显减少(P0.05)。结论:Ca MKⅡ抑制剂KN-93能抑制心衰增加的I_(Na L),这一作用可能与影响Ca MKⅡδ活性及Ca MKⅡδ参与I_(Na L)的调控有关。     

右美托咪定减轻氧化应激改善H9C2细胞缺氧/复氧损伤

目的 探讨右美托咪定减轻氧化应激改善H9C2细胞缺氧/复氧损伤的作用。方法 H9C2心肌细胞随机分为三组,正常对照组（Control）、缺氧/复氧组（H/R）、Dex（5 μmol/L）干预H/R组。Dex干预H/R组先用Dex预处理6 h后,再经缺氧/复氧处理。检测各组细胞培养基中LDH的含量,CCK-8法检测各组H9C2心肌细胞的存活率,试剂盒检测caspase-3活性,试剂盒检测MDA的含量和SOD活性。结果 与Control组相比,H/R组细胞活力降低,培养基中LDH含量增加,caspase-3活性增加,MDA含量升高而SOD活性降低,统计学意义显著（P＜0.01）;Dex预处理提高H/R处理后的细胞活力,减少LDH含量和caspase-3活性,降低MDA含量,增加SOD活性,统计学意义显著（P＜0.01）。结论 Dex可通过减轻氧化应激改善H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤。     

姜黄素对Aβ_(25-35)诱导的PC12细胞caspase-3、caspase-8和caspase-9表达的影响

目的:探讨姜黄素对β淀粉样蛋白25-35(Aβ_(25-35))诱导的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞存活率、乳酸脱氢酶(LDH)释放率及凋亡的影响。方法:以Aβ_(25-35)作用于PC12细胞,分别采用MTT法和LDH试剂盒检测细胞的存活率和LDH释放率;实验随机分为空白对照组、模型组、姜黄素10μmol/L组和姜黄素20μmol/L组,采用流式细胞术及Annexin V-FITC/PI双染法检测凋亡情况,采用比色法和Western blot法检测凋亡相关蛋白胱天蛋白酶(caspase)-3、caspase-8和caspase-9的活性和表达。结果:与模型组比较,姜黄素可显著升高Aβ_(25-35)诱导的PC12细胞存活率,降低LDH释放率和凋亡率(P0.01);同时可显著降低caspase-3、caspase-8和caspase-9的活性和表达(P0.05或P0.01)。结论:姜黄素可显著抑制caspase-3、caspase-8和caspase-9的表达,从而抑制Aβ_(25-35)诱导的PC12细胞凋亡。     

蜕皮甾酮减轻心肌细胞氧化应激损伤

目的:研究蜕皮甾酮对心肌细胞氧化损伤的作用。方法:H9c2细胞常规培养,经过氧化氢(H_2O_2)处理后建立损伤模型,分为:对照组,蜕皮甾酮高剂量(2μmol/L)、中剂量(1.5μmol/L)和低剂量(1μmol/L)组,H_2O_2组。CCK-8法检测蜕皮甾酮对H9c2细胞活力的影响;流式细胞术检测H9c2细胞的凋亡率;用分光光度法检测乳酸脱氢酶、肌酸激酶同工酶的活性以及丙二醛、超氧化物歧化酶含量;激光共聚焦联合流式细胞术观察细胞内活性氧簇(ROS)的产生和线粒体膜电位的变化;用Western blot法检测H9c2细胞内Bax、Bcl-2和cleaved caspase-3的蛋白水平。结果:在所选浓度范围内,蜕皮甾酮对H9c2细胞的活力无明显影响。与对照组比较,H_2O_2组H9c2细胞的LDH、CK-MB、ROS、MDA及凋亡率明显增加,通过不同浓度的蜕皮甾酮作用后,H9c2细胞的LDH、CK-MB、ROS、MDA及凋亡率显著下降,与H_2O_2组比较差异有统计学显著性。与对照组比较,H_2O_2组H9c2细胞的SOD和线粒体膜电位明显下降;与H_2O_2组比较,蜕皮甾酮高、中、低剂量组H9c2细胞的SOD和线粒体膜电位明显提高。对比对照组,H_2O_2组中H9c2细胞Bax和cleaved caspase-3的蛋白水平明显升高,Bcl-2的表达水平明显下降;与H_2O_2组比较,蜕皮甾酮高、中、低剂量组中H9c2心肌细胞表达Bcl-2蛋白上升,Bax和cleaved caspase-3的蛋白水平下降。结论:蜕皮甾酮对氧化应激条件下的H9c2细胞具有保护功能,其机制可能和减少氧化应激产物,增强抗氧化酶功能,调节线粒体功能和抑制细胞凋亡相关。     

miR-25对缺氧/复氧诱导的H9c2细胞凋亡的作用

目的:探讨微小RNA-25(miR-25)在缺氧/复氧诱导的H9c2细胞凋亡过程中的作用及机制。方法:构建miR-25高表达H9c2细胞系,行缺氧/复氧损伤处理,real-time PCR检测miR-25及高迁移率族蛋白B1(HMGB1)mRNA的表达,Western blot检测HMGB1及细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和cleaved caspase-3的蛋白表达水平,流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期的变化,明确miR-25的高表达对缺氧/复氧所诱导的H9c2细胞凋亡及HMGB1表达的影响。然后通过双萤光素酶报告基因验证miR-25与HMGB1的靶向关系,并构建转染HMGB1 shRNA的H9c2稳定细胞系,行缺氧/复氧损伤处理,验证HMGB1是否参与缺氧/复氧诱导的H9c2细胞凋亡的调控。结果:与对照组相比,高表达miR-25组的H9c2细胞在缺氧/复氧诱导后HMGB1表达下调,Bcl-2表达上调,cleaved caspase-3蛋白水平下调,流式细胞术提示处于S期的细胞增多,G1期减少(P0.01)。双萤光素报告基因显示,转染miR-25 mimic+野生型HMGB1-3’UTR报告基因载体组萤光素酶活性明显下降;转染miR-25 inhibitor+野生型HMGB1-3’UTR和转染miR-25 mimic+突变型HMGB1-3’UTR报告基因载体组萤光素酶活性没有变化。转染HMGB1-shRNA的H9c2细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表达上调,凋亡蛋白cleaved caspase-3蛋白水平下调,流式细胞术分析提示细胞凋亡减少,处于S期的细胞增多,G1期减少(P0.05)。结论:miR-25减少缺氧/复氧诱导的H9c2细胞凋亡,期作用机制可能与靶向调控HMGB1表达有关。     

京尼平抑制高糖诱导的大鼠心肌H9c2细胞氧化应激及凋亡损伤

目的:探讨京尼平(genipin,GEN)对高糖损伤的大鼠心肌H9c2细胞的抗氧化作用和抑制细胞凋亡的机制。方法:体外培养大鼠心肌H9c2细胞,高浓度(50 mmol/L)葡萄糖处理H9c2细胞建立细胞损伤模型,分为正常糖对照组(NC组,葡萄糖浓度为5.6 mmol/L)、高糖损伤组(HG组,葡萄糖浓度为50 mmol/L)、正常糖+京尼平组(NC+GEN组)和高糖+京尼平组(HG+GEN组,京尼平浓度为10μmol/L)。CCK-8法检测细胞活力;酶标法和WST-1法分别测定细胞内丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性;微板法检测细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性;荧光探针DCF检测细胞内活性氧簇(ROS)水平;ELISA法检测核小体片段的聚集值;线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测细胞内线粒体膜电位变化;利用Western blot法检测线粒体内抗氧化酶锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD),以及早期凋亡蛋白细胞色素C(Cyt C)、Bax和cleaved caspase-3的蛋白水平。结果:与HG组比较,HG+GEN组细胞活力显著升高(P 0.05),细胞内MDA的含量及细胞上清液中LDH的活性明显降低(P 0.05),细胞内SOD活性升高(P 0.05),细胞内线粒体膜电位明显升高(P 0.05),ROS水平降低(P 0.05),核小体片段聚集程度显著降低(P 0.05)。HG组线粒体内抗氧化酶Mn-SOD比NC组降低(P 0.05),但线粒体内凋亡蛋白Cyt C、Bax和cleaved caspase-3的蛋白水平比NC组显著升高(P 0.05),而HG+GEN组与HG组相比,Mn-SOD升高(P 0.05),Cyt C、Bax和cleaved caspase-3的蛋白水平显著降低(P 0.05)。结论:京尼平对高糖损伤的心肌H9c2细胞具有抗氧化保护作用和抑制细胞凋亡的作用。