基因治疗中的核酸药物及非病毒递送载体的研究进展

基因治疗是针对基因异常相关疾病的终极治疗技术,各种具有不同机制的核酸药物的出现为基因治疗带来了更多的可能性。但是,由于存在体内稳定性差、难以高效进入靶细胞等问题,核酸药物需要载体的帮助而进入目标细胞并到达特定的胞内位置,因此,开发安全高效的核酸递送系统是基因治疗的基石。与病毒载体相比,非病毒载体具有更高的安全性,但转染效率较低。随着纳米技术的发展,非病毒载体的效率得到了显著的提升,进入临床研究的数量逐渐增多。本文简要介绍基因治疗中的核酸药物及其递送载体,对非病毒核酸药物递送技术的瓶颈及进展做综合评述。     

系统性红斑狼疮T细胞分子信号转导异常对疾病诊断及治疗的意义

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种典型的系统性自身免疫性疾病,T淋巴细胞在机体大量自身抗原刺激下,信号传递及基因表达出现多种特异性缺陷,在疾病发生发展中起到关键作用。CD3复合物的重构及胞膜表面脂筏的大量聚集使SLET细胞的活化阈降低,胞内信号级联紊乱;同时,聚集的脂筏中黏附分子表达上调促使T细胞向靶组织定向趋化;信号转导紊乱导致转录因子表达改变,DNA甲基化异常引发基因表达失衡。由此,功能异常的T细胞中改变的多种信号分子可以作为诊断和治疗SLE的潜在性分子靶标。     

壳聚糖脂质体复合载体的核酸递送

目的构建一种由脂质体Lipofectamine2000、低分子质量壳聚糖、pDNA组成的三元新型复合载体用于核酸递送能力研究。方法复合物形态采用原子力显微镜轻敲模式下表征、载体与核酸结合能力采用凝胶延滞法表征,Hep-2细胞报告基因表达利用倒置荧光显微镜检测。细胞毒性研究采用3-甲基-2-噻唑硫酮(MTT)法。结果复合载体与pDNA结合能力强,可完全延滞pDNA。脂质体/壳聚糖/pDNA复合载体形态呈现出未完全压缩的球形,短棒状和不规则的聚集块。新型载体转染Hep-2细胞提高了绿色荧光蛋白报告基因的表达效率。与脂质体对照载体比较,基因转染效率提高了2～4倍,对照壳聚糖载体无明显转染效果。细胞毒性表明壳聚糖降低了脂质体的细胞毒性。结论基于脂质体的壳聚糖新型复合载体具有核酸递送潜力。     

基因组医学、染色体组和人类疾病基因(4)

表观遗传信息、表现遗传调控和疾病 组织功能的分化需要一些特定基因表达,DNA甲基化对特定类型细胞的表达谱设定和维持起关键作用.这种表观遗传信息(Epigenetic information)和基因表达的联系,属于表观遗传调控(Epigenetie Contr01)的范畴,说明了表观遗传调控在决定基因活性中的作用.染色体修饰与siRNA有关.DNA甲基化作用和相关修饰作用会导致致病基因表达的变化,而表观遗传变化(EpigeneticChangec)常成为儿童疾病和癌症的重要原因,异常DNA甲基化与大部分癌症有一定关系.基因表达图谱的筛选有助于揭示表观遗传的缺陷,并为诊断和治疗药物的研究提供有关信息.     

可经粘膜途径递送DNA疫苗的减毒伤寒沙门菌载体的研究进展

DNA疫苗的本质是在哺乳动物细胞内表达重组蛋白抗原的质粒DNA,DNA疫苗能刺激机体产生体液及细胞免疫,有效的DNA疫苗载体可向细胞内高效传送质粒DNA.伤寒沙门菌是细胞内寄生菌,可通过黏膜途径感染,穿过黏膜上皮细胞屏障侵入黏膜相关淋巴组织(MALT),被MALT内专职抗原递呈细胞(APC)吞噬,并可在细胞吞噬泡内存活和增殖,同时细菌本身的病原相关分子模式(PAMP)是天然佐剂,因此可诱导机体产生有效的系统和局部经黏膜免疫应答,是极有发展潜力的经黏膜途径递送DNA疫苗的载体.     

十二烷基化壳聚糖基因支架血管内基因转运的实验研究

目的目前基因治疗方面存在的重要问题是缺乏有效的基因转运体系可以足量、安全地将治疗基因(无论病毒载体或非病毒载体)运送至体内靶细胞并提高其转染效率,以得到基因的高效表达。心血管内基因治疗的特殊性还在于很难把基因专一递送至血管组织的病灶处而不进入血液循环系统。实验研究提出了一种携带质粒DNA的烷基化壳聚糖纳米粒的血管内支架,可以有效地将质粒DNA递送至血管壁靶细胞并达到了高效转染的效果。     

基因组医学、染色体组和人类疾病基因（4）——膜通道的分子学多样性、疾病基因（2）细胞膜·膜蛋白·通道蛋白·离子通道·门通道

表观遗传信息、表现遗传调控和疾病组织功能的分化需要一些特定基因表达，DNA甲基化对特定类型细胞的表达谱设定和维持起关键作用．这种表观遗传信息(Epigenetic information)和基因表达的联系，属于表观遗传调控(Epigenetie Control)的范畴，说明了表观遗传调控在决定基因活性中的作用．染色体修饰与siRNA有关．DNA甲基化作用和相关修饰作用会导致致病基因表达的变化，而表观遗传变化(Epigenetic Changec)常成为儿童疾病和癌症的重要原因，异常DNA甲基化与大部分癌症有一定关系．基因表达图谱的筛选有助于揭示表观遗传的缺陷，并为诊断和治疗药物的研究提供有关信息．     

Polo样激酶1(PLK1)的敲低及其对宫颈癌HeLa细胞生长的抑制作用

目的研究敲低Polo样激酶1(PLK1)后对宫颈癌HeLa细胞生长的作用。方法流式细胞术评测LAH4-L1载体对小干扰绿色荧光蛋白基因(siGFP)的递送效率;反转录PCR检测PLK1 mRNA水平,Western blot法检测PLK1蛋白水平;敲低PLK1水平后,采用CCK-8法检测HeLa细胞活性和生长抑制情况。结果 LAH4-L1-siPLK1纳米复合物可下调HeLa细胞PLK1约70%,并降低PLK1蛋白的表达,敲低PLK1后,可明显抑制HeLa细胞增殖。另外,LAH4-L1载体的基因递送效率能够稳定维持在较高水平。结论敲低HeLa细胞PLK1抑制癌细胞生长,LAH4-L1是一个较好的基因递送载体。     

基因的表达调控与Epigenetics

本文概述了ep igenetics的发展过程及其成京。Ep igenetics指的是基因表达改变的遗传物质变化,包括基因组和染色质(含组蛋白)的化学修饰,如DNA甲基化、乙酰化等等。其中甲基化所引起ep igenetics异常具有重要生理与病理生理学意义。影响基因表达调控与ep igenetics异常的研究对若干疾病(如癌症)的发生机制及探索治疗药物已获得可喜成果。     

骨组织工程中人骨髓间质干细胞动态种植和静态种植的比较研究

分别采用动态种植(旋转烧瓶法)和静态种植方法种植人骨髓间质干细胞,于种植后的两周内测定细胞-载体构件中DNA含量;利用组织学光镜和扫描电镜观察细胞的分布情况;运用荧光标记RT-PCR技术测定相关成骨基因的表达。构件中DNA含量测定表明,对于静态种植,当初始种植密度为每载体400×103(8.9×104/mm3)时,DNA的含量达到最高;在此基础上提高初始种植密度,并不能进一步提高构件DNA含量。光镜和扫描电镜观察可见动态种植后人骨髓间质干细胞在载体中的分布相对均匀,静态种植后细胞在载体中出现聚集现象;荧光标记RT-PCR证明,体外构件培养两周后,动态种植后的细胞-载体构件中有较多的成骨基因表达。提示人骨髓间质干细胞的静态种植效率较低;动态种植是一种优于静态种植的可行方法。     

复制子荧光素酶表达质粒pSVK-luc的构建与应用

目的 为研究复制子DNA疫苗在生物活体内的表达情况,构建含有荧光素酶报告基因的复制子表达质粒pSVK-luc.方法 PCR扩增荧光素酶报告基因,克隆入DNA复制子载体pSVK,酶切鉴定和测序分析筛选阳性重组质粒pSVK-luc;化学法转染人胚肾293T细胞,流式细胞术和免疫荧光法检测荧光素酶基因在293T细胞中的表达;利用基因电穿孔导入仪递送重组质粒至BALB/c小鼠股四头肌,活体成像仪动态观测荧光素酶基因在小鼠体内的表达.结果 pSVK-luc经相应酶切和测序鉴定,与预期设计完全一致.流式细胞术和免疫荧光检测均可见荧光素酶基因表达;同时活体成像仪也能检测到该基因在小鼠体内的表达.结论 pSVK-luc表达质粒的构建成功将为复制子DNA疫苗体内作用机制研究和体内电穿孔递送条件的优化奠定实验基础.     

抗体/腺病毒复合物为载体的基因定位递送

临床基因治疗方案中基因载体在疾病部位的靶向递送仍是急待解决的问题。本研究将腺病毒与一种生物素化的特异性抗腺病毒六邻体的多克隆IgG结合，固定于结合了亲和素的胶原蛋白膜上，成功获得腺病毒载体基因靶向定位递送体系。体外稳定性研究结果表明该体系中病毒载体可有效保持活性。通过这种特异性抗体偶联方式，将携带单纯疱疹胸苷激酶（HSVtk）编码基因片断的腺病毒结合在胶原膜上转染大鼠平滑肌细胞（A10），加入更昔洛韦（ganciclovir）后，只有生长在胶原膜上及膜邻近50μm内的细胞被杀死。在使用非特异性抗体的对照实验中，整个培养基范围内的细胞几乎全被杀死。以绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因对猪的心肌进行转基因实验，结果显示注射特异性抗体偶联病毒的胶原凝胶比直接注射病毒悬液获得更高效的心室基因表达。所有研究结果表明，通过生物素和特异性抗体使病毒载体固定在胶原蛋白基质上，可达到有效的局部定位基因表达，避免向非病灶部位的扩散，是基因治疗中一种极具发展潜力的载体定位递送方法。     

烷基化低分子量聚乙烯亚胺作为基因递送载体的初步研究

目的 考察烷基化低分子量聚乙烯亚胺作为基因递送载体的安全性和有效性。 方法 以1-溴十二烷和分子量为1800的分枝状 PEI （bPEI1.8K）为原料,合成 bPEI1.8K-C12,并用1H-NMR 对其结构进行确认;采用 MTT 法考察 bPEI1.8K-C12的细胞毒性;红细胞溶血实验考察 bPEI1.8K-C12的生物相容性;测定bPEI1.8K-C12/DNA 复合颗粒的粒径分布和 zeta 电位;采用激光共聚焦显微镜观察 bPEI1.8K-C12/DNA 复合颗粒的细胞摄取行为;采用琼脂糖凝胶阻滞电泳考察 bPEI1.8K-C12对DNA 的固缩能力;并用荧光素酶报告基因和绿色荧光蛋白报告基因考察 bPEI1.8K-C12的体外转染效率。 结果 经1H-NMR 确认,成功合成了 bPEI1.8K-C12;MTT结果表明 bPEI1.8K-C12对人乳腺癌 MCF-7细胞的毒性与bPEI1.8K 相当;红细胞溶血实验结果表明高浓度 bPEI1.8K-C12静脉注射时具有潜在溶血性;质量比相同时,bPEI1.8K-C12/DNA 复合颗粒的平均粒径和 zeta 电位均比相应的bPEI1.8K/DNA 大;烷基化修饰后,bPEI1.8K-C12对 DNA 的固缩能力降低,MCF-7细胞对 bPEI1.8K-C12/DNA 复合颗粒的摄取效率大大增加,bPEI1.8K-C12递送报告基因质粒的体外转染效率显著高于 bPEI1.8K,甚至与 lipofectamine2000相当。 结论 bPEI1.8K-C12是一种安全高效的基因递送载体,具有较高的进一步开发前景。     

基于中性粒细胞及其衍生的药物递送系统研究进展

中性粒细胞(NE)作为人体抵御病原体入侵的第一道防线, 在固有免疫中发挥重要作用。中性粒细胞的激活和浸润, 与许多炎症疾病和肿瘤的发生、发展密切相关。目前已有多项研究围绕中性粒细胞及其衍生物, 结合纳米技术设计药物递送系统。本综述主要介绍NE及其细胞膜仿生纳米载体、细胞外囊泡3种递送系统在炎症和肿瘤治疗中最新的研究进展。     

外泌体及其在炎症性肠病诊疗中的研究进展北大核心

外泌体是一种常见的膜结合的纳米级囊泡(直径30~150 nm),包含多种生物分子,如脂质、蛋白质、核酸等物质。外泌体通过胞吐作用从细胞中衍生出来,被靶细胞摄取,并可以在局部或远处的细胞之间传递生物信号。近年来研究表明,外泌体可通过免疫介导、屏障功能等多种途径影响炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)进程。该文综述了外泌体的产生、基本组成和功能,总结了不同成分和不同来源的外泌体在IBD中的诊断价值和治疗潜力,以及在疾病治疗中作为递送载体的新兴作用。     

BLM转染培养的Bloom综合征细胞可减少姐妹染色单体交换率至正常水平

隐性遗传病中 ,异常的细胞表型是由于缺乏正常的等位基因。这可以通过实验将正常等位基因导入突变细胞来纠正。当正常的等位基因表达 ,且其编码的蛋白产量足够多的情况下 ,异常的细胞表型能被纠正或逆转。隐性传递的 Bloom综合征 (BS)中异常体细胞表型特征产生于一种特殊类型的基因组不稳定性。其重要表现是高重组率和姐妹染色单体交换(SCE)数目的增加。 BLM是 Bloom综合征中突变的一种基因 ,编码 1 41 7个氨基酸的蛋白质 ,包括一个与 DNA解旋酶 Rec Q亚基同源的结构域。Rec Q基因在维持基因组稳定性的细胞机制中有一定作用。观察到 …     

纳米粒子-siRNA复合物抑制脐血树突状细胞SOCS1基因表达的实验研究

目的:构建复合纳米粒子载体,传递siRNA序列,抑制脐血树突状细胞SOCS1基因表达.方法:构建PEI包覆的以SiO2和Fe3O4为主要成分的复合纳米粒子载体,以LipofectamineTM2000为对照,琼脂糖凝胶电泳检测纳米粒子-siRNA的结合效率;荧光显微镜和流式细胞术检测纳米粒子-SOCS1-siRNA序列被细胞摄入的效率;Western blot检测纳米粒子-siRNA复合物转染脐血树突状细胞后对SOCS1基因表达的抑制.MTT法检测纳米粒子-SOCS1-siRNA处理的脐血DCs对肿瘤细胞的杀伤活性.结果:纳米粒子可以高效结合siRNA序列,纳米粒子-SOCS1-siRNA序列可被脐血树突状细胞摄取,但是单独的纳米粒子抑制SOCS1基因表达效率比较低,在外加磁场的作用下,基因沉默作用显著增强,抗肿瘤作用也相应提高.结论:纳米粒子载体传递siRNA安全性好,效率高,可以高效沉默脐血树突状细胞SOCS1基因表达,能为设计更有效的以树突状细胞为基础的抗肿瘤疫苗提供新思路和实验依据.     

CD4+CD28-T细胞DNA甲基化异常与免疫系统疾病的关系

在急性冠脉综合征(ACS)和一些自身免疫性疾病中发现CD4+ CD28-T细胞,该细胞具有细胞毒性,抵抗细胞凋亡和浸润组织能力.CD4+ CD28-T细胞内的DNA甲基化异常可导致一些基因的过度表达,与疾病的发生发展密切相关.深入研究CD4+ CD28-T细胞功能特性及CD4+CD28-T细胞内DNA甲基化在疾病中的作用,有利于阐明疾病的发病机制,为治疗疾病提供新的线索.     

RNA干扰MAGEA3对人肝癌细胞凋亡的影响

目的:探讨小发夹RNA(shRNA)载体介导抑制人肝癌细胞中黑色素瘤相关抗原A3(MAGEA3) 的表达和对肝癌细胞凋亡的影响。 方法:构建pSilencer－MAGEA3短发夹状siRNA真核基因表达载体，采用脂质体介导的方法将其转染到人肝癌细胞(mel-ed1)中，用Western印迹法、RT-PCR检测MAGEA3基因在肝癌细胞中的表达；通过原位末端标记TUNEL法、DNA片段化及Annexin V /PI双标记法检测，观察其对肝癌细胞凋亡的影响。 结果:成功构建pSilencer－MAGEA3短发夹状siRNA真核基因表达载体，转染特异性小发夹RNA质粒表达载体的MEL-ED1细胞中MAGEA3基因表达显著抑制(90%)。与对照组比较, pSilencer-MAGEA3转染组肝癌细胞培养 48 h 后,DNA片段化检测出“DNA ladder”、TUNEL法显示细胞典型凋亡特征, Annexin V /PI双标检测转染组细胞凋亡率为21.41%±1.98%,明显高于pSilencer-neo 空载体转染组和未转染组(P<0.01)。 结论:MAGEA3小发夹RNA质粒载体可显著抑制MEL-ED1细胞中的MAGEA3基因的表达,促进肝癌细胞的凋亡, MAGEA3基因具有抑制凋亡的作用。该研究为应用RNAi进行肿瘤的基因治疗提供了实验依据。     

非病毒、工程化人脂肪间充质干细胞产生BMP4可用于靶向性治疗脑肿瘤并延长患者生存期

正允许安全有效的非病毒纳米生物技术应用于基因治疗和细胞治疗是有利的,它可以用于治疗脑肿瘤等严重疾病。人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells,h AMSCs)显示出高的抗神经胶质瘤的趋向性,可以作为脑肿瘤靶向性治疗的递送载体。Mangraviti等的研究表明,与销售领先的商业试剂相比,非病毒、可生物降解的聚合纳米颗粒(nan-