17β-雌二醇联合苯并芘异常激活人肺腺癌A549细胞中AHR/PD-L1轴

目的:探讨17β-雌二醇(17β-estradiol, E₂)和苯并芘(benzopyrene, BaP)对人肺腺癌A549细胞程序性死亡配体1(programmed death ligand 1, PD-L1)表达的影响及其潜在分子机制。方法:分别选用浓度梯度为1～1 000 nmol/L的E₂和浓度梯度为0.008～5 μmol/L的BaP处理A549细胞,筛选出最适浓度;实验分为对照组、E₂组、BaP和E₂+BaP组,每组实验重复3次。RT-qPCR检测PD-L1的mRNA水平;Western blot检测PD-L1、芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor, AHR)和缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)表达水平,以及蛋白激酶B(protein kinase B, PKB/AKT)和细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2, ERK1/2)的磷酸化水...     

石蒜碱通过调控MAPK/ERK信号通路抑制人结肠腺癌LoVo细胞生长

目的:探讨石蒜碱(lycorine)对人结肠腺癌LoVo细胞活力、凋亡和迁移侵袭能力的影响及其作用机制。方法:不同浓度(1～8μmol/L) lycorine处理LoVo细胞,CCK-8法检测细胞活力;划痕愈合和Transwell小室实验检测迁移和侵袭能力;Hoechst染色及流式细胞术实验检测凋亡改变;萤光素酶报告基因系统检测MAPK/ERK信号通路活化情况;同时采用Western blot法检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相关标志物、凋亡相关蛋白及磷酸化ERK1/2蛋白水平的变化。结果:与空白对照组相比,lycorine处理组LoVo细胞的活力和迁移侵袭能力受到显著抑制(P<0.05),同时EMT相关标志物基质金属蛋白酶7(matrix metalloproteinase-7, MMP-7)和N-cadherin表达下调,E-cadherin表达上调(P<0.05),而凋亡细胞数及cleaved casp...     

A549肺癌细胞条件培养液促进人骨髓间充质干细胞的增殖和迁移

目的:探讨A549肺癌细胞对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)增殖和运动的影响.方法:以提取A549肺癌细胞和BEAS-2B正常人肺上皮细胞上清液制备条件培养基,培养的hBMSCs分别为A549组和BEAS-2B组;2组均添50 nmol/L趋化因子-8(CXCL-8),分别为A549 C组和BEAS-2B C组,若同...     

肺腺癌细胞微环境及转移与黏附分子表达的关系

目的研究肺腺癌细胞生长环境及转移性与黏附分子CD44v6和CD29的表达关系。方法将起源相同、转移性不同的两个肺腺癌细胞系AGZY和Anip分别用简便肿瘤多细胞球体(MTS)培养法培养，并设常规单层贴壁细胞培养对照。通过倒置显微镜、扫描及透射电镜观察MTS形成情况，并用免疫组化法分别对MTS及贴壁细胞上CD44v6和CD29表达进行检测。结果MTS培养成功，贴壁细胞与MTS在细胞结构及细胞连接结构上相似，两种MTS在形态及结构上差异无显著性。免疫组化结果显示，CD29在高转移性的Anip细胞及其MTS上呈阳性表达；在低转移性的AGZY细胞及其MTS上阴性表达。CD44v6在Anip和AGZY细胞及MTS上均呈阳性表达，差异无显著性。贴壁细胞与MTS上两种黏附分子表达均无差异。结论成功建立了一种简易制备MTS的方法。细胞生长方式(单层贴壁与MTS)可能不影响CD44v6和CD29的表达。CD29表达可能与肺腺痛转移性相关；CD44v6表达可能与肺腺癌转移无关。     

骨髓微环境对骨髓瘤细胞生物行为的影响

目的：观察骨髓瘤患者基质细胞(BMSC)及其对瘤细胞几种细胞因子及瘤细胞膜上粘附分子表达的影响。方法：用细胞培养、RT-PCR、流式细胞仪分别测定BMSC及与BMSC共同培养前后瘤细胞IL-6 mRNA、IL-1βmRNA、TNF-α mRNA及瘤细胞膜上ICAM-1、VCAM-1的表达。结果：初治多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)患者BMSC与瘤细胞共同培养后，初治和复发、难治性MM患者瘤细胞ICAM-1、VCAM-1表达增加；复发、难治MM患者BMSC与瘤细胞共同培养后，初治和复发、难治胁患者瘤细胞的IL-6 mRNA、IL-1β mRNA、TNF-α mRNA及ICAM-1、VCAM-1表达均增加；初治MM患者BMSC膜上ICAM—1、VCAM-1表达高于正常对照组；复发、难治MM患者BMSC IL-6 mRNA、IL-1βmRNA、TNF-α mRNA及ICAM-1、VCAM-1的表达均高于正常对照组和初治MM患者。结论：初治MM患者BMSC表达粘附分子增加，复发、难治MM患者BMSC除粘附分子表达异常外，其IL-6 mRNA、IL-1β mRNA、TNF-α mRNA亦表达异常；MM细胞与BMSC共同培养后，粘附分子和(或)IL-6 mRNA、IL-1β mRNA、TNF-α mRNA表达增加，可能与MM细胞的存活、生长、耐药及疾病复发密切相关。     

小鼠白血病骨髓基质细胞对白血病细胞体外生长的作用

用Dexter培养体系作L615小鼠白血病骨髓长期培养,观察基质细胞对白血病细胞体外生长的影响。结果显示:大量白血病细胞在1周内死亡。少数粘附于骨髓基质的细胞能在此体系繁殖,经过8周以上传代后获得独立生长能力,成为不死的细胞系,命名为L615-1。这种细胞能在BALB/C裸鼠皮下形成淋巴肉瘤,但不能诱发同系小鼠发生白血病。本文结果提示骨髓基质细胞能支持恶性造血细胞体外生长。     

动态力学信号对人骨髓基质细胞、骨膜细胞生长和成骨表达的作用

目的 探讨动态力学信号对体外分离培养的人骨髓基质细胞、骨膜细胞生长与分化特征的生物学效应。方法 使用Flexcell应力系统，将频率为1Hz、振幅为5％变形、正弦波状力学信号作用于体外分离培养的正常人骨髓基质细胞和骨膜细胞，在不同时间段检测其对细胞DNA、总蛋白合成、碱性磷酸酶（ALP）表达和骨钙素分泌量的影响。结果 动态力学刺激对人骨髓基质细胞、骨膜细胞蛋白与DNA合成无明显作用。接受力学刺激信号后骨膜细胞受维生素D3刺激后分泌骨钙素显著增加，而骨髓基质细胞则显著下降。结论 动态力学信号能够促进人骨膜细胞向成骨细胞分化，这可能是其对骨的生物学作用的机制之一。     

衰老模型骨髓基质细胞抑制造血细胞增殖分化

目的研究衰老骨髓基质细胞对骨髓造血细胞增殖分化能力的影响,为阐述机体造血微环境衰老对造血干/祖细胞增殖的影响提供实验依据。方法全骨髓贴壁法体外培养大鼠骨髓基质细胞,分为对照组和衰老组。衰老组:常规培养基内加入30 mg/m L D-半乳糖作用48 h。CCK-8法测定BMSCs增殖;流式细胞术分析细胞周期;β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色观察衰老BMSCs百分率;Western blot检测P16、P21和P53蛋白表达。骨髓造血细胞与BMSCs共培养,集落计数检测髓系多向性造血祖细胞(CFU-Mix)增殖分化。ELISA检测BMSCs培养上清液中IL-1β、GM-CSF和SCF含量;DCFH-DA流式荧光检测BMSC活性氧簇(ROS)水平;酶学法检测BMSCs内过氧化物丙二醛(MDA)含量和总超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果与对照组相比,D-半乳糖诱导BMSCs衰老,细胞阻滞于G0/G1期(P0.01),增殖能力显著下降,SA-β-Gal染色阳性率升高(P0.01);衰老相关蛋白P16、P21和P53表达明显上调(P0.01)。与衰老BMSCs共培养的骨髓造血细胞增殖分化能力减弱。衰老BMSCs内ROS、MDA氧化损伤指标上升,SOD抗氧化指标下降(P0.01);BMSCs培养上清液IL-1β、GM-CSF和SCF含量明显下降(P0.01)。结论衰老骨髓基质细胞抑制造血细胞增殖、分化能力,其机制可能与骨髓基质细胞氧化损伤,分泌活性因子改变有关。     

衰老大鼠模型骨髓基质细胞的生物学特点

目的探讨衰老大鼠骨髓基质细胞(BMSCs)的生物学特点,为阐释机体衰老对造血诱导微环境的影响提供实验依据。方法雄性健康SD大鼠随机分为正常组和衰老模型组。衰老模型组:大鼠皮下注射D-半乳糖120mg/kg,qd×42;正常对照组:大鼠皮下注射等时与等量生理盐水。衰老动物复制完成后第2天,分离骨髓单个核细胞(BMNCs)进行髓系造血祖细胞混合集落生成单位(CFU-Mix)培养。采用全骨髓贴壁法培养和传代BMSCs,取第3代细胞进行检测,CCK-8法测定BMSCs增殖能力;流式细胞术分析细胞周期;衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色观察衰老BMSCs百分率;ELISA检测细胞培养上清液中白细胞介素(IL)-6、干细胞生长因子(SCF)含量;DCFH-DA荧光染色流式检测BMSC活性氧簇(ROS)水平;酶学法检测BMSCs内过氧化物丙二醛(MDA)含量和总超氧化物歧化酶(SOD)活性;Western blotting检测衰老相关蛋白P16、P21、P53表达。结果与对照组相比衰老模型组大鼠CFU-Mix集落形成数量明显降低;BMSCs增殖能力显著下降;处于G0/G1期的BMSCs比例增高、S期细胞比例降低,细胞阻滞于G1期;SA-β-Gal染色阳性的BMSCs百分率显著上升;BMSCs培养上清液中IL-6、SCF含量明显下降;BMSC内ROS、MDA氧化损伤指标上升,SOD抗氧化指标下降;衰老相关蛋白P16、P21、P53表达明显上调。结论衰老大鼠骨髓基质细胞表现衰老相关生物学改变,其机制可能与氧化损伤激活衰老信号通路有关。     

骨髓基质细胞对脑神经干细胞分化为神经元的诱导作用

目的：观察成年大鼠骨髓基质细胞诱导的新生大鼠中脑神经干细胞分化为神经元的机制。方法：采用骨髓基质细胞和神经干细胞共培养方法，通过显微镜观察神经干细胞的分化状态，使用免疫组织化学技术，分析神经元在神经细胞后代中所占的比例。结果：（1）骨髓基质细胞可诱导神经干细胞分化为高比例神经元；（2）骨髓基质细胞可促进神经元的存活。结论：骨髓基质细胞可提供神经干细胞分化为神经元和促进神经元存活的信号物质。     

miR-24对肺癌A549细胞化疗敏感性的影响

目的:探究微小RNA(miR)-24对肺癌细胞A549化疗敏感性的影响及可能的作用机制。方法:Real-time PCR实验检测肺腺癌细胞系A549及肺腺癌耐药细胞株A549/DDP中miR-24的表达情况。转染miR-24抑制序列(miR-24 inhibitor)下调A549/DDP细胞中的miR-24后,采用CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、细胞色素C(Cyt C)、磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)和P53的蛋白水平。双荧光素酶报告基因实验预测及验证miR-24可能的靶基因。结果:耐药细胞株A549/DDP中miR-24的表达水平明显高于A549细胞(P0.05)。miR-24 inhibitor可诱导肺腺癌耐药细胞株A549/DDP的凋亡,增加细胞对顺铂的敏感性;此外还可下调Bcl-2/Bax比值,同时上调P53、p-ERK、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3及Cyt C的蛋白水平。而应用ERK特异性抑制剂U0126可部分恢复miR-24 inhibitor转染的细胞活力。生物信息学分析显示p53是miR-24的可能作用靶点基因,在A549/DDP细胞中共转染miR-24 inhibitor和P53 siRNA可部分逆转miR-24 inhibitor对细胞活力的影响。结论:下调肺腺癌耐药细胞株A549/DDP中miR-24的表达可增加细胞对顺铂的敏感性,其机制可能与靶向p53基因同时激活ERK/P53信号通路后促进细胞经线粒体途径的凋亡有关。     

二氢杨梅素对肺癌A549细胞凋亡的作用

目的 探讨二氢杨梅素（DMY）对肺癌A549细胞的诱导凋亡作用。方法 以肺癌A549细胞为研究对象,采用MTT法研究DMY对A549细胞的抗肿瘤作用,并进一步通过流式细胞术检测DMY对A549细胞的凋亡作用,免疫印迹法（Western blotting）检测促凋亡因子Bax和抗凋亡因子Bcl-2表达水平,进一步探讨其机制。
结果 DMY浓度越大,对A549细胞的抑制作用越明显,48h的IC50为64.45g/L;流式细胞术显示,随着DMY浓度的增加A549细胞凋亡也逐渐增加;Western blotting结果显示,DMY可诱导A549细胞中凋亡因子Bax蛋白表达增加,同时抗凋亡因子Bcl-2蛋白表达减少,尤其高浓度组改变明显。
结论 DMY可以在体外诱导A549细胞凋亡。     

人参二醇组皂苷对再生障碍性贫血小鼠造血组织MAPK/ERK信号通路的诱导作用

目的:观察人参二醇组皂苷(PDS)对免疫介导型再生障碍性贫血(简称再障)小鼠骨髓细胞MAPK/ERK信号通路蛋白激酶及脾脏调节性T细胞的诱导作用,探讨其治疗再障的作用机制。方法:用[60Co]-γ射线5.0 Gy全身照射BALB/c小鼠,后经尾静脉输入DBA/2小鼠的淋巴细胞悬液,制备免疫介导型再障小鼠模型。60只小鼠随机分为6组,即正常组,模型组,PDS低、中、高剂量组,环孢素组。不同浓度药物灌胃治疗14 d测定各组小鼠外周血象,观察骨髓病理切片,Western blot法及免疫组织化学法测定骨髓细胞MEK1/2、p-MEK1/2、ERK1/2和p-ERK1/2的蛋白水平,流式细胞术检测脾脏调节性T细胞比例。结果:再障小鼠外周血全血细胞减少,骨髓呈抑制状态;PDS治疗能够显著升高再障小鼠外周血象,增加脾脏调节性T细胞比例,呈剂量依赖性(P0.05)。PDS中、高剂量组显著上调骨髓细胞MEK1/2、p-MEK1/2、ERK1/2和p-ERK1/2的蛋白水平(P0.05)。结论:PDS能有效促进造血,上调再障模型小鼠骨髓细胞MAPK/ERK信号通路多种蛋白激酶的表达,可能是PDS促进骨髓造血功能恢复的作用机制之一。另外,PDS对再障模型小鼠的免疫功能有一定的调节作用。     

β-雌二醇经ERβ-ERK1/2雌激素胞膜信号传导途径促进肺癌A549细胞迁移和侵袭

目的:研究β-雌二醇(β-estradiol)促进肺癌A549细胞迁移和侵袭的调控机制。方法:体外培养乳腺癌MCF-7细胞和肺癌A549细胞,以MCF-7细胞作为阳性对照明确雌激素受体(ER)在A549细胞中的表达情况; real-time PCR检测ERβ亚型ERβ1、ERβ2和ERβ5在A549细胞中的表达情况,免疫荧光定位ERβ在细胞内的胞膜和胞核分布情况;予β-estradiol刺激A549细胞,Western blot检测胞内ERK1/2磷酸化水平改变,Transwell小室侵袭实验和细胞实时监测培养系统检测细胞迁移和侵袭能力的变化;利用ERK1/2抑制剂PD98059预先处理,Transwell小室侵袭实验和细胞实时监测培养系统检测β-estradiol刺激后细胞迁移和侵袭能力的变化。结果:ER在A549细胞中以表达ERβ为主,且表达的ERβ以ERβ2和ERβ5为主,免疫荧光显示细胞内ERβ以胞质分布为主。β-estradiol可以引起A549细胞ERK1/2磷酸化水平的增加,并促进细胞的迁移和侵袭,抑制ERK1/2信号传导可以逆转β-estradiol促进的细胞迁移和侵袭。结论:β-estradiol经ERβ活化ERK1/2雌激素胞膜信号传导,从而促进A549细胞的侵袭和转移。ERK1/2是ERβ雌激素胞膜信号传导中与肺癌侵袭和转移相关的重要信号节点。     

M3R激动剂通过激活PI3K/AKT信号途径促进肺癌细胞A549的上皮间质转化

目的:探讨毒蕈碱胆碱受体3(muscarinic receptor 3,M3R)激动剂卡巴胆碱促进人肺癌A549细胞上皮间质转化的可能信号通路。方法:用400μmol/L卡巴胆碱刺激人肺癌A549细胞,在倒置相差显微镜下观察细胞形态的变化,应用划痕愈合实验和Transwell实验观察细胞迁移和侵袭能力;应用q PCR技术检测上皮间质转化相关蛋白波形蛋白(vimentin)和E钙黏蛋白(E-cadherin)m RNA水平的变化;应用Western blot技术检测p-AKT、vimentin和E-cadherin蛋白水平的变化。结果:卡巴胆碱刺激人肺癌A549细胞后,细胞形态发生明显改变,由不规则多边形逐渐向梭形转化、细胞间紧密结合逐渐变得松散,细胞迁移和侵袭能力增强;vimentin的m RNA和蛋白表达量明显增加,E-cadherin的m RNA和蛋白水平降低,磷酸化的AKT蛋白水平增加,且这些变化均可被M3R特异性抑制剂4-DAMP所抑制(P0.05)。结论:卡巴胆碱可通过激活PI3K/AKT信号途径促进人肺癌A549细胞发生上皮间质转化。     

miRNA-126对肺癌A549细胞的增殖、迁移、侵袭及EGFR/AKT/mTOR信号通路的影响

 目的: 探讨微小RNA(microRNA,miRNA)-126对肺癌A549细胞功能的影响及相关的作用机制。方法: 利用脂质体试剂Lipofectamine 2000将miRNA-126转染入肺癌A549细胞中,采用real-time PCR法检测转染后各组细胞中miRNA-126的表达;MTT法检测细胞活力;台盼蓝拒染实验检测细胞存活数目;细胞集落培养实验观察转染后细胞集落形成;划痕愈合实验检测细胞的迁移能力;Transwell小室实验检测细胞侵袭能力;Western blot法检测EGFR/AKT/mTOR通路中各蛋白水平的变化。结果: Real-time PCR结果显示,转染miRNA-126组细胞中的miRNA-126表达水平显著高于阴性对照组和空白对照组(P<0.01),而阴性对照组与空白对照组无显著变化;A549细胞转染miRNA-126模拟物后,细胞增殖和集落形成能力均呈明显下降(P<0.01);肺癌细胞的迁移和侵袭能力也受到明显抑制(P<0.01);Western blot结果显示,转染miRNA-126组细胞中EGFR/AKT/mTOR通路相关蛋白p-EGFR、p-AKT和p-mTOR的水平均有明显降低(P<0.01)。结论: miRNA-126可以显著降低肺癌A549细胞中p-EGFR、p-AKT和p-mTOR的蛋白水平,进而可能抑制其细胞增殖和迁移侵袭能力。     

5-氟尿嘧啶诱导人肺腺癌A549细胞自噬

目的 探讨5-氟尿嘧啶(5-FU)是否诱导人肺腺癌A549细胞发生自噬.方法 吖啶橙(AO)荧光染色和透射电镜观察自噬泡的变化;细胞免疫化学法测定LC3-Ⅱ的表达;流式细胞术及吖啶橙染色结合激光扫描共焦显微镜检测细胞凋亡;DNA电泳检测凋亡梯形条带的产生.结果 吖啶橙荧光染色和透射电镜观察结果显示,5-氟尿嘧啶处理细胞...     

Shp2在肺腺癌细胞A549中的抑癌作用及机制研究

目的:探索Shp2在肺腺癌细胞A549中的抑癌作用及机制。方法:应用CCK-8及Ed U实验检测Shp2特异性抑制剂Phps-1抑制Shp2活性对A549细胞活力、增殖及对顺铂(DDP)耐药情况的影响,Annexin VFITC/PI双染法检测细胞凋亡率,Western blot法检测caspase-3的17 kD片段(caspase-3-17p)、Bcl-2、Bax、p-STAT3/STAT3及p-ERK/ERK的蛋白水平。结果:Phps-1浓度为20μmol/L、作用24 h对A549细胞活力的促进作用显著,与对照组比较具有显著性统计学差异(P0.05)。Phps-1 20μmol/L组的细胞增殖率为0.455±0.085,对照组为0.307±0.012。DDP 8 mg/L组及Phps-1 20μmol/L联合DDP 8 mg/L组的细胞凋亡率分别为13.01%±2.62%和3.67%±0.93%(P0.05)。抑制Shp2活性能够下调DDP诱导的促凋亡蛋白caspase-3-17p及Bax的蛋白水平,并上调p-STAT3及下调p-ERK蛋白水平。结论:Shp2在肺腺癌细胞A549中具有抑癌作用,抑制STAT3信号通路激活可能是Shp2发挥抑癌作用的重要分子机制。     

Clinicopathology of stromal invasion in lung adenocarcinoma

In the World Health Organization classification, lung adenocarcinoma with mixed subtypes is defined as invasive carcinoma with evidence of vascular, pleural, or stromal invasion. The histological criteria for stromal invasion, however, are not clearly established. A total of 157 peripheral pure bronchioloalveolar carcinoma (BAC) or lung adenocarcinoma with mixed BAC and others were reviewed. All cases had been resected between 1986 and 2000 and measured ≤30 mm in maximum dimension. Destruction of alveolar framework (DAF) was defined as distortion or discontinuity of the alveolar framework by tumor growth. The extra-alveolar area involvement (EAAI) was defined as tumor growth outside the alveolar framework, which includes the following areas: bronchial wall, perivascular connective tissue and/or the vascular wall, interlobular septum and the visceral pleura. Survival of patients with adenocarcinoma without DAF ( n  = 41) was 100%. Even when adenocarcinoma involved DAF and lacked EAAI ( n  = 21), survival was 100%. The 5 year survival rate of groups with two invasion signs ( n  = 34) was 90.1%, and that of groups with three to five invasion signs ( n  = 61) was 66.7%. Tumor growth outside the alveolar framework is the hallmark of stromal invasion.