miR-1247-5p对Smad2基因的靶向调控作用

目的利用miR-1247-5p过表达模拟物mimics,研究miR-1247-5p对TGF-β信号通路中关键蛋白Smad2的靶向调控作用。方法合成模拟miR-1247-5p过表达的模拟物mimics,及抑制miR-1247-5p表达的抑制物inhibitors;同时构建与miR-1247-5p互补靶基因Smad2的3'非翻译区,将其克隆到线性化的Report荧光报告载体中。将测序鉴定阳性的report-Smad2 3'-UTR重组质粒,与miR-1247-5p的mimics/inhibitors共转染至HEK-293T细胞,通过relative luciferase activity实验验证靶向关系,并通过Western blot实验进一步检测Smad2蛋白表达水平。结果成功构建report-Smad2 3'-UTR重组质粒,Western blot实验表明转染miR-1247-5p mimics组中Smad2蛋白表达下调(P0.05);而转染miR-1247-5p inhibitors组中,Smad2蛋白表达上调(P0.05)。结论证实miR-1247-5p直接靶向TGF-β信号通路中关键蛋白Smad2的表达,在蛋白水平对其进行调控,为进一步研究miRNA在细胞通路中的调控作用提供了依据。     

miR-183-5p对2型糖尿病小鼠胰岛素抵抗的影响及机制

目的 探究miR-183-5p对2型糖尿病小鼠胰岛素抵抗的改善作用及可能机制.方法 30只SPF级C57BL/6N雄性小鼠随机分对照组(Control)、胰岛素抵抗组(IR)和agomiR组,每组10只.检测各组小鼠空腹血糖、葡萄糖耐量和胰岛素耐量;生物信息学预测miR-183-5p靶基因,并通过双荧光素酶报告基因实验验证;Real-time qPCR检测肝组织EGR1 mRNA表达;Western blot检测肝组织EGR1蛋白表达.结果 过表达miR-183-5p降低胰岛素抵抗小鼠血糖,改善小鼠葡萄糖耐受能力和对胰岛素敏感性;EGR1是miR-183-5p的下游靶基因,过表达miR-183-5p降低胰岛素抵抗小鼠肝组织EGR1 mRNA和蛋白表达水平.结论 miR-183-5p增加胰岛素抵抗小鼠胰岛素敏感性,其机制可能与靶向抑制EGR1表达有关.     

miR-17-5p 靶向MICB 减弱NK 细胞对肝癌细胞的毒性作用

目的:探讨miR-17-5p 在肝细胞癌(HCC)HepG2 细胞对NK 细胞介导的细胞毒性敏感性中的调控作用。方法:使用含野生型MICB 基因3忆UTR 序列、突变型MICB 基因3忆UTR 序列、miR-17-5p mimic 序列、miR-17-5p-NC 序列、anti-miR-17-5p 序列的质粒载体分别或共转染HCC HepG2 细胞,使用丙戊酸钠处理转染或未转染细胞。应用荧光素酶活性测定检测miR-17-5p 对MICB 的调控作用。应用实时荧光定量PCR 或蛋白免疫印迹检测细胞或组织中miR-17-5p 及MICB mRNA 和蛋白表达情况。结果:淤与miR-17-5p-NC 组相比,miR-17-5p-mimic 组HepG2 细胞中miR-17-5p 表达水平显著升高,MICB mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P<0.05);与anti-miR-17-5p-NC 组相比,anti-miR-17-5p 组HepG2 细胞中miR-17-5p 表达水平均显著降低,MICB mRNA 和蛋白表达水平均显著增加(P<0’05)。与miR-17-5p-NC+MICB 3’UTR-Wt 组相比,miR-17-5p-mimic+MICB 3’-UTR-Wt 组荧光素酶活性显著降低(P<0.05)。miR-17-5p-NC+MICB 3’UTR-Mut 组与miR-17-mimic+MICB 3’-UTR-Mut组的荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05)。于与对应癌旁非肿瘤组织相比,miR-17-5p 在HCC 组织中的表达水平显著增加,而MICB 蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。miR-17-5p 和MICB 蛋白的表达与肿瘤直径、远处转移、TNM 分期、分化程度等临床病理特征有关(P<0.05)。在HCC 肿瘤组织中miR-17-5p 与MICB 蛋白表达水平呈明显负相关(P<0.05)。 与miR-17-5p-NC 组相比,miR-17-5p-mimic 组MICB 蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。与miR-17-5p-mimic+MICB 3’UTR-Mut组相比,miR-17-5p-mimic+MICB-3’UTR-Wt 共转染组中NK 细胞毒性和MICB 蛋白表达水平均显著增加(P 均<0.05)。与anti-miR-17-5p-NC 组相比,anti-miR-17 组NK 细胞毒性和MICB 蛋白表达水平均显著增加(P 均<0.05)。 与丙戊酸钠+miR-17-5p-NC 组相比,丙戊酸钠+miR-17-5p-mimic 组细胞中MICB 表达水平显著降低(P<0.05)。在不同效靶比时,与Ctrl 组相比,丙戊酸钠组NK 细胞毒性显著增加(P<0.05)。与丙戊酸钠+miR-17-5p-NC 组相比,丙戊酸钠+miR-17-5p-mimic 组NK 细胞毒性显著降低(P<0.05)。结论:miR-17-5p 通过靶向MICB 降低HepG2 细胞对NK 细胞介导的细胞毒性敏感性,从而抑制NK 细胞对肝癌细胞的毒性。     

羽扇豆醇联合miR-145-5p对前列腺癌细胞增殖与凋亡的影响

目的:探讨羽扇豆醇(lupeol)联合微小RNA-145-5p(miR-145-5p)对前列腺癌细胞株LNCaP增殖与凋亡的影响。方法:将hsa-miR-145-5p和lupeol作用于LNCaP细胞24、48和72 h后用MTT法检测细胞活力抑制率;PI单染流式细胞术检测细胞周期;annexin V/PI双染流式细胞术和TUNEL实验检测细胞凋亡;Transwell法检测细胞迁移和侵袭;划痕愈合实验检测细胞迁移能力;细胞集落形成实验计算集落形成抑制率。结果:细胞对照组、非特异性对照组和溶剂组未出现有效的LNCaP细胞活力抑制、迁移抑制和侵袭抑制,而hsa-miR-145-5p组和lupeol组细胞活力、迁移和侵袭受到显著抑制,并出现早期凋亡;联合用药(hsa-miR-145-5p+lupeol)组比单独用药组出现更有效的生长抑制作用。结论:hsa-miR-145-5p和lupeol均可抑制LNCaP细胞增殖、迁移和侵袭,并诱导体外早期凋亡;lupeol可增强hsa-miR-145-5p对LNCaP细胞的抑增殖和促凋亡作用。     

miR-212-5p在肝癌组织中的表达及对HepG2细胞增殖、侵袭及迁移的影响

目的 探讨miR-212-5p在肝癌组织中的表达及对HepG2细胞增殖、侵袭及迁移的影响。方法应用qRT-PCR法检测96例肝癌组织及癌旁组织中miR-212-5p表达水平,同时设HepG2细胞组、miR-212-5pmimics组与miR-212-5pinhibitor组。培养72h后,采用MTT法检测细胞活力;流式细胞仪检测细胞凋亡水平;Transwell实验和划痕实验检测细胞侵袭与迁移水平;qRT-PCR法检测细胞miR-212-5p表达水平。结果 肝癌组织中miR-212-5p表达水平升高,肿瘤最大径≥2cm、TNM分期越高、浸润深度越深、病理级别越低、有淋巴结转移、有复发的肝癌患者miR-212-5p高表达率更高（P<0.05）。miR-212-5p模拟物能增强HepG2细胞增殖、侵袭及迁移能力,抑制HepG2细胞凋亡（P<0.05）;miR-212-5p抑制剂能抑制HepG2细胞活力、增殖、侵袭及迁移能力,促进HepG2细胞凋亡（P<0.05）。结论 miR-212-5p在肝癌组织中高表达,miR-212-5p可促进HepG2细胞增殖、侵袭及迁移能力,抑制...     

黄芩素通过上调miR-7-5p影响脂多糖诱导的肾小球上皮细胞氧化应激及凋亡

目的:探讨黄芩素(SCU)对脂多糖(LPS)诱导的人肾小球上皮细胞氧化应激和凋亡的影响及其机制。方法:体外培养人肾小球上皮细胞,LPS(1.0 mg/L)处理建立细胞损伤模型,分为正常对照(NC)组、LPS组、NC+SCU组、LPS+SCU组、LPS+miR-NC组、LPS+微小RNA-7-5p(miR-7-5p)组、LPS+SCU+anti-miR-NC组和LPS+SCU+anti-miR-7-5p组。CCK-8法检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡;试剂盒测定细胞内丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性,以及细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性;RT-qPCR检测miR-7-5p的表达水平。结果:与NC组比较,LPS组细胞活力、miR-7-5p表达和SOD活性显著降低,细胞凋亡率、MDA含量和LDH活性显著升高(P<0.05);与LPS组比较,LPS+SCU组细胞活力、miR-7-5p表达和SOD活性显著升高,细胞凋亡率、MDA含量和LDH活性显著降低(P<0.05);与LPS+miR-NC组比较,LPS+miR-7-5p组细胞活力和SOD活性显著升高,...     

紫杉醇诱导HepG2肝癌细胞凋亡中miR-224沉默凋亡抑制因子5基因的作用

目的 探讨紫杉醇诱导肝癌HepG2 细胞凋亡时miRNA对基因的沉默的作用。 方法 用不同浓度紫杉醇处理肝癌HepG2细胞后,流式细胞术检测其细胞凋亡;通过实时定量PCR(Real-time PCR)测定miR-224和凋亡抑制因子5（api-5） mRNA的表达;用免疫组织化学二步法和免疫印迹法(Western blotting)检测API-5蛋白的表达。 结果 紫杉醇诱导HepG2细胞凋亡时,通过2^-ΔΔCT法分析发现,除了0.5mg/L、1mg/L紫杉醇培养HepG2肝癌细胞24h miR-224不升反降外,其他浓度和处理时间miR-224表达均显示上调;0.5mg/L、1mg/L紫杉醇培养HepG2肝癌细胞24h api-5 mRNA表达稍微降低,0.5mg/L紫杉醇处理48h无增长,其他浓度和处理时间api-5 mRNA表达均上调;应用IPP v 5.1图像分析软件处理,经 t 检验分析发现,紫杉醇处理后API-5蛋白表达均下调（P<0.05）。 结论 上调的miR-224可能作用其靶基因api-5的表达,通过与api-5 mRNA的3’UTR结合阻止翻译的完成,从而对肝癌细胞的凋亡途径产生影响。     

miR-145-5p的过表达对乳腺癌细胞凋亡作用的研究

目的 探讨miR-145-5p靶向调控激活转录因子1(ATF1)对人乳腺癌MCF7细胞凋亡的影响.方法 运用TargetScan在线分析miR-145-5p与ATF1的相关性;将ATF1的3'UTR构建进PMIR-RB-REPORT质粒,利用荧光素酶报告实验检测miR-145-5p是否靶向调控ATF1;用HiPerFe...     

circ-SFMBT2通过靶向miR-7-5p/ADAM10轴对非小细胞肺癌细胞生物学行为的影响

目的:探讨circ-SFMBT2对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞生物学行为的影响以及对miR-7-5p/ADAM10分子轴的调控作用。方法:采用qRT-PCR法与Western印迹法分别检测NSCLC与癌旁组织中circ-SFMBT2、miR-7-5p、ADAM10...     

抑制lncRNA LINC01503通过靶向调控miR-335-5p对肺癌细胞活力、迁移和侵袭的影响及其机制研究

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)LINC01503对肺癌细胞活力、迁移和侵袭的影响及其作用机制。方法:将人肺癌H1299细胞分为si-NC组(转染si-NC)、si-LINC01503组(转染si-LINC01503)、pcDNA组(转染pcDNA)、pcDNA-LINC01503组(转染pcDNA-LINC01503)、miR-NC组(转染miR-NC)、miR-335-5p组(转染miR-335-5p mimics)、si-LINC01503+anti-miR-NC组(共转染si-LINC01503和anti-miR-NC)、si-LINC01503+anti-miR-335-5p组(共转染si-LINC01503和anti-miR-335-5p)、miR-NC+WT-LINC01503组(共转染miR-NC和WT-LINC01503)、miR-NC+MUT-LINC01503组(共转染miR-NC和MUT-LINC01503)、miR-335-5p+WT-LINC01503组(共转染miR-335-5p和WT-LINC01503)和miR-335-5p+MUT-LINC...     

胰岛素抗性对肝癌HepG2细胞生物学功能及顺铂敏感性的影响

 目的:研究胰岛素抗性在原发性肝癌细胞中的生物学功能及对顺铂抗癌药物的抗药敏感性的影响。方法: 利用高浓度的胰岛素连续培养HepG2细胞72 h获得抗胰岛素的HepG2细胞（HepG2/IR）,检测HepG2/IR细胞的黏附、迁移和侵袭的能力改变以及对顺铂的敏感性;同时利用流式细胞术测定HepG2和HepG2/IR中胰岛素受体和葡萄糖转运蛋白2的表达情况。结果: 胰岛素抗性HepG2/IR细胞中葡萄糖消耗量显著降低;胰岛素受体和葡萄糖转运蛋白2表达下调;而HepG2/IR细胞的黏附、迁移和侵袭能力明显增强;同时HepG2/IR细胞对顺铂的敏感性降低;但用吡格列酮处理HepG2/IR细胞后其黏附、迁移和侵袭能力显著减弱。结论: 胰岛素抗性与HepG2细胞的耐药性、细胞黏附、迁移和侵袭能力密切相关。这有助于解释具有胰岛素抗性的癌症患者对化疗失敏的临床现象。     

miR-486-5p通过抑制端粒酶活性促进人骨髓间充质干细胞衰老

目的:研究年龄相关microRNA-486-5p(miR-486-5p)对人骨髓间充质干细胞(h MSCs)衰老的调控作用。方法:通过microRNA芯片和real-time PCR检测供体年龄对h MSCs中miR-486-5p表达的影响;通过转染miR-486-5p模拟物或抑制物,过表达miR-486-5p或抑制其表达;用β-半乳糖苷酶染色检测miR-486-5p对h MSCs衰老的影响;通过siRNA研究沉默信息调节因子1(SIRT1)对h MSCs端粒酶逆转录酶(TERT)、端粒酶活性及衰老的影响。结果:随供体年龄增加,h MSCs中miR-486-5p的表达增加。过表达miR-486-5p可促进h MSCs衰老。相反,抑制miR-486-5p的表达可减少h MSCs的衰老。SIRT1及TERT随供体年龄增加而表达下降,直接抑制SIRT1的表达可减少TERT表达,抑制端粒酶活性,促进细胞衰老。同时抑制miR-486-5p和SIRT1的表达,使miR-486-5p失去对h MSCs端粒酶活性及衰老的调控作用。结论:miR-486-5p通过抑制SIRT1,减少h MSCs端粒酶活性,促进h MSCs衰老。     

circ-SFMBT2通过靶向miR-7-5p/ADAM10轴对非小细胞肺癌细胞生物学行为的影响CSCD

目的探讨circ-SFMBT2对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞生物学行为的影响以及对miR-7-5p/ADAM10分子轴的调控作用。方法﹑采用qRT-PCR法与Western印迹法分别检测NSCLC与癌旁组织中circ-SFMBT2、miR-7-5p、ADAM10的表达量;用Pearson法分析circ-SFMBT2与miR-7-5p,以及miR-7-5p与ADAM10的相关性;体外培养人支气管上皮样细胞(human bronchial epithelial-like cells,HBE)与肺癌细胞系H1650、H460、A549、H1299。用CCK-8与EdU实验检测细胞的增殖能力。用平板克隆形成实验检测细胞的克隆形成能力。用流式细胞术检测细胞凋亡率。用Transwell小室实验检测细胞侵袭。用双荧光素酶报告实验检测circ-SFMBT2与miR-7-5p、以及miR-7-5p与ADAM10的靶向关系。用裸鼠移植瘤实验检测敲低circ-SFMBT2对移植瘤生长的影响。用免疫组化实验检测移植瘤组织中ADAM10与Ki67蛋白阳性率。结果circ-SFMBT2与ADAM10在NSCLC组织及细胞系中表达升高,而miR-7-5p的表达降低,circ-SFMBT2与miR-7-5p的表达呈负相关,而miR-7-5p与ADAM10的表达呈负相关。沉默circ-SFMBT2及miR-7-5p过表达可抑制细胞增殖、克隆形成及侵袭,还可促进其凋亡。circ-SFMBT2可靶向调控miR-7-5p,而ADAM10是miR-7-5p的靶基因。沉默circ-SFMBT2与抑制miR-7-5p联合作用,以及miR-7-5p过表达与ADAM10过表达联合作用均可促进细胞增殖、克隆形成及侵袭,并抑制其凋亡。沉默circ-SFMBT2可抑制移植瘤的生长。结论︰沉默circ-SFMBT2可通过调控miR-7-5p/ADAM10分子轴而减弱NSCLC细胞增殖、克隆形成,侵袭能力并诱导其凋亡。     

miR-150-5p靶向SIRT1提高肝癌细胞系HepG2放疗敏感性

目的探究miR-150-5p靶向SIRT1提高肝癌细胞放射敏感性的作用机制。方法用分次放疗放射递增法诱导建立放射抵抗型细胞株(RR-HepG2);RT-qPCR检测HepG2和RR-HepG2在不同放射剂量下miR-150-5p的表达水平;细胞克隆实验检测相同放射剂量下两种细胞的放疗敏感性;流式细胞计量术和Western blot检测过表达miR-150-5p对HepG2凋亡的影响;双荧光素酶报告基因法检测miR-150-5p与SIRT1的关联;细胞克隆实验和Western blot检测过表达SIRT1后,细胞的放疗敏感性和凋亡蛋白的变化。结果与亲代HepG2比较,相同放射剂量下,RRHepG2组miR-150-5p的表达量均显著降低(P<0. 05);放射处理后,与control、agomiR-NC组比较,agomiR-150-5p组的细胞存活分数显著降低,敏感性高(P<0. 05),Bax、caspase-9蛋白表达水平显著升高,Bcl-2蛋白表达水平显著降低,细胞凋亡率显著升高;双荧光素酶报告基因法验证miR-150-5p靶向调控SIRT1。与agomiR-NC组比较,野生型(WT) agomiR-150-5p荧光素酶活性显著降低,SIRT1蛋白水平显著降低(P<0. 05);与anta-agomiR-NC比较,野生型(WT) anta-agomiR-150-5p荧光素酶活性显著升高,SIRT1蛋白水平显著升高(P<0. 05);放射处理后,与agomiR-NC组比较,agomiR-150-5p组的细胞存活分数显著降低,Bax、caspase-9蛋白表达水平显著升高,Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0. 05);与agomiR-150-5p+vector组比较,agomiR-150-5p+SIRT1组的细胞存活分数显著升高,Bax、caspase-9蛋白表达水平显著降低,Bcl-2蛋白表达水平显著升高(P<0. 05)。结论 miR-150-5p靶向SIRT1,下调其表达,提高肝癌细胞放射敏感性,可为临床肝癌放射治疗增敏提供靶点。     

转录因子2过表达改善人肝癌细胞HepG2的胰岛素抵抗

目的研究转录因子2(TCF2)过表达对HepG2细胞胰岛素抵抗的影响。方法用高浓度胰岛素(1×10-8mol/L)诱导处理人肝癌HepG2细胞24 h建立人肝癌HepG2细胞胰岛素抵抗模型,分为空白组、胰岛素抵抗模型组(IR组)、IR+空载体组和IR+TCF2过表达组;RT-qPCR和Western blot检测TCF2的表达;葡萄糖氧化酶法检测培养液中的葡萄糖浓度;蒽酮法检测糖原合成量;MTT法检测细胞存活率;比色法检测己糖激酶和丙酮酸激酶的活性;Western blot检测人胰岛素受体底物(IRS-1)和葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)的表达。结果与空白组比较,IR组细胞葡萄糖消耗量显著降低(P<0.05),表明模型建立成功。IR组细胞TCF2 mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.05)。与IR组相比,TCF2过表达可显著增加胰岛素抵抗HepG2细胞的葡萄糖消耗量、肝糖原合成量、己糖激酶活性和丙酮酸激酶活性,增加IRS-1和GLUT4蛋白表达(P<0.05)。结论过表达TCF2可改善人肝癌HepG2细胞的胰岛素抵抗。     

miR-708-5p通过抑制TMEM88表达促进人骨髓间充质干细胞迁移

目的:研究年龄相关microRNA-708-5p(miR-708-5p)对人骨髓间充质干细胞(h MSCs)迁移能力的调控作用。方法:通过microRNA芯片和real-time PCR检测供体年龄对h MSCs中miR-708-5p表达的影响;通过转染miR-708-5p模拟物或抑制物,过表达或抑制miR-708-5p表达;通过细胞划痕及Transwell实验检测h MSCs迁移能力。通过siRNA研究miR-708-5p靶基因跨膜蛋白88(TMEM88)对h MSCs中β链球蛋白(β-catenin)及h MSCs迁移功能的影响。结果:随供体年龄增加,h MSCs中miR-708-5p的表达下降。过表达miR-708-5p可促进h MSCs迁移。相反,抑制miR-708-5p的表达可减少h MSCs迁移。随供体年龄增加,TMEM88表达增加,而β-catenin表达下降,直接抑制TMEM88的表达可促进β-catenin表达,促进h MSCs迁移。同时抑制miR-708-5p和TMEM88,使miR-708-5p失去对h MSCs的调控作用。结论:miR-708-5p可通过抑制TMEM88表达,上调β-catenin,从而活化Wnt/β-catenin信号通路,促进h MSCs迁移。     

circRNA_100395通过结合miR-31-5p抑制心肌细胞肥大相关基因的表达

目的:探讨环状RNA(circRNA)_100395对心肌细胞肥大表型的影响及其作用机制.方法:通过RT-qPCR检测健康器官捐献者(n=8)与心衰患者(n=14)心肌组织中circRNA_100395及其宿主基因Kelch蛋白样家族成员20(KLHL20)的表达水平.原代分离、培养乳小鼠心室肌细胞(NMVCs),分别...     

miR-363下调HepG2细胞Mcl-1蛋白的表达并诱导其凋亡

目的:探讨微小RNA-363(microRNA-363,miR-363)的作用靶点及其对Hep G2细胞的抑制作用。方法:通过生物信息学分析预测Mcl-1基因是否受microRNA调控。实时荧光定量PCR检测正常肝细胞系LO2及肝癌细胞系Hep G2、Huh7、PLC的miR-363和Mcl-1的表达水平。将miR-363转染人Hep G2细胞,检测miR-363对Mcl-1表达水平的影响。MTT法检测Hep G2细胞在转染miR-363后的相对细胞活力,Annexin V/PI染色法检测miR-363转染对Hep G2细胞凋亡的影响。结果:Mcl-1 mRNA 3’-非翻译区(3’-UTR)存在miR-363的假定结合位点,在肝癌细胞中转染miR-363后Mcl-1的表达下降。转染miR-363可抑制Hep G2细胞的活力并诱导其发生凋亡。结论:miR-363过表达可显著抑制Hep G2细胞的活力并诱导其发生凋亡,其机制可能与miR-363能下调Hep G2细胞Mcl-1蛋白的表达有关。