SIRT1/eNOS/NO通路在人参皂苷Rb1抗内皮细胞复制性衰老中的作用

目的:观察人参皂苷Rb1延缓人脐静脉内皮细胞(HUVECs)复制性衰老的作用,并探讨SIRT1/e NOS/NO通路在其中的作用机制。方法:建立原代HUVECs复制性衰老模型,根据细胞形态的变化、衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色阳性率和纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)的表达水平评估HUVECs衰老情况;采用real-time PCR方法和Western blot法检测沉默SIRT1前后衰老细胞中e NOS和PAI-1的mRNA和蛋白表达,并检测细胞上清NO的含量。结果:累积细胞群体倍增水平(CPDL)为16的HUVECs可作为复制性衰老模型; 80μmol/L人参皂苷Rb1处理后衰老细胞内SIRT1和eNOS的mRNA及蛋白表达水平增加,NO含量增加(P 0. 05),而PAI-1的mRNA和蛋白表达水平下降(P 0. 05);沉默SIRT1后,衰老细胞内e NOS的mRNA及蛋白表达减少,PAI-1的mRNA及蛋白表达增加,NO含量减少(P 0. 05);与SIRT1沉默组比较,在沉默SIRT1基础上加用人参皂苷Rb1后,e NOS和PAI-1表达水平及NO的含量未见明显变化。结论:人参皂苷Rb1可通过调控SIRT1/e NOS/NO通路延缓HUVECs复制性衰老。     

硫化氢通过抑制蛋白激酶B过度磷酸化延缓内皮细胞衰老

目的:探讨外源性硫化氢对过氧化氢诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)衰老的作用及可能机制。方法:建立过氧化氢诱导的HUVECs早熟型衰老模型,Western blot检测相关参数验证硫化氢对衰老的作用。结果:HUVECs经60μmol/L过氧化氢处理后,衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色阳性细胞比例增加,血浆纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)表达明显增高,蛋白激酶B磷酸化水平升高;与过氧化氢组比较,100μmol/L硫氢化钠(硫化氢供体)处理组SA-β-Gal染色阳性细胞比例及PAI-1蛋白表达显著下降,蛋白激酶B磷酸化水平降低;同样,与过氧化氢组比较,30μmol/L LY294002(蛋白激酶B抑制剂)处理组,SA-β-Gal染色阳性细胞比例表达显著下降。结论:硫化氢通过抑制蛋白激酶B的过度磷酸化而延缓过氧化氢诱导的HUVECs衰老。     

硫化氢通过抑制氧化应激改善高糖诱导的内皮细胞衰老

目的:探讨外源性硫化氢对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)衰老的作用及机制。方法:建立高糖(33 mmol/L葡萄糖)诱导的HUVECs早熟型衰老模型,观察硫化氢对衰老的作用及其相关的分子机制。结果:HUVECs经高糖处理后,细胞生长缓慢,衰老相关β半乳糖苷酶染色(SA-β-Gal)阳性细胞数目增加,血浆纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)表达明显增高,超氧化物歧化酶1(SOD1)显著减少,丙二醛(MDA)产量明显增多,核因子κB p65(NF-κB p65)活性增加;与模型组比较,100μmol/L和200μmol/L硫氢化钠(硫化氢供体)处理组的细胞数目明显增加,SA-β-Gal染色阳性细胞数目及PAI-1蛋白表达显著下降,SOD1表达明显增加,MDA产量明显减少,NF-κB p65活性降低。结论:硫化氢能通过抑制氧化应激反应和NF-κB p65活性而抵抗高糖诱导的HUVECs衰老。     

Rb1延缓人脐静脉内皮细胞早熟性衰老与caveolin-1表达的关系

目的:血管内皮细胞衰老是动脉粥样硬化发生的病理生理机制之一。本研究旨在探讨人参皂苷Rb1延缓人脐静脉内皮细胞(HUVECs)早熟性衰老与窖蛋白1(caveolin-1)表达的关系,为延缓HUVECs衰老提供新的靶点。方法:建立60μmol/L过氧化氢(H_2O_2)诱导的HUVECs早熟性衰老模型,根据细胞形态学的变化、衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色阳性率和细胞周期评估内皮细胞衰老,采用Western blot和激光共聚焦显微成像的方法检测caveolin-1的变化,观察人参皂苷Rb1对HUVECs衰老的作用及其相关的分子机制。结果:60μmol/L H_2O_2可成功地诱导内皮细胞衰老,早熟性衰老的HUVECs体积变大,SA-β-Gal活性明显增加,细胞发生G_1期阻滞,细胞增殖受抑制,caveolin-1表达增多。与H_2O_2处理组相比,人参皂苷Rb1预处理延缓HUVECs早熟性衰老,SA-β-Gal染色阳性细胞百分比降低,G_0/G_1期细胞比例下降,caveolin-1表达减少。结论:人参皂苷Rb1可通过抑制caveolin-1的表达延缓H_2O_2诱导的HUVECs早熟性衰老。     

不同浓度雌二醇对过氧化氢诱导的人脐静脉内皮细胞衰老模型的影响

目的探究不同浓度的17β-雌二醇(17β-Estradiol,17β-E_2)对过氧化氢(hydrogen peroxide,H_2O_2)诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)衰老模型的影响。方法构建HUVECs衰老模型后将细胞分为空白组,衰老组,17β-E_2阴性对照组,低浓度、生理浓度及高浓度17β-E_2组,CCK-8检测细胞活力;Western blot检测细胞衰老程度相关蛋白p-Rb、Rb、细胞自噬水平相关蛋白P6_2、LC3B以及衰老相关β半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色。结果与空白组相比,衰老组p-Rb/Rb比值增加,细胞活力下降,SA-β-Gal染色阳性细胞数目多,与衰老组比较,高浓度和生理浓度17β-E_2组p-Rb/Rb比值降低,SA-β-Gal染色阳性细胞数减少,P6_2表达量减少,LC3-Ⅱ/LC3-I蛋白表达升高,细胞活力增加。结论 17β-E_2能通过上调自噬减轻H_2O_2诱导的HUVECs衰老,且与其浓度有关。     

雷帕霉素对过氧化氢诱导血管内皮细胞衰老的干预研究

目的:探讨雷帕霉素(Rapa)对过氧化氢(H_2O_2)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)衰老的影响及其可能的机制。方法:把HUVECs分为空白组、衰老组(H_2O_2诱导)、Rapa+H_2O_2组和3-甲基腺嘌呤(3-MA)+H_2O_2组。噻唑蓝(MTT)比色法检测各组细胞活力;衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测细胞衰老情况;透射电子显微镜观察细胞超微结构改变;Western blot检测Rb、磷酸化Rb(p-Rb)、p21、LC-3II和beclin-1的表达变化。结果:与空白组相比,衰老组细胞活力下降,SA-β-Gal染色阳性率增高,细胞结构紊乱,并伴有衰老蛋白表达显著增加(P0.01);与衰老组相比,Rapa+H_2O_2组细胞活力增强,细胞衰老染色减少,p-Rb和p21表达显著减少(P0.05),电镜下细胞结构趋于正常,并可见自噬小体,beclin-1和LC3-II表达显著增多(P0.01);与衰老组相比,给予自噬抑制剂3-MA的细胞则表现为细胞活力进一步下降,SA-β-Gal染色阳性率进一步增高,p-Rb和p21表达增多,细胞结构破坏明显,beclin-1和LC3-II几乎不表达(P0.05)。结论:Rapa可延缓H_2O_2诱导的血管内皮细胞衰老,这种抗衰老作用可能与促进自噬有关。     

硫化氢对老年小鼠主动脉内皮衰老的影响北大核心CSCD

目的:探讨外源性硫化氢对老年小鼠主动脉内皮衰老的影响及可能机制。方法:8只3月龄雌性C57BL/6小鼠为对照组,16只22月龄雌性老年小鼠随机分为模型组和实验组,分别腹腔注射NaHS或生理盐水处理6周,检测相应指标,验证硫化氢对老年小鼠炎症、氧化应激及主动脉内皮衰老的作用。结果:与对照组相比,模型组小鼠体内细胞黏附分子-1(ICAM-1)和丙二醛(MDA)表达显著增加,超氧化物歧化酶1(SOD1)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和一氧化氮(NO)表达明显减少,衰老相关标志物纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)表达和衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色比例明显升高。给予NaHS处理后,前述指标均得到一定程度逆转。结论:硫化氢可能通过抑制老年小鼠体内炎症反应和氧化应激改善主动脉内皮衰老。     

人参皂苷Rg1诱导人白血病K562细胞复制性衰老的机制

目的 探讨人参皂苷Rg1(Rg1)诱导人白血病K562细胞复制性衰老特征性变化.方法 四甲基偶氮唑盐(MTT)法筛选Rg1对K562细胞增殖抑制的最佳浓度及时间,以此浓度和作用时间诱导K562细胞衰老.流式细胞术检测Rg1对细胞增殖周期的影响;衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测阳性细胞百分率;Southern blotting检测端粒长度;Western blotting检测复制性衰老信号通路相关P21、P53与Rb蛋白表达;透射电镜观察人白血病K562细胞衰老超微形态学改变.结果 Rg1在体外能明显抑制K562细胞增殖,其最佳作用浓度为20 μmol/L,时间为48h;诱导后的K562细胞阻滞于G2/M期;SA-β-Gal染色阳性细胞百分率增加(P<0.05);复制性衰老通路相关蛋白P21、P53和Rb表达上调(P<0.05);端粒长度缩短加速(P<0.05);经诱导细胞呈现胞体增大,溶酶体体积增大、数目增多,线粒体体积增大等衰老形态学变化.结论 Rg1可能经由p53-p21-Rb信号通路诱导K562细胞呈现复制性衰老特征.     

过表达Sirt3通过Keap1/Nrf2通路调控高糖应激诱导的肾小管上皮细胞衰老

目的：本研究拟观察过表达沉默信息调节因子3(silent information regulator 3, Sirt3)对高糖（high glucose, HG）诱导的肾小管上皮细胞应激性衰老的影响，并进一步探究过表达Sirt3对Kelch样ECH关联蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1, Keap1)/核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2)通路活性的影响，探讨其可能的作用机制。方法：本研究以HK-2细胞为模型，应用质粒转染过表达Sirt3，采用ML385(Nrf2特异性抑制剂)阻断Keap1/Nrf2通路，按照预定细胞分组给予不同刺激，Western blot法检测Sirt3、Keap1、Nrf2、衰老相关蛋白P16和P21蛋白的表达，DCHF-DA标记法检测细胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS）的积聚，衰老相关β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase, SA-β-Gal）染色法检测细胞衰老状况...     

人参皂苷Rg1诱导白血病K562细胞衰老

 摘要:目的 探讨人参皂苷Rg1(Rg1)诱导白血病K562细胞衰老及其机制。方法 MTT比色法筛选细胞增殖抑制的最佳浓度及时间,并以此浓度和作用时间进行细胞衰老的相关机理研究。流式细胞术检测细胞增殖周期; SA-β-Gal染色检测阳性细胞;Colony-Assay检测集落形成能力;Southern blotting检测端粒长度;Western blotting检测蛋白表达;透射电镜观察细胞超微形态。结果Rg1在体外能明显抑制K562细胞增殖,使K562细胞阻滞于G2/M期;并显著提高SA-β-Gal染色阳性细胞百分率（P＜0.05）;降低细胞形成集落的能力;衰老相关蛋白P53、P21、P16、RB表达上调（P＜0.05）;端粒长度缩短（P＜0.05）;胞体增大,溶酶体体积增大、数目增多,线粒体体积增大,异染色质凝集等衰老形态学变化。结论 Rg1可能经由P53-P21-Rb、P16-Rb信号通路诱导K562细胞衰老。     

外源性硫化氢通过抑制JAK/STAT通路对抗高糖引起的人脐静脉内皮细胞损伤

目的:研究外源性硫化氢(H_2S)能否通过调控Janus激酶/信号转导及转录激活因子(JAK/STAT)通路对抗高糖诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤。方法:Western blot法测定JAK2、STAT3、cleaved caspase-3的蛋白水平;CCK-8法检测细胞存活率;罗丹明123染色荧光显微镜照相法检测线粒体膜电位(MMP);双氯荧光素(DCFH-DA)染色荧光显微镜照相法测定胞内活性氧(ROS)水平;超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒检测SOD活性。结果:应用400μmol/L硫氢化钠(NaHS,为H_2S的供体)预处理HUVECs 30 min能明显地抑制高糖(40mmol/L葡萄糖,HG)对p-JAK2和p-STAT3蛋白水平的上调作用。400μmol/L NaHS预处理30 min或20μmol/L JAK/STAT通路抑制剂AG490预处理30 min均能抑制高糖对HUVECs引起的损伤,使细胞存活率和SOD活性升高,cleaved caspase-3蛋白水平、ROS生成量及MMP丢失均减少。结论:外源性的H_2S通过抑制JAK/STAT通路保护HUVECs对抗高糖引起的损伤。     

硫化氢通过抑制坏死性凋亡对抗高糖引起的H9c2心肌细胞损伤

 目的: 探讨硫化氢(hydrogen sulfide,H₂S)能否通过调控坏死性凋亡(necroptosis)对抗高糖(HG)引起的H9c2心肌细胞损伤。方法: 应用Western blot法检测心肌细胞内能反映坏死性凋亡的RIP3蛋白和cleaved caspase-3蛋白的水平;细胞计数盒测定心肌细胞存活率;双氯荧光素染色荧光显微镜照相法检测细胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)水平;罗丹明123染色荧光显微镜照相法测定线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP);Hoechst 33258核染色荧光显微镜照相法测定凋亡细胞的数量。结果: 应用HG(35 mmol/L葡萄糖)处理H9c2心肌细胞3 h、6 h、9 h、12 h和24 h均能明显地上调RIP3蛋白的表达水平,其中24 h时RIP3蛋白水平增加最明显。400μmol/L硫氢化钠(NaHS;为H₂S的供体)预处理或坏死性凋亡的特异性阻断剂necrostatin-1(Nec-1;100μmol/L)共处理心肌细胞均能明显地抑制HG对RIP3蛋白表达的上调作用。此外,NaHS预处理或Nec-1共处理心肌细胞均显著地抑制HG引起的心肌细胞损伤,使细胞存活率升高,ROS生成及MMP丢失减少。另一方面,400μmol/L NaHS预处理心肌细胞能使凋亡细胞数量及cleaved caspase-3表达明显减少。结论: H₂S可通过抑制坏死性凋亡保护心肌细胞,对抗高糖引起的损伤。     

ATP敏感性钾通道在硫化氢抑制高糖引起的心肌细胞损伤中的作用

目的:研究ATP敏感性钾通道(KATP通道)在硫化氢(H2S)抑制高糖引起心肌损伤中的作用。方法:应用Western blot法检测心肌细胞KATP通道蛋白的表达水平;CCK-8试剂盒测定心肌细胞存活率;Hoechst33258染色测定凋亡细胞数量的变化;JC-1染色法测定线粒体膜电位(MMP)。结果:应用高糖(35 mmol/L葡萄糖)处理H9c2细胞1~24 h,其中6 h、9 h、12 h和24 h均能明显下调KATP通道蛋白的水平,12 h和24 h KATP水平降至最低。在HG处理心肌细胞12 h前,应用400μmol/L硫氢化钠(Na HS,为H2S的供体)预处理30 min明显抑制高糖对KATP通道蛋白表达的下调作用。100μmol/L线粒体KATP通道开放剂二氮嗪和50μmol/L非选择性KATP通道开放剂吡拉地尔(Pin)及Na HS预处理均显著抑制高糖引起的心肌细胞损伤,使细胞存活率升高,凋亡细胞数量及MMP丢失减少。相反,100μmol/L线粒体KATP通道阻断剂5-羟基癸酸和1 mmol/L非选择性KATP通道阻断剂格列本脲均能明显阻断上述Na HS的心肌细胞保护作用。结论:KATP通道介导了H2S对高糖引起的心肌细胞损伤的抑制作用。     

外源性硫化氢对肝细胞NLRP3炎症小体的影响

目的:研究外源性硫化氢(H_2S)对人肝细胞NLRP3炎症小体的影响。方法:采用不同浓度的脂多糖(LPS)诱导人肝细胞L02和SMMC-7721建立炎症模型,Western blot检测细胞中NLRP3炎症小体的表达并结合细胞毒性实验(MTT法)确定合适的LPS浓度。细胞分为4组:对照组用普通培养基培养18.5 h;LPS组用普通培养基培养0.5 h后,再用100μg/L LPS刺激18 h;LPS+H_2S组和H_2S组用200μmol/L硫氢化钠(Na HS)刺激0.5 h后,再分别用100μg/L LPS和普通培养基培养18 h。各组处理后分别收集细胞,Western blot检测细胞中NLRP3和caspase-1的蛋白表达量。结果:与对照组相比,LPS组细胞内NLRP3和caspase-1的表达增加(P0.05),H_2S组细胞内的NLRP3和caspase-1表达无明显变化;与LPS组相比,LPS+H_2S组细胞内的NLRP3和caspase-1表达减少(P0.05)。结论:外源性H_2S可抑制人肝细胞中NLRP3炎症小体的表达。     

ATP敏感性钾通道在硫化氢抑制坏死性凋亡介导的高糖致H9c2心肌细胞炎症中的作用

目的:探讨ATP敏感性钾通道(K_ATP通道)在硫化氢(H2S)抑制坏死性凋亡介导的高糖(HG)致H9c2心肌细胞炎症中的作用。方法:应用Western blot法测定受体相互作用蛋白3(RIP3)和环氧化酶-2(COX-2)的表达水平;ELISA检测细胞培养液中白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平。结果:H9c2心肌细胞经HG(35 mmol/L葡萄糖)处理24 h,其RIP3的表达水平明显升高,100μmol/L K_ATP通道开放剂二氮嗪(DZ)和400μmol/L H_2S的供体硫氢化钠(Na HS)预处理心肌细胞30 min均可抑制HG对RIP3表达的上调;100μmol/L K_ATP通道阻断剂5-羟基癸酸(5-HD)预处理心肌细胞30 min可阻断Na HS对HG上调RIP3表达的抑制作用。另一方面,100μmol/L坏死性凋亡的特异性抑制剂necrostatin-1共处理或100μmol/L DZ、400μmol/L Na HS预处理心肌细胞均能抑制高糖引起的心肌细胞炎症,使COX-2表达及IL-1β和TNF-α的分泌水平均减少;而100μmol/L 5-HD能明显拮抗Na HS的上述抗炎症反应作用。结论:K_ATP通道在H_2S抑制坏死性凋亡介导的高糖致心肌细胞炎症反应中发挥重要的作用。     

抗衰老Klotho蛋白对高糖作用下血管内皮细胞的保护作用

目的:研究抗衰老Klotho蛋白对高糖作用下血管内皮细胞的保护作用及其作用机制。方法:体外培养人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs),设置PBS对照组、5.5 mmol/L葡萄糖组、33.3 mmol/L葡萄糖组、0.1μmol/L Klotho+33.3 mmol/L葡萄糖组、1μmol/L Klotho+33.3 mmol/L葡萄糖组和10μmol/L Klotho+33.3 mmol/L葡萄糖组。使用MTT法检测各组细胞活力;同时检测各组细胞培养上清中丙二醛(MDA)的含量以及乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)和还原型谷胱甘肽(GSH)的活性;流式细胞术检测各组细胞中活性氧(ROS)含量变化;ELISA检测各组细胞培养液中一氧化氮(NO)、内皮素1(ET-1)和细胞间黏附分子1(ICAM-1)的浓度变化;Western blot法检测各组细胞中核因子κB(NF-κB)蛋白的表达。结果:与PBS对照组相比,33.3 mmol/L葡萄糖能够显著降低HUVECs的细胞活力,增加细胞中ROS的含量,增加细胞培养上清中LDH活性和MDA含量,降低SOD和GSH的活性,同时降低NO分泌,诱导ET-1、ICAM-1分泌及细胞中NF-κB蛋白的表达(P0.05)。不同浓度Klotho蛋白和33.3 mmol/L高糖同时作用HUVECs时,细胞活力逐渐上升,ROS和MDA含量以及LDH活性逐渐下降,SOD和GSH活性则逐渐上升,同时NO分泌增加,ET-1、ICAM-1分泌及NF-κB蛋白表达显著下降(P0.05)。结论:抗衰老Klotho蛋白能够提升高糖作用下HUVECs的细胞活力,减少高糖诱导的ROS生成及氧化损伤,恢复HUVECs的正常分泌功能,并通过减少NF-κB蛋白表达发挥抗损伤作用。