TRIM31 过表达改善脂多糖诱导下神经细胞的炎症损伤

目的:探讨E3泛素连接酶31(TRIM31)对LPS诱导PC12细胞炎症性损伤的保护作用和机制。方法:用不同浓度LPS处理PC12细胞24 h,MTT法检测细胞增殖活性,Western blot检测LPS最佳浓度处理后PC12细胞TRIM蛋白表达水平。将TRIM31过表达质粒(pcDNA3.1-TRIM31)及其阴性对照质粒(pcDNA3.1-NC)转染至PC12细胞,qRT-PCR和Western blot检测细胞TRIM31 mRNA和蛋白表达水平。PC12细胞分为对照组(Control)、LPS组、LPS+NC组和LPS+TRIM31组,分组干预后,ELISA检测细胞上清IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18含量,流式细胞术检测细胞凋亡率,免疫荧光检测NLRP3蛋白表达,qRT-PCR检测NLRP3、caspase-1 mRNA表达,Western blot检测NLRP3、caspase-1、Cleaved-caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表达。结果:LPS剂量增加,PC12细胞增殖活性逐渐降低(P0.05),LPS处理可降低PC12细胞TRIM31蛋白表达水平(P0.01),TRIM31过表达,PC12细胞TRIM31 mRNA和蛋白表达水平显著提高(P0.05)。与Control组相比,LPS组细胞上清中IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18含量、细胞凋亡率及细胞Cleaved-caspase-3和Bax蛋白水平显著提高(P0.05),Bcl-2和TRIM31蛋白水平显著降低(P0.05),NLRP3蛋白荧光强度及NLRP3、caspase-1 mRNA和蛋白表达水平显著提高(P0.05);与LPS组相比,LPS+TRIM31组细胞上清中IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18含量、细胞凋亡率及细胞Cleaved-caspase-3和Bax蛋白水平显著降低(P0.05),Bcl-2蛋白水平显著提高(P0.05),NLRP3荧光强度及NLRP3、caspase-1 mRNA和蛋白表达水平显著降低(P0.05)。结论:过表达TRIM31能通过抑制NLRP3炎症小体活化,改善LPS诱导的PC12细胞炎症损伤。     

外源性硫化氢对肝细胞NLRP3炎症小体的影响

目的:研究外源性硫化氢(H_2S)对人肝细胞NLRP3炎症小体的影响。方法:采用不同浓度的脂多糖(LPS)诱导人肝细胞L02和SMMC-7721建立炎症模型,Western blot检测细胞中NLRP3炎症小体的表达并结合细胞毒性实验(MTT法)确定合适的LPS浓度。细胞分为4组:对照组用普通培养基培养18.5 h;LPS组用普通培养基培养0.5 h后,再用100μg/L LPS刺激18 h;LPS+H_2S组和H_2S组用200μmol/L硫氢化钠(Na HS)刺激0.5 h后,再分别用100μg/L LPS和普通培养基培养18 h。各组处理后分别收集细胞,Western blot检测细胞中NLRP3和caspase-1的蛋白表达量。结果:与对照组相比,LPS组细胞内NLRP3和caspase-1的表达增加(P0.05),H_2S组细胞内的NLRP3和caspase-1表达无明显变化;与LPS组相比,LPS+H_2S组细胞内的NLRP3和caspase-1表达减少(P0.05)。结论:外源性H_2S可抑制人肝细胞中NLRP3炎症小体的表达。     

木香烃内酯通过抑制NLRP3 缓解LPS 诱导小鼠巨噬细胞的炎症反应

目的:探讨木香烃内酯(Cos)对脂多糖(LPS)诱导的小鼠原代巨噬细胞炎性小体激活和炎症反应的影响。方法:提取并培养小鼠腹腔原代巨噬细胞,用不同浓度Cos预处理巨噬细胞1 h后,1 mg/L LPS处理,分为空白对照组、模型组(单用LPS)、不同浓度(5、10和20μmol/L) Cos+LPS组; ELISA法检测培养液上清中TNF-α/IL-6的含量,q PCR法检测TNF-α/IL-6 mRNA表达;为明确Cos对LPS诱发的炎症反应的保护机制,增加NLRP3抑制剂MCC950组(10μmol/L),LPS刺激4h、6 h,Western blot检测NLRP3、ERK及IκB的激活,细胞免疫荧光实验观察NLRP3的蛋白水平。结果:与LPS组比较,LPS+Cos组TNF-α/IL-6的mRNA表达及细胞培养液上清TNF-α/IL-6分泌均显著降低(P 0. 05); Western blot和细胞免疫荧光实验结果表明,与LPS组比较,LPS+Cos组的NLRP3蛋白水平显著降低,其抑制效果与NLRP3抑制剂MCC950相当(P 0. 05); Western blot结果表明,与LPS组比较,LPS+MCC950组和LPS+Cos组的ERK及IκB的激活均显著降低(P 0. 01)。结论:Cos能有效抑制LPS诱导的巨噬细胞炎性小体和NF-κB的激活而缓解炎症反应。     

LPS与ATP共同诱导小鼠原代腹腔巨噬细胞焦亡模型的建立

目的：探索脂多糖（LPS）和三磷酸腺苷（ATP）共同诱导小鼠原代腹腔巨噬细胞焦亡模型的最佳条件。方法：采用流式细胞仪F4/80和CD-11b染色检测巨噬细胞纯度,Annexin V-PE/7-AAD双染色法筛选出LPS和ATP共同诱导细胞焦亡的最适浓度及时间。巨噬细胞随机分为control组、LPS组、ATP组和LPS+ATP组;Western blot检测GSDMD、caspase-1、caspase-11、NLRP3、ASC、pro-IL-1β、pro-IL-18和HMGB1蛋白表达水平;ELISA检测培养上清中IL-1β和TNF-α表达水平;透射电镜（TEM）和扫描电镜（SEM）观察巨噬细胞焦亡形态。结果：巨噬细胞的纯度达到90%;500 ng/ml LPS 24 h+5 mmol/L ATP 4 h为诱导巨噬细胞焦亡的最佳组合方式;LPS+ATP组的GSDMD、caspase-1、caspase-11、NLRP3、ASC、pro-IL-1β、pro-IL-18和HMGB1的蛋白表达量明显高于对照组（P<0.05）;培养上清中IL-1β和TNF-α表达量显著高于对照组（P&...     

PTEN抑制剂BPV通过下调细胞焦亡水平改善LPS诱导的急性肺损伤

目的：探究第10号染色体丢失的张力蛋白同源磷酸酶基因(PTEN)抑制剂过氧化氢氧化矾酸钾(BPV)对脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤(ALI)的影响及作用机制。方法：将60只雄性C57BL/6小鼠按随机数字表法分为假手术组(Sham组)、BPV组、LPS组和BPV+LPS组，其中又将LPS组分为LPS刺激后6 h、12 h、24 h、48 h组；Western blot检测LPS各组小鼠肺组织中PTEN蛋白表达变化；检测小鼠肺组织湿/干重(W/D)，分析Sham组，BPV组、LPS组及BPV+LPS组小鼠肺组织水肿情况；HE染色观察4组小鼠肺组织病理学改变；ELISA和流式细胞术分别检测4组小鼠肺组织灌洗液(BALF)中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的表达水平及巨噬细胞数量变化；组织免疫荧光染色检测各组小鼠肺泡巨噬细胞中pyrin结构域NLRP3表达；Western blot检测4组小鼠肺组织中NLRP3介导的焦亡途径中NLRP3、caspase-1 p10、ASC和GSDMD p30蛋白表达及PTEN/Akt/NF-κB信号通路中PTEN蛋白、Akt^s...     

丹皮酚对β-1,3-葡聚糖诱导的小鼠巨噬细胞Dectin-1 / NLRP3 信号通路抑制作用研究

目的:研究丹皮酚对β-1,3-葡聚糖诱导的巨噬细胞上Dectin-1/NLRP3信号通路的影响。方法:培养小鼠RAW264.7巨噬细胞,并分成空白对照组、β-1,3-葡聚糖诱导模型组、昆布多糖组和丹皮酚组,β-1,3-葡聚糖诱导巨噬细胞24 h建立ALD炎症模型。通过MTT法检测细胞活性,通过倒置显微镜观察各组形态学变化,通过Western blot检测小鼠RAW264.7巨噬细胞Dectin-1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1蛋白的表达,通过RT-qPCR检测小鼠RAW264.7巨噬细胞Dectin-1、NLRP3、caspase-1 mRNA的表达,通过ELISA检测各组培养液中IL-1β、IL-18的分泌水平。结果:MTT结果表明,与空白对照组相比,β-1,3-葡聚糖诱导模型组抑制细胞增殖活性减弱。与β-1,3-葡聚糖诱导模型组相比,丹皮酚干预后细胞增殖活性增强。形态学观察发现,空白对照组细胞体积小,形态圆润。β-1,3-葡聚糖诱导后细胞体积变大,分化严重,形态狭长。丹皮酚干预后细胞分化减轻,细胞形态近似圆形。Western blot、RT-qPCR和ELISA结果表明,与空白对照组相比,β-1,3-葡聚糖能显著升高巨噬细胞中Dectin-1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1的蛋白表达水平和Dectin-1、NLRP3、caspase-1 mRNA表达水平以及细胞上清液IL-1β、IL-18的分泌水平。而与β-1,3-葡聚糖诱导模型组相比,经丹皮酚干预后可明显降低巨噬细胞中Dectin-1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1的蛋白表达水平和Dectin-1、NLRP3、caspase-1 mRNA表达水平以及细胞上清液IL-1β、IL-18的分泌水平。结论:本研究结果表明丹皮酚可能通过抑制β-1,3-葡聚糖诱导的Dectin-1/NLRP3信号通路上Dectin-1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1的过表达从而有效降低终末炎症因子IL-1β及IL-18的释放,进而有效抑制β-1,3-葡聚糖诱导的ALD炎症反应。     

异丙酚通过NLRP3/IL-1β信号通路影响脂多糖诱导的肺泡巨噬细胞M1/M2表型分化

目的研究异丙酚对脂多糖诱导的肺泡巨噬细胞的免疫应答影响及相关机制进行初步探讨。方法分离大鼠原代肺泡巨噬细胞(AMs),并将细胞分为4组:对照组(control组:常规培养AMs),脂多糖组(LPS组:加入终质量浓度为1 000 ng/L脂多糖),异丙酚组(P组:加入终浓度为25μmol/L异丙酚),脂多糖+异丙酚组(LPS+P组:加终质量浓度为1 000 ng/L的LPS和25μmol/L异丙酚)。4组细胞常规培养24 h后,应用ELISA检测4组细胞培养上清液中IL-1β、IL-10、TNF-α的含量;细胞流式实验检测4组细胞表面F4/80、CD16/32、CD206分子表型所占比例;免疫磁珠分选F4/80+细胞,并利用RT-PCR检测细胞中iNOS、CD206的mRNA表达变化;最后应用RT-PCR及Western blot实验检测4组细胞中NLRP3/IL-1β信号通路中NLRP3、IL-1β及Caspase-1的mRNA及蛋白表达变化。结果 ELISA实验显示,异丙酚能够明显抑制LPS所诱导的AMs对促炎因子IL-1β、TNF-α的分泌,且促进细胞对抑炎因子IL-10的分泌;细胞流式及RT-PCR实验结果显示,异丙酚能够明显抑制LPS所诱导的AMs向M1型巨噬细胞分化,并促进细胞向M2型巨噬细胞分化;RT-PCR及Western blot实验结果显示,异丙酚能够明显抑制LPS所诱导的AMs中NLRP3/IL-1β信号通路中NLRP3、IL-1β及Caspase-1的m RNA及蛋白表达。结论异丙酚能够通过下调NLRP3/IL-1β信号通路抑制LPS所诱导的AMs向M1表型的分化,并促进细胞向M2表型的分化。     

过表达PGRN抑制LPS诱导的肺泡上皮细胞损伤

目的:探讨颗粒体蛋白前体(progranulin,PGRN)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的人肺泡上皮A549细胞和HPAEpi C细胞增殖、凋亡及炎症的影响。方法:实验分为4组:对照(control)组为正常培养的细胞;LPS组用LPS(10 mg/L)处理;PGRN+LPS组在转染pc DNA3.1-PGRN质粒后加入LPS处理;pc DNA3.1+LPS组在转染pc DNA3.1-EGFP质粒后加入LPS处理。MTT试剂盒检测细胞活力;Brd U掺入实验检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡率;RT-q PCR和Western blot分别检测PGRN的mRNA和蛋白表达;Western blot检测caspase-3、Bcl-2、Bax、IL-1β、IL-6、TNF-α、p65和p-IκB-α的蛋白水平。结果:与对照组相比,LPS组的细胞增殖率下降(P0.05),凋亡率上升(P0.05),caspase-3和Bax的蛋白表达上调(P0.05),Bcl-2的蛋白表达下调(P0.05),IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表达上调(P0.05),p65和p-IκB-α的蛋白水平增加(P0.05),与LPS组相比,PGRN+LPS组的细胞增殖率上升(P0.05),凋亡率下降(P0.05),caspase-3和Bax的蛋白表达下调(P0.05),Bcl-2的蛋白表达上调(P0.05),IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表达下调(P0.05),p65和p-IκB-α的蛋白水平降低(P0.05)。结论:PGRN过表达可以减轻LPS诱导的A549细胞和HPAEpi C细胞增殖、凋亡异常及炎症因子产生等损伤,这可能与PGRN参与调控NF-κB信号通路有关。     

黄芩苷对NLRP3炎症小体活化和细胞焦亡的抑制作用及其机制研究

目的以LPS致敏的小鼠巨噬细胞(J774A.1或者腹腔巨噬细胞)作为细胞模型,探讨黄芩苷对ATP诱导的炎症小体活化和细胞焦亡的影响及其机制。方法 C57BL/6小鼠腹腔注射30 g·L-1巯基乙酸盐培养基诱导大量腹腔巨噬细胞产生;利用LPS致敏巨噬细胞,再以ATP激活NLRP3炎症小体;采用免疫印迹法检测细胞裂解物和培养上清液中IL-1β、caspase-1、HMGB1等蛋白的表达水平;以基于微球的免疫测定法(CBA)检测细胞培养上清液中IL-1β的水平;碘化丙锭(PI)染色法检测黄芩苷对LPS+ATP诱导的细胞焦亡的影响。结果黄芩苷处理能剂量依赖性地抑制LPS+ATP刺激下巨噬细胞中caspase-1的活化,成熟IL-1β(Mr17 000)和HMGB1的释放;同时,黄芩苷也能明显抑制LPS+ATP诱导的小鼠巨噬细胞发生焦亡。腺苷酸环化酶抑制剂MDL12330A和蛋白激酶A(PKA)抑制剂H89可以明显逆转黄芩苷对ATP诱导的细胞焦亡的抑制作用。结论黄芩苷可能通过影响巨噬细胞中PKA的活性,进而抑制NLRP3炎症小体活化与细胞焦亡。     

雪胆乙素通过抑制小鼠巨噬细胞中AMPK活性抑制NLRP3炎症小体活化和细胞焦亡

目的 本研究旨在探索雪胆乙素对ATP诱导的炎症小体活化和细胞焦亡的影响,并探讨其潜在的作用机制。方法利用第一信号（LPS）刺激巨噬细胞,再以第二信号（ATP）激活NLRP3炎症小体;采用Western blot检测caspase-1、GSDMD等蛋白的表达水平;ELISA检测细胞培养上清液中IL-1β的水平;免疫荧光染色检测雪胆乙素对LPS+ATP诱导的ASC斑点形成的影响;碘化丙锭（PI）染色法检测细胞死亡。结果 我们发现雪胆乙素处理能够抑制ATP诱导的巨噬细胞中ASC斑点的形成,并抑制LPS+ATP刺激下巨噬细胞中caspase-1的切割及活化;进一步抑制成熟IL-1β释放至培养液上清中;同时,雪胆乙素也能够明显抑制巨噬细胞中GSDMD-NT的形成以及细胞焦亡。另外,雪胆乙素能够抑制AMPK的磷酸化,而AMPK的激动剂AICAR促进成熟IL-1β的释放,以及可以明显逆转雪胆乙素对ATP诱导的细胞焦亡的抑制作用。结论 雪胆乙素可能通过抑制巨噬细胞中AMPK的活性而抑制NLRP3炎症小体活化与细胞焦亡。     

沉默NLRP3炎性小体表达降低香烟烟雾提取物导致的人肺动脉内皮细胞凋亡

目的探讨NLPR3炎性小体(含NLR家族pyrin结构域蛋白3)对香烟烟雾提取物(CSE)诱导人肺动脉内皮细胞(HPAECs)凋亡的影响。方法用NLRP3 siRNA和NC siRNA(阴性对照)分别转染HPAECs后(分别为siNLRP3组、siNC组),再以10%CSE刺激12 h,应用annexin V/PI流式法检测这两组细胞在CSE刺激前后的凋亡水平。再将HPAECs分为对照(control)组、CSE组(加入10%CSE液)、NAC(乙酰半胱氨酸,N-acetylcysteine)+CSE组(以10 mmol/L NAC预处理1h后再以10%CSE培养液处理)及NAC组(以10 mmol/L NAC单独处理),均培养12 h后以DCFH-DA光探针标记法观察细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS),Western blot法测定NLRP3、caspase-1蛋白表达。结果siNC组在CSE刺激后,HPAECs存活率下降,凋亡率较CSE刺激前明显增加(P<0.05),SiNLRP3组在CSE刺激后,细胞凋亡率较siNC组同等CSE刺激后有所减少(P<0.05)。分组处理HPAECs后,CSE组细胞胞内ROS水平较对照组升高(P<0.05),NAC+CSE组细胞胞内ROS水平较CSE组有所下降(P<0.05)。CSE组NLRP3、caspase-1蛋白表达较对照组显著升高(P<0.05),而NAC+CSE组细胞NLRP3、caspase-1表达较CSE组下降(P<0.05)。结论CSE能诱导HPAECs发生凋亡及胞内ROS增加,伴有NLRP3炎性小体表达增加。NLRP3蛋白表达沉默能抑制CSE对HPAEC的促凋亡作用。     

阿托伐他汀通过下调NLRP1炎性体表达抑制IL-1β和IL-18的释放

 目的:探讨核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白1(NLRP1)炎性体在阿托伐他汀抑制THP-1巨噬细胞白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-18(IL-18)分泌中的作用。方法:用10 μg/L脂多糖诱导THP-1巨噬细胞分泌IL-1β和IL-18,以不同浓度阿托伐他汀(1、10和20 μmol/L)孵育细胞24 h,或以10 μmol/L阿托伐他汀处理细胞不同时间(12、24和48 h),或转染NLRP1 siRNA以沉默细胞内NLRP1的表达。采用RT-PCR检测细胞内NLRP1炎性体mRNA的表达,Western blot检测细胞内NLRP1炎性体蛋白的表达,ELISA检测细胞上清液中IL-1β和IL-18的含量。结果:阿托伐他汀可抑制THP-1巨噬细胞NLRP1炎性体mRNA和蛋白的表达,且这种效应呈浓度和时间依赖性。转染NLRP1 siRNA后,THP-1巨噬细胞NLRP1的蛋白表达明显下降,且阿托伐他汀对IL-1β和IL-18分泌的抑制作用明显增强。结论:阿托伐他汀通过抑制NLRP1炎性体表达减少巨噬细胞IL-1β和IL-18的释放,发挥抗炎作用,进而延缓动脉粥样硬化进展。     

SGK1抑制剂EMD638683对膀胱出口梗阻小鼠肾组织细胞焦亡的作用及机制研究

目的:确定小鼠膀胱出口梗阻(bladder outlet obstruction,BOO)模型引起下尿路梗阻介导的肾脏炎性损伤;研究血清和糖皮质激素调节激酶1(serum and glucocorticoid-regulated kinase 1,SGK1)抑制剂EMD638683抗梗阻性肾病炎症的作用机制,探讨SGK1与NLRP3-caspase-1-IL-1β/细胞焦亡(pyroptosis)通路诱导细胞损伤的关系。方法:构建小鼠BOO模型,HE染色观察肾组织病理变化及炎症细胞浸润,PAS染色观察肾脏的组织病变,Masson染色法检测肾小管的胶原沉积,免疫组化法和Western blot法检测NLRP3、caspase-1、F4/80、gasdermin D-N末端片段(GSDMD-N)、IL-1β和SGK1的表达。醛固酮(aldosterone,ALD)处理小鼠肾小管上皮细胞(mouse renal tubular epithelial cells,mRTECs),EMD638683进行干预,Western blot法检测NLRP3、caspase-1、IL-1β、SGK1及GSDMD-N的表达水平;ELISA法检测各组细胞上清液IL-1β含量。结果:梗阻3周的小鼠肾脏中HE染色观察到炎症细胞浸润,PAS染色出现肾脏组织病变,Masson染色检测到肾小管间质有胶原沉积。与正常组小鼠比较,梗阻3周小鼠组NLRP3、caspase-1、F4/80、GSDMD-N、IL-1β和SGK1含量显著升高(P<0.05或P<0.01)。细胞实验中,与正常组比较,ALD组NLRP3、caspase-1、IL-1β、SGK1及GSDMD-N含量显著升高(P<0.05或P<0.01);与ALD组相比,ALD加EMD638683组NLRP3、caspase-1、IL-1β、SGK1及GSDMD-N含量显著减少(P<0.05或P<0.01)。结论:成功构建小鼠BOO模型引起下尿路梗阻介导的肾脏炎性损伤;EMD638683通过抑制NLRP3-caspase-1-pyroptosis通路阻断细胞焦亡,从而发挥抗炎作用。     

miR-133靶向NLRP3对小鼠Kupffer细胞炎性活化的影响

目的:探究微小RNA-133(miR-133)靶向核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)对小鼠库普弗(Kupffer)细胞(KCs)炎症活化的影响。方法:从小鼠肝脏中分离KCs并鉴定。鉴定成功后用1 mg/L脂多糖(LPS)诱导KCs,并分别转染miR-133 inhibitor和miR-133 mimic。采用RT-qPCR检测细胞中miR-133和NLRP3的mRNA水平;ELISA法检测细胞培养液中白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平;Western blot实验检测细胞中NLRP3、含胱天蛋白酶募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和胱天蛋白酶1(caspase-1)蛋白水平;TargetScan查找NLRP3 mRNA的3’UTR与miR-133的结合位点,并经双萤光素酶报告基因检测试剂盒鉴定。结果:72 h时KCs体积较24 h时大,边界清晰,形态基本稳定;碳素墨水实验观察到细胞中有大量黑色颗粒,证明该细胞有较强的吞噬能力,为KCs。1 mg/L LPS诱导后KCs中miR-133水平降低,NLRP3 mRNA和蛋白、caspase-1蛋白及细胞培养液中IL-1β和TNF-α水平升高(P<0.05)。转染miR-133 inhibitor后细胞中miR-133水平降低,细胞中NLRP3mRNA和蛋白、caspase-1蛋白及细胞培养液中IL-1β和TNF-α水平升高(P<0.05);转染miR-133 mimic后细胞中miR-133水平升高,细胞中NLRP3 mRNA和蛋白、caspase-1蛋白及细胞培养液中IL-1β和TNF-α水平降低(P<0.05)。TargetScan分析显示,NLRP3 mRNA的3’UTR含有miR-133序列保守碱基。转染miR-133 mimic的细胞萤光素酶相对活性下降(P<0.05)。结论:miR-133可通过靶向NLRP3减轻小鼠KCs炎症,实现对KCs的保护。     

LPS联合z-VAD-FMK介导IFN-γ预处理巨噬细胞发生程序性坏死

目的:探讨脂多糖(LPS)联合z-VAD-FMK介导M1亚型巨噬细胞程序性坏死的机制。方法:使用佛波酯(PMA)和干扰素γ(IFN-γ)诱导THP-1细胞系分化得到M0和M1亚型巨噬细胞。以LPS(100μg/L)分别处理M0和M1巨噬细胞,检测不同时点的乳酸脱氢酶释放和DNA断裂情况,并观察不同抑制剂的影响。采用Western blot法检测受体相互作用蛋白(RIP)1、RIP3、细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、P38和NOD样受体蛋白3(NLRP3)的蛋白水平。结果:LPS能够诱导M1亚型巨噬细胞发生死亡,联合z-VAD-FMK可特异性介导M1亚型巨噬细胞发生程序性坏死,而对M0亚型巨噬细胞无此作用。IFN-γ能够上调RIP3表达,并增强LPS介导的JNK磷酸化,RIP3和JNK抑制剂可部分阻断LPS联合z-VAD-FMK介导的M1亚型巨噬细胞程序性坏死。结论:IFN-γ上调RIP3和增强LPS介导的JNK磷酸化,使得LPS联合z-VAD-FMK能特异性诱导经过IFN-γ预处理的巨噬细胞发生程序性坏死。     

全氟辛烷磺酸通过NLRP3炎症小体诱导幼年期大鼠肺损伤及格列本脲干预的研究

目的:探讨含NLRP3家族Pyrin域蛋白3(NLRP3)炎症小体参与全氟辛烷磺酸(PFOS)诱导幼年期大鼠肺损伤的可能机制。方法:28只21日龄SD大鼠随机分为对照(C)组、PFOS(P)组、格列本脲(G)组和格列本脲+PFOS(GP)组。将实验动物根据不同分组建立PFOS暴露模型和格列本脲保护模型,留取肺标本进行HE染色,ELISA法检测肺组织中髓过氧化物酶(MPO)含量以及支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞介素1β(IL-1β)和IL-18含量,高效液相色谱法(HPLC)检测血清中PFOS浓度,Western blot法检测肺组织中NLRP3、caspase-1和含CARD凋亡相关斑点样蛋白(ASC)的蛋白水平。结果:肺组织病理切片HE染色结果显示,与C组相比,P组的气管及肺泡间质可见明显炎症浸润;格列本脲可使炎症反应显著减轻。ELISA结果显示,P组肺组织中MPO含量较C组显著升高(P<0.05),P组BALF中的IL-1β和IL-18含量较C组也明显升高(P<0.05);GP组肺组织MPD含量及BALF中IL-1β和IL-18含量均较P组降低(P<0.05)。Western blot结果显示,P组的NLRP3、caspase-1及ASC蛋白表达量较对照组均显著升高(P<0.01);格列本脲可使NLRP3、caspase-1及ASC蛋白表达水平降低(P<0.05)。免疫组化结果提示,P组的NLRP3蛋白表达水平较其余3组均显著升高(P<0.01)。结论:PFOS暴露可能通过激活NLRP3炎症小体,继而引发炎症反应,释放IL-1β等炎症因子导致大鼠肺损伤。格列本脲可以通过特异性抑制NLRP3炎症小体的组装,抑制炎症反应,减轻PFOS诱导的肺损伤。     

SO_2衍生物通过NLRP3炎症小体促进气道上皮细胞炎症发生

目的:观察二氧化硫(SO_2)衍生物亚硫酸钠和亚硫酸氢钠对支气管上皮细胞NLRP3炎症小体活化的影响。方法:使用不同浓度的SO_2衍生物作用于支气管上皮细胞16HBE,通过流式细胞术检测细胞内活性氧簇(ROS)的生成,Western blot检测细胞内NLRP3和caspase-1 p20蛋白水平,ELISA检测细胞上清中白细胞介素1β(IL-1β)的分泌水平,结合细胞毒性实验(MTT)确定2 mmol/L为SO_2衍生物的实验浓度。采用RNA干扰技术沉默16HEB细胞NLRP3基因及ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理16HBE细胞,通过流式细胞术检测细胞内ROS, Western blot和ELISA分别检测NLRP3和caspase-1 p20蛋白表达及IL-1β分泌水平。结果:与对照组比较, 2 mmol/L和4 mmol/L SO_2衍生物组细胞内ROS水平、 NLRP3和caspase-1 p20蛋白表达及细胞上清液中IL-1β水平明显升高(P0.05)。与2 mmol/L SO_2衍生物组比较,NLRP3 siRNA组细胞内的NLRP3和caspase-1 p20蛋白水平明显降低(P0.05),且细胞上清液中IL-1β的浓度明显下降(P0.05),ROS无明显变化;NAC组NLRP3和caspase-1 p20蛋白水平及IL-1β浓度均明显下降(P0.05)。结论:SO_2衍生物激活支气管上皮细胞NLRP3炎症小体,促进IL-1β生成。     

丰富环境通过抑制NOD样受体蛋白3炎性小体活化缓解脂多糖小鼠的认知障碍

目的探讨丰富环境(EE)对脂多糖(LPS)诱导的小鼠认知功能障碍的影响及其可能机制。方法36只3周龄昆明小鼠进行8周的EE刺激或者标准环境(SE)饲养后分为以下3组:标准环境+生理盐水(SE+NS)组、标准环境+脂多糖(SE+LPS)组及丰富环境+脂多糖(EE+LPS)组。采用旷场实验检测小鼠的活动度;新旧事物识别实验检测小鼠认知功能;免疫组织化学方法检测小胶质细胞标记物离子钙接头蛋白分子1(IBA1)表达;Western blotting方法检测海马组织小胶质细胞激活标记物CD68及NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor protein3,NLRP3)炎性小体相关蛋白的表达。结果旷场实验中,各组小鼠穿越的总格数无明显差异。在新旧事物识别实验中,与SE+NS组相比,SE+LPS组新事物辨别指数明显下降(P<0.05);与SE+NS组相比,小胶质细胞标记物IBA1表达上调(P<0.05);SE+LPS组海马CD68及NLRP3炎性小体相关蛋白的表达明显上调(P<0.05);而丰富环境可以逆转上述改变(P<0.05)。结论丰富环境可缓解脂多糖诱导的认知功能损伤,其机制可能与抑制海马小胶质细胞激活及NLRP3炎性小体的产生有关。