基于妊娠期应用中药安全性评价体系探讨黄芩的胚胎毒性

[目的] 利用妊娠期应用中药安全性评价体系,应用胚胎干细胞实验(EST)方法,通过对中药-含药血清-胚胎蓄积组分的综合评价,揭示黄芩的胚胎毒性,验证妊娠期应用中药安全性评价体系的客观性.[方法]分别将胚胎干细胞D3系(ES-D3)和胚胎成纤维细胞(Balb/c 3T3)在不同浓度黄芩培养液和20%黄芩含药血清培养液中培养,噻唑蓝(MTT)法检测细胞活性,绘制细胞生长曲线,分别计算50%的ES细胞和3T3细胞增殖受抑制的黄芩浓度,即IC₅₀D3和IC₅₀3T3.利用悬滴-悬浮-贴壁方法,体外培养ES细胞向心肌细胞分化,实时定量PCR(Q-PCR)方法检测肌球蛋白重链基因(β-MHC)的表达量,计算50%的ES细胞分化受抑制的黄芩浓度,即ID₅₀D3.利用生物统计公式,预测黄芩及其含药血清的胚胎毒性.[结果]黄芩的IC₅₀D3?IC₅₀3T3?ID₅₀D3分别为25.58?42.20?0.28 μg/mL,预测其具有强胚胎毒性.低?高剂量黄芩含药血清对3T3细胞和ES细胞增殖均呈现抑制作用,ES细胞分化为心肌细胞β-MHC表达量为空白血清表达量的32.5%.[结论]黄芩存在胚胎毒性,应用中药-含药血清的综合评价方法,能够客观准确评价中药的胚胎毒性.     

淫羊藿苷诱导小鼠胚胎干细胞体外定向分化为心肌细胞方法学研究

 目的采用药物淫羊藿苷(icariin,ICA)改变小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)体外培养的微环境,建立一种药物介导提高ES细胞体外定向心肌细胞分化率的实验体系。方法采用悬滴培养法,构建ICA诱导ES细胞体外定向分化为心肌细胞的实验评价体系;并利用RT-PCR法和免疫荧光法鉴定心肌细胞。结果ICA在10^-7mol·L^-1浓度时,对ES细胞定向分化为心肌细胞呈现最佳诱导效应,分化率最高达84%(P<0.001)。ES细胞源心肌细胞表达心肌特异性基因肌球蛋白重链(α-MHC)和心室肌球蛋白轻链(MLC-2v),且心肌特异性肌小节α辅肌动蛋白(α-actinin)和肌钙蛋白T(troponin T)呈阳性表达。结论悬滴培养法结合药物改善微环境,可用于药物诱导ES细胞定向分化心肌细胞的实验体系。     

小半夏加茯苓汤含药血清对小鼠胚胎干细胞体外增殖及分化的影响

[目的]研究小半夏加茯苓汤含药血清对体外培养的小鼠胚胎干细胞(ES)增殖及分化的影响.[方法]噻唑蓝比色法(MTT)检测小半夏加茯苓汤含药血清作用下24、48、72、96 h后的ES细胞活性.半定量逆转录-聚合酶链反应法( RT-PCR)检测小半夏加茯苓汤含药血清作用下ES分化为心肌细胞的能力,判断受试物的胚胎发育毒性.[结果]在促细胞增殖方面:小半夏加茯苓汤含药血清作用下的ES细胞,在连续培养24、48、72、96 h时,其活性水平均呈显著上升趋势,与其他组比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).在促细胞分化方面:小半夏加茯苓汤含药血清对ES分化心肌细胞的肌球蛋白重链基因β-MHC的表达能力,与其他组比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).[结论]小半夏加茯苓汤含药血清能够促进ES细胞增殖,并能促进ES细胞向心肌细胞分化,提示在该实验剂量下,小半夏加茯苓汤无明显胚胎毒性.     

铁皮石斛多糖对小鼠胚胎干细胞生长的影响

目的研究铁皮石斛多糖对小鼠胚胎干细胞生长的影响。方法采用水提醇沉法对铁皮石斛进行初步提取,体外培养小鼠胚胎干细胞,通过克隆形成率试验、MTT试验及实时定量PCR的方法研究铁皮石斛提取多糖对小鼠胚胎干细胞的增殖及多能性维持的作用。结果铁皮石斛多糖处理组细胞(50~200μg/m L)的克隆形成率、MTT吸光度值均高于空白对照组,同时其干性相关基因的表达量与对照组相比无显著差异。结论铁皮石斛多糖可以显著促进小鼠胚胎干细胞的增殖、提高其克隆形成率,同时又不影响其多潜能性的维持。     

中药胚胎毒性在体外实验中的研究进展

中药在妊娠期运用广泛,但中药的妊娠毒性和胚胎毒性历来争议较大,体外替代实验是近年来逐渐发展和建立起来的研究药物胚胎和发育毒性的新方法,该文分别从胚胎干细胞实验(EST)、动物胚胎肢芽体外培养、全胚胎培养(WEC)技术在中药胚胎毒性研究中的应用进行综述。     

牵正散水煎剂对PSI诱导的体外帕金森病模型的影响

目的:建立PC12细胞帕金森病模型;探讨牵正散水煎剂对PSI诱导PC12细胞的体外帕金森病模型的增殖的影响。方法:利用MTT法检测牵正散水煎剂对PC12细胞的细胞毒性作用;采用DAPI染色及伊红染色相结合的方法,利用倒置荧光显微镜观察确定PSI诱导PC12细胞形成的帕金森病细胞模型的合适剂量;利用HE染色观察PSI诱导PC12细胞的体外帕金森病模型的嗜酸性小体;利用MTT法确定牵正散水煎剂对PSI诱导PC12细胞的体外帕金森病模型增殖的影响。结果:MTT法测定牵正散水煎剂对PC12细胞的毒性作用,计算得到IC_0,IC_(25)及IC_(50),分别为3.038 6 mg/mL、8.403 4 mg/mL、13.768 2 mg/mL;DAPI及伊红染色显示PSI在浓度为6μmol/L时,PC12细胞的形态改变及胞浆中嗜酸性小体表现最为典型;HE染色后,倒置显微镜下观察结果显示PSI作用下PC12形态及数量均发生改变;HE染色显示细胞数量减少,有聚集倾向,细胞体积增大,细胞胞浆内出现帕金森特征性病理改变路易小体的类似结构嗜酸性小体;MTT结果显示,不同浓度的牵正散水煎剂可以改善PSI对PC12细胞增殖的抑制作用。结论:获得PC12细胞帕金森病体外培养细胞模型;确定一定浓度的牵正散水煎剂可以不同程度地改善体外帕金森病细胞模型的增殖情况;为牵正散的临床应用提供实验依据,为临床药物治疗帕金森病提供新的思路。     

四逆汤及其拆方水煎液对缺血心肌细胞的保护作用

目的:探讨四逆汤(Sini decoction,SND)及其拆方水煎液对缺血大鼠离体心肌细胞H_9C_2的保护作用。方法:采用不同浓度的含药培养液培养细胞,显微镜下观察心肌细胞建模前后的生长状态;利用MTT比色法比较各加药浓度下单味药、药对、全方对缺血前后心肌细胞H_9C_2存活率的影响,并分析各试药之间作用的差异。结果:1)400倍镜下可见正常培养细胞生长状态良好,细胞形态为梭形,聚集式生长;缺血模型细胞形态改变,间隙变大,结构发生萎缩,死亡细胞增多。2)与缺血后SND组比较,10、20、5 mg/mL浓度干姜水煎液(Ginger water decoction,GWD)对缺血后H_9C_2细胞无保护作用,存活率分别为(44.89±2.59)%、(49.43±1.87)%、(73.67±1.30)%,两两之间差异显著(P0.01)。在浓度为1.0 mg/mL时,附子水煎液(aconite water decoction,AWD)对缺血前后各组细胞均产生细胞毒性。甘草水煎液(Licorice water decoction,LWD)同附子-甘草水煎液(licorice and aconite decoction,LAWD)比较,对H_9C_2保护作用均较弱。附子-干姜水煎液(Ginger and aconite water decoction,GAWD)各浓度缺血后加药组同SND组比较对H_9C_2保护作用无差异。结论:SND及其拆方GAWD、LAWD、AWD、LWD均对缺血H_9C_2有明显促增殖作用;各浓度GWD对缺血H_9C_2无保护作用,1.0 mg/mL AWD有细胞毒性。     

麻黄汤等超微饮片与传统饮片对斑马鱼胚胎毒性的比较研究

目的 比较麻黄汤等三个中医经典方剂超微饮片与传统饮片水煎液对斑马鱼胚胎毒性的影响,为其超微饮片的临床安全应用提供科学依据.方法采用模式生物斑马鱼发育正常的胚胎,在不同药物浓度药物环境中培养72 h后,于倒置显微镜下观察胚胎的存活、发育、致畸情况,72 h后,计算致斑马鱼胚胎半数死亡浓度(LC50).结果麻黄汤超微饮片组与传统饮片组LC50分别为4.641,7.569 mg/mL;葛根芩连汤超微饮片组与传统饮片组的LC50分别为1.473,3.570 mg/mL;小柴胡汤超微饮片组与传统饮片组的LC50分别为2.223,2.441mg/mL.结论斑马鱼胚胎毒性分析结果表明,相同药物和相同浓度时,超微中药饮片毒性大于传统中药饮片.     

齐墩果酸诱导多种小鼠胚胎干细胞向生殖细胞方向分化研究

目的:寻找一种能诱导多种胚胎干细胞向生殖细胞方向分化的化合物,并以常用的诱导物维甲酸(Retinoic Acid,RA)作为阳性参照物。方法:分别培养小鼠胚胎干细胞1B10、D3、R1/E,诱导它们形成拟胚体,让拟胚体贴壁生长,加入特定化合物诱导贴壁细胞分化,诱导72 h后,提取被诱导细胞的RNA,再合成c DNA,最后利用实时荧光定量PCR检测各被诱导细胞中与生殖分化相关的基因的表达水平的变化。结果:发现齐墩果酸(Oleanolic Acid,OA)显著上调了所有被研究的小鼠胚胎干细胞的生殖分化关键基因的表达水平,同时发现阳性参照物RA仅能诱导1B10、R1/E,而不能诱导D3向生殖细胞方向分化。结论:OA能诱导多种胚胎干细胞向生殖细胞方向分化,诱导能力方面具有比常用诱导物维甲酸更广泛的普遍性。     

倒千里光碱对小鼠体外培养胚胎的发育毒性研究

目的 探讨倒千里光碱的胚胎发育毒性.方法 采用小鼠全胚胎培养模型,将8.5d小鼠胚胎在含有倒千里光碱的即刻离心血清中培养48 h(倒千里光碱的终浓度分别为12.5,25,50,100 mg·L-1),观察倒千里光碱对胚胎生长发育(卵黄囊直径、颅臀长、头长、体节数)和组织器官形态分化(卵黄囊循环、尿囊、翻转、心、脑、尾神经管、视听嗅系统、腮弓、颌突、肢芽)的影响.结果 倒千里光碱对胚胎的生长发育和形态分化均具有明显的毒性影响.随倒千里光碱浓度的增加,胚胎的生长发育和组织器官形态分化指标影响越来越严重,其中听嗅系统、腮弓、上下颌突、前后肢芽的影响最为明显.结论 倒千里光碱对体外培养的小鼠胚胎有明显的毒性作用,提示妊娠期暴露于该化合物对胎儿具有潜在的毒性.     

从鸦胆子中筛选抗疟药物

本文意在通过体外细胞毒性试验和抗疟原虫试验从鸦胆子中筛选抗疟药物。为了在体内试验前分离出具有抗疟原虫活性的天然药物,一般宜先用恶性疟原虫在体外做试验。为在体外做可靠的选择性抗疟原虫活性试验,作者采用哺乳动物KB细胞系(从人体鼻咽表皮样癌中得到)微量稀释。以植物提取物的IC_(50)值和分离所得化合物的IC_(50)值作比较抗疟原虫活性和细胞毒(KB细胞)活性,两值之比作为选择抗疟原虫活性的标准。比值小于1,则表示抗哺乳动物细胞活性大于抗疟原虫活性。鸦胆子为传统抗疟中药。一般用其水煎     

应用全胚胎培养方法研究野百合碱对 小鼠胚胎发育的影响

目的:探讨野百合碱的胚胎发育毒性.方法:采用小鼠全胚胎培养模型,将8.5 d小鼠胚胎在含有野百合碱的即刻离心血清中培养48 h(野百合碱的终浓度分别为100,50,25,12.5 mg·L-1),观察野百合碱对胚胎生长发育(卵黄囊直径、颅臀长、头长、体节数)和组织器官形态分化(卵黄囊循环、尿囊、翻转、心、脑、尾神经管、视听嗅系统、腮弓、颌突、肢芽)的影响.结果:随野百合碱浓度的增加,胚胎的生长发育和组织器官形态分化受到的影响越来越严重,其中以视听系统、颌突、肢芽等项的影响最为明显.结论:野百合碱对体外培养的小鼠胚胎有明显的毒性作用,提示妊娠期暴露于该化合物对胎儿具有潜在的毒性.     

朝藿定C诱导C3H小鼠胚胎间充质干细胞向内皮样细胞分化的研究

目的研究朝藿定C(Epimedin C)诱导C3H小鼠胚胎间充质干细胞(murine embryonic mesenchymal stem cells,C3H/10T1/2)内皮样分化作用。方法体外培养C3H/10T1/2细胞,MTT法和结晶紫法检测不同浓度下朝藿定C对细胞的毒性作用;显微镜下观察朝藿定C诱导后的细胞形态变化;采用流式细胞仪检测朝藿定C对细胞周期分布的影响;采用半定量PCR检测血管内皮细胞标志物CD31、CD34、血管内皮细胞锌指1(vascular endothelial zinc finger 1,Vezf1)、血管生成素1(angiopoietin 1,Ang1)、血管生成素2(angiopoietin 2,Ang2)mRNA的表达;采用免疫细胞化学染色法检测血小板内皮黏附分子-1(platelet-endothelial cell adhesion molecule-1,CD31)、细胞外-5’-核苷酸酶(ecto-5’-nucleotidase,CD73)、内皮细胞特异性分子-1(endothelial cell specific molecule-1,ESM-1)、整合素β5(integrinβ5)的表达。结果朝藿定C在浓度1~30μmol/L时,不影响C3H/10T1/2细胞的存活率。30μmol/L处理24 h后,对细胞周期无明显影响。朝藿定C能诱导C3H/10T1/2细胞向血管内皮细胞分化,使细胞呈明显漩涡状排列。PCR检测结果显示,与干预前比较,经诱导5天后的C3H/10T1/2细胞血管内皮细胞标志因子、CD34、Vezf1、Ang1、Ang2 mRNA水平明显增加(P<0.05,P<0.01);细胞免疫化学染色结果显示诱导5天后的C3H/10T1/2细胞血管内皮细胞标志性蛋白CD31、CD73、ESM-1均呈阳性表达,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。结论朝藿定C能诱导C3H/10T1/2细胞向血管内皮样细胞分化。     

川芎白芍及配伍对离体小鼠子宫痛经模型的影响

目的 观察川芎、白芍及川芎-白芍药对水煎液对离体小鼠子宫平滑肌的影响.方法 利用离体小鼠子宫收缩实验,观察药物对缩宫素引起子宫痉挛收缩的收缩频率、收缩幅度的抑制作用,计算抑制率.结果 各水煎液对小鼠离体子宫平滑肌收缩频率有抑制作用,白芍中剂量组、川芎-白芍中荆量组抑制率有统计学差异(P<0.05),白芍大剂量组、川芎-白芍小剂量组有显著性差异(P<0.01),其余各组无统计学差异.对于收缩幅度的抑制,白芍大剂量组与对照组相比较有统计学差异(P<0.05),其余各组差异不显著.结论 川芎、白芍及川芎-白芍药对水煎液在体外对子宫平滑肌收缩有抑制作用.     

基于对免疫功能的调节探讨柴银颗粒对人冠状病毒肺炎疫毒袭肺证的治疗作用

根据国家主管部门对新型冠状病毒肺炎中医病证的分类,确定在寒湿证小鼠模型基础上感染人冠状病毒229E(HCoV-229E),形成人冠状病毒肺炎疫毒袭肺证病证结合模型,该模型可模拟《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第六版)》中医治疗普通型病证。具体步骤如下:建立寒湿证小鼠模型,在此模型基础上感染HCoV-229E,实验分为正常对照组,感染对照组,寒湿对照组,寒湿感染组(模型组),柴银颗粒高(8.8 g·kg~(-1)·d~(-1))、低(4.4 g·kg~(-1)·d~(-1))剂量组。感染当天给予柴银颗粒治疗,连续给药3 d。末次给药第2天解剖取肺组织,计算肺指数及抑制率;提取肺组织核酸,实时荧光定量RT-PCR法检测病毒载量;分离血液白细胞,流式细胞术检测T和B淋巴细胞百分比;提取肺组织蛋白,ELISA法检测IL-6,IL-10,TNF-α及IFN-γ含量。体外实验采用细胞病变(CPE)抑制法,从药物的最大无毒浓度开始,测定柴银颗粒对HCoV-229E的抑制作用,按Reed-muench法计算50%细胞毒性浓度(TC_(50))、最大无毒浓度(TC_0)、50%细胞抑制浓度(IC_(50))及药物治疗指数(TI)。结果显示,柴银颗粒高、低剂量能显著降低人冠状病毒肺炎疫毒袭肺证小鼠的肺指数(P0.01),抑制率分别为61.02%,55.45%;显著升高人冠状病毒肺炎疫毒袭肺证小鼠外周血CD4~+ T淋巴细胞、CD8~+ T淋巴细胞、总B淋巴细胞百分比(P0.05,P0.01);显著降低人冠状病毒肺炎疫毒袭肺证小鼠肺组织炎症因子IL-10,TNF-α,IFN-γ含量(P0.01)。体外实验结果显示,柴银颗粒的TC_(50)为4.46 mg·mL~(-1),TC_0为3.13 mg·mL~(-1),IC_(50)为1.12 mg·mL~(-1),TI为4;体外培养细胞对照组无HCoV-229E病毒核酸表达,病毒对照组HCoV-229E病毒核酸表达量为1.48×10~7 copies/mL,柴银颗粒在3.13,1.56 mg·mL~(-1)剂量时可明显降低HCoV-229E病毒核酸表达,核酸表达量分别为9.47×10~5,9.47×10~6 copies/mL。柴银颗粒对小鼠人冠状病毒肺炎疫毒袭肺证有较好的疗效,可能通过增强机体免疫能力,降低肺细胞炎性因子表达发挥作用。     

四逆汤组方配伍减毒实验研究

目的针对四逆汤组方中所含的有毒中药附子,从毒理学角度研究四逆汤组方配伍的合理性。方法通过平行比较附子、附子配伍甘草、附子配伍干姜和四逆汤全方水煎液小鼠急性毒性、大鼠心脏毒性和毒性成分,测定小鼠急性毒性的半数致死剂量(LD50)、大鼠心脏毒性半数中毒剂量(TD50)和水煎液液中乌头碱类生物碱含量,从急性毒性、毒性靶器官和毒性成分3个方面研究四逆汤组方中不同配伍对附子毒性的影响。结果四逆汤组方中附子配伍甘草急性毒性的 LD50和心脏毒性的 TD50高于单用附子与四逆汤全方。而附子配伍干姜对附子的急性毒性的 LD50和心脏毒性的 TD50影响不明显。附子配伍甘草水煎液中主要毒性成分双酯型生物碱含量低于附子配伍干姜。结论四逆汤组方配伍药物中甘草对附子毒性具有减毒作用。     

桂枝不同萃取部位抗过敏作用的研究

目的:观察解表药桂枝不同萃取部位的抗过敏作用,探讨该药抗过敏作用的有效物质基础,为其功效和临床应用提供药理依据。方法:采用2,4-二硝基氯苯(DNCB)诱发的小鼠迟发型超敏反应模型,及小鼠异种被动皮肤过敏反应模型观察各受试药液对模型动物毛细血管通透性的影响,以初步筛选有效部位。进一步采用DNCB致小鼠迟发型超敏反应以及组胺、5-羟色胺所致小鼠皮肤毛细血管通透性增高模型,和体外透明质酸酶抑制实验验证桂枝去油水煎液、乙酸乙酯部位与水提部位的抗过敏作用。结果:桂枝去油水煎液(6g生药/kg)、乙酸乙酯萃取部位(6g生药/kg)、水提部位(6g生药/kg)能显著降低迟发型过敏反应模型小鼠的毛细血管通透性,乙酸乙酯部位组亦能明显抑制该模型小鼠的耳廓肿胀度;三者对小鼠异种被动皮肤过敏反应有明显抑制作用。桂枝去油水煎液及乙酸乙酯部位对组胺、5-HT所致小鼠毛细血管通透性的增加有显著抑制作用;两者在浓度0.5g/ml时,体外对透明质酸酶有较强的抑制作用,抑制率分别为52.48%、52.17%。结论:桂枝去油水煎液、乙酸乙酯部位具有较好的抗过敏作用,提示桂枝抗过敏作用的有效组分以极性较高的水溶部位为主,其作用机制与抗过敏介质(如His、5-HT)效应有关。     

心肌微环境下丹酚酸B诱导MSCs 向心肌样细胞分化的研究

[目的]复制心肌缺血-再灌注损伤模型,体外模拟心肌缺氧复氧微环境,观察丹酚酸B(SalB)诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌样细胞分化的作用。[方法]通过向MSCs培养体系中添加心肌细胞裂解液的方法,体外模拟心肌微环境。自成年大鼠骨髓中分离MSCs,设对照组(A组)、心肌细胞裂解液(TJ)组(B组)、SalB组(C组)、TJ+SalB组(D组)。培养4周,观察细胞形态,并采用免疫荧光技术检测cTnT的表达。[结果]除A组MSCs无明显的肌样细胞形成,各诱导组均有肌样细胞分化,D组与C组相比,cTnT表达率明显增高,差异有统计学意义。[结论]心肌细胞裂解液可以诱导MSCs向心肌样细胞分化;心肌微环境的建立有利于SalB诱导MSCs向心肌样细胞分化。     

洋常春藤中的一种皂甙提取物α-常春藤素对体外培养细胞的活性

α-常春藤素是洋常春藤(Hederahelix)中提取的一个单链糖甙的三萜皂甙。分析α-常春藤素对小鼠B_(18)黑色素瘤细胞和非癌小鼠3T3成纤维细胞体外培养的作用。结果表明,在无血清的培养基中,仅仅经过8个小时的处理,极低浓度(<5μg/ml)的α-常春藤素就显示细胞毒性,抑制两种细     

金喉健配方超临界提取工艺产物体外抗病毒研究

目的:评价金喉健配方超临界提取物的体外抗流感(H1N1)病毒活性。方法:通过流感病毒感染MDCK细胞来测定病毒TCID_(50)/m L=10~(-6.25);将提取物加入细胞已成膜的96孔板中检测金喉健配方超临界提取工艺产物对细胞的毒性;将提取物和病毒混合后加入细胞中检测金喉健配方超临界提取工艺产物体外抗流感病毒活性。结果:提取物的抗病毒活性与浓度呈正相关性,半数抑制浓度(IC_(50))为8.71μg/m L,在6.25～50μg/m L的有效剂量范围内,未见对细胞产生毒性,选择指数(SI)大于11.48。结论:金喉健配方超临界提取工艺产物具有抗H1N1流感病毒活性。