融合蛋白AML1-ETO对C/EBPα基因表达的影响

背景：已有研究显示AML1-ETO可以通过包括抑制C/EBPα的功能在内的机制引起分化的阻滞。 目的：观察AML1-ETO对髓系分化相关基因C/EBPα表达的影响,探讨其在白血病发生中的作用。 方法：应用流式细胞术检测急性单核细胞白血病细胞株U937、U937-MOCK和U937-A/E1细胞表面抗原CD11b、CD14 的表达;荧光实时定量PCR检测C/EBPα mRNA的表达;免疫印迹法检测C/EBPα蛋白的表达;染色质免疫沉淀技术研究转染细胞中AML1-ETO与C/EBPα基因启动子之间直接的相互作用情况。 结果与结论：AML1-ETO转染细胞的细胞表面分化抗原CD11b 和CD14的表达明显下降,且转染了AML1-ETO的U937细胞系中,C/EBPα的mRNA与蛋白水平均下调,转染细胞沉淀富集的DNA中含有C/EBPα基因的启动子序列。结果提示C/EBPα是AML1-ETO 的直接靶基因,AML1-ETO能下调C/EBPα的表达。     

PMA对U937细胞CD18mRNA表达的诱导作用及其机制

目的:研究PMA对CD18mRNA表达的促进作用及机制。方法:选用PMA刺激下的U937细胞为实验模型,运用定量RT-PCR方法检测U937细胞CD18mRNA的表达水平。结果:PMA具有浓度和时间依赖性地诱导U937细胞CD18mRNA表达的作用,这种作用能分别被PKC、NF-κB抑制剂所抑制,但不能被转录因子AP-1抑制剂所抑制。结论:PMA能激活细胞的PKC,进而通过其后的信号转导通路促进CD18mRNA的表达,转录因子NF-κB为PMA刺激下的U937细胞CD18基因转录所必需,而AP-1则相反。     

维生素D3诱导的U937细胞中CD14表达的实验研究

目的: 探讨维生素D3诱导U937细胞上CD14蛋白的表达及其对内毒素 (LPS)刺激的反应性。方法: 用0. 1μmol/LVitD3与U937细胞共同培养 24h诱导CD14基因的表达, 并观察U937细胞对不同浓度的LPS刺激不同时间的反应性。结果: VitD3能稳定诱导U937细胞表达CD14mRNA和CD14蛋白。经VitD3诱导的U937细胞对LPS刺激的敏感性显著增强, 表现为低浓度LPS刺激即能诱导该细胞核中NF -κB激活, 促进TNF- αmRNA的转录和表达, 并将表达的TNF α释放入培养上清中。结论: VitD3能诱导U937细胞中CD14基因和蛋白的表达, 并增加其对LPS刺激的反应性。     

丁酸钠部分依赖CREB上调急性白血病细胞CD86分子

目的：观察丁酸钠（SB）对急性白血病细胞CD86分子表达的影响，并探讨其作用机制。方法：流式细胞术检测NB4、HL-60、U937细胞经SB处理前后的CD86分子表达变化，半定量RT-PCR检测SB对各组细胞CD86 mRNA表达变化，AUT凝胶电泳检测核心组蛋白乙酰化程度，pCREB试剂盒检测细胞核内pCREB含量变化。结果：SB处理各组细胞CD86分子表达与对照组比较均出现显著升高；CD86 mRNA水平表达也明显增高；AUT电泳显示经SB作用后，各组细胞组蛋白乙酰化程度明显增加；SB处理后细胞核内pCREB含量增多。结论：SB使NB4、HL-60、U937细胞核心组蛋白乙酰化程度增加，染色质重塑，有利于CREB等转录因子的活化并与DNA结合，促进CD86转录增强，表达增多。     

稳定表达CD200的U937细胞株的建立

目的：构建稳定表达CD200蛋白的人单核细胞系U937细胞株,为研究该基因的作用机制奠定基础。方法：用电转染基因法将含有人CD200 cDNA的真核表达载体pcDNA3-CD200质粒和pcDNA3质粒分别转入人单核细胞系U937细胞中,经G418筛选,转染阳性细胞连续传代培养,并应用RT-PCR及流式细胞术检测CD200 mRNA和蛋白表达情况。结果：经G418筛选,U937细胞全部死亡,转染pcDNA3质粒和pcDNA3-CD200重组质粒的U937细胞存活,并可连续传代培养30代;转染pcDNA3-CD200重组质粒的U937细胞RT-PCR检测有一特异性扩增带;流式细胞术检测CD200表达结果显示：转染pcD-NA3-CD200重组质粒的U937细胞CD200表达阳性细胞率（77.20%）显著高于转染pcDNA3质粒（3.20%）和U937细胞组（2.10%）（F=133996.40,P〈0.01）;各代间差异无显著性（F=1.03,P〉0.05）。结论：用基因转染法成功地建立了稳定表达CD200蛋白的人单核细胞株U937-pcDNA3-CD200。     

人T-bet基因转染U937探讨T-bet对白血病细胞的影响

目的 探讨人T-bet基因在白血病细胞株U937中的表达及其对IFN-γ分泌的影响,寻求通过免疫调节改善白血病患者机体免疫状态的可能性.方法 采用电穿孔技术将重组人pIRES-eGFP-Tbet(pIRES-eGFP-hTbet)质粒转染U937细胞,RT-PCR检测转染前后U937细胞T-bet的mRNA水平;westen-blot检测表达的T-bet蛋白;ELISA检测其分泌IFN-γ的水平.试验中同时设立pIRES-eGFP质粒为对照.结果 电穿孔转染U937细胞后,在荧光显微镜下观察到带荧光的细胞(转染细胞),其荧光细胞阳性率80%左右,提示转染成功;转染T-bet的U937细胞,分别经RT-PCR及westen-blot检测到T-bet的mRNA和表达的蛋白,而未经转染或转染对照质粒pIRES-eGFP的细胞,均未见目的基因的转录和蛋白表达;T-bet转染细胞的培养上清中含有较高水平的IFN-γ,而转染前及对照质粒转染的细胞IFN-γ的分泌水平极低.结论 通过电穿孔方法 成功将人T-bet基因转染到白血病细胞株U937中,并检测到大量IFN-γ的产生.T-bet是免疫应答调节的重要转录因子,对其研究将有助于进一步探讨T-bet基因或其表达产物作为Th1应答的调节剂用于临床血液病治疗的可能性.     

地塞米松对PMA诱导CD18表达的抑制作用

目的:研究GC抑制CD18表达的作用。方法:选用PMA刺激下的U937细胞为实验模型,运用定量RT-PCR、Northern杂交检测U937细胞CD18 mRNA的表达水平。结果:Dex能明显抑制PMA诱导CD18 mRNA的表达,这种抑制作用具有明显的剂量依赖性,GR的拮抗剂RU38486能够明显扭转Dex的抑制作用。结论:Dex通过GR介导能在转录水平上抑制PMA诱导的CD18 mRNA的表达,该作用可能与糖皮质激素受体(GR)在转录水平拮抗NF-κB有关。     

去乙酰化酶抑制剂VPA 对巨噬细胞极化过程的影响

目的:本研究通过分析去乙酰化酶抑制剂对巨噬细胞极化过程中组蛋白修饰的影响,以及对巨噬细胞极化过程的影响,分析去乙酰化酶抑制剂是否可以通过改变巨噬细胞的组蛋白修饰,进而影响巨噬细胞极化的过程,旨在为治疗自身免疫性疾病提供新的思路。方法:利用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)和干扰素γ(Interferon-γ,IFN-γ)诱导J774.1巨噬细胞24 h,白细胞介素4(Interleukin-4,IL-4)诱导J774.1巨噬细胞24 h,并在诱导过程中加入2 mmol/L丙戊酸(Valproic acid,VPA),收集巨噬细胞,实时免疫荧光定量PCR和ELISA法检测巨噬细胞极化的特异性标记基因的表达,流式细胞术和细胞免疫荧光法检测组蛋白修饰情况。结果:J774.1细胞经LPS和IFN-γ诱导24 h极化为M1型巨噬细胞;经IL-4刺激24 h极化为M2型巨噬细胞,VPA处理后的M1型巨噬细胞组蛋白H3K9的乙酰化程度升高,标记基因白细胞介素6(Interleukin-6,IL-6)、诱导性一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,i NOS)、CC趋化因子配体2[Chemokine(C-C motif)ligand 2,CCL2]的表达量降低,CD86的表达量升高;VPA处理后的M2型巨噬细胞组蛋白H3K9的乙酰化程度也升高,标记基因精氨酸酶(Arginase-1,Arg-1)、Fizz-1(Found in inflammatory zone-1,Fizz-1)、甘露糖受体(CD206)、Ym1的表达量升高。结论:巨噬细胞的极化状态和组蛋白的修饰具有一定的相关性,VPA在M1型巨噬细胞诱导体系中可以促使M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化,但是在M2型巨噬细胞诱导体系中,却抑制了M1型巨噬细胞的特异性基因的表达。     

肿瘤特异性凋亡基因诱导人淋巴瘤细胞凋亡的机制

目的:研究肿瘤特异性凋亡基因(apoptingene)在诱导人淋巴瘤细胞U937凋亡时,cJun氨基末端激酶(JNK)信号通路的作用。方法:用含有apoptin基因的真核表达载体,瞬时转染体外培养的人淋巴瘤细胞U937。采用流式细胞仪、Westernblot、台盼蓝染色及RTPCR等研究其在不同时间条件下诱导U937细胞凋亡的作用。结果:Apopin基因瞬时转染U937细胞48h,可出现明显的凋亡;而且凋亡细胞的数量与apoptin基因的转染时间有关。诱导后24h,U937细胞中出现磷酸化的JNK蛋白的表达,诱导后48h达高峰;而非磷酸化的JNK蛋白表达无明显变化。结论:Apoptin基因具有诱导U937细胞凋亡的作用。JNK信号通路的激活,可能在apoptin基因诱导肿瘤细胞凋亡过程中发挥着重要作用。     

曲古霉素A促进胶质瘤细胞系凋亡

目的组蛋白的异常修饰(去乙酰化)与胶质瘤的发生和发展关系密切,本研究的目的是探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素A(trichomycin A,TSA)对胶质瘤细胞系凋亡的调节作用。方法将浓度分别为0.2μmol/L、0.4μmol/L和0.8μmol/L的TSA加入胶质瘤细胞系U251细胞中,应用Westernblot法检测U251细胞系经不同浓度的TSA处理后细胞内胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3),乙酰化组蛋白H3和H4的表达,应用流式细胞术(Annexin V-FITC染色)检测不同药物浓度处理组中U251细胞的凋亡率。结果 TSA处理后,U251细胞内乙酰化组蛋白H3、H4及caspase-3的蛋白水平明显上调(P<0.01),具有明显的剂量依赖性。流式细胞术结果显示U251细胞TSA处理后细胞的凋亡率具有剂量依赖性显著上调。结论 TSA剂量依赖性上调胶质瘤细胞系U251中caspase-3表达,促进细胞凋亡。     

ARHI基因抑制U937白血病细胞株生长并诱导其G_2/M期阻滞及凋亡

目的:探讨抑癌基因ARHI在急性髓细胞白血病中的表达情况,同时探索其对U937细胞生长的影响。方法:RT-PCR方法检测急性髓细胞白血病细胞株、人胚肾细胞293FT、白血病原代细胞以及健康志愿者血细胞中ARHI mRNA的表达情况。构建高表达ARHI的MSCV-IRES-GFP-ARHI质粒转染U937细胞,MTT法连续8 d检测细胞活性绘制生长曲线。新鲜培养基重悬U937细胞24 h后,采用流式细胞术检测细胞周期以及细胞凋亡。结果:293FT细胞、健康志愿者血细胞中均检测到ARHI mRNA表达,而白血病细胞株以及白血病患者原代细胞中未检测到该基因的表达。生长曲线显示高表达ARHI基因的U937(U937-ARHI)细胞在第6~8天细胞活力低于对照(U937-GFP)组。高表达ARHI的U937细胞G2/M期细胞比例及细胞凋亡率均高于对照组(P0.05)。结论:ARHI在急性髓系白血病细胞中的表达减低;高表达ARHI基因能抑制U937细胞生长、阻滞其细胞周期在G2/M期并促进细胞凋亡。     

Multiple effects of human recombinant interleukin 4 on human myeloid monocyte cell lines

The effects of recombinant human interleukin 4 (rIL-4) on proliferation and differentiation on human myeloid/monocytic leukemia cell lines were examined. At high concentrations, rIL-4 had a slight enhancing effect on [3H]thymidine incorporation by U937 cells. rIL-4 markedly induced expression of the Fc epsilon receptor (CD23) and the Leu-M3 antigen (CD14) on U937 cells. HL60 and THP-1 cells treated with rIL-4 also showed increased CD23 expression, but little change of CD14 antigen expression. CD23 induction required lower amounts of IL-4 than needed for T cell growth, indicating that CD23 induction on U937 will serve as a sensitive assay for human IL-4. rIL-4 reduced the steady state level of IL-1 beta mRNA in U937.     

野生型p53基因导入对U937细胞分化、凋亡和CD36受体表达的影响

目的： 研究野生型p53基因重组腺病毒载体（AdCMV-p53）导入对U937细胞分化、凋亡和清道夫受体CD36表达的影响。 方法： AdCMV-p53导入U937细胞后，用细胞计数、细胞周期分析、台盼蓝染色排除法计数细胞悬液中的活细胞数目和NBT还原反应观察其对U937细胞生长、分化的影响；RT-PCR、免疫荧光和流式细胞分析检测AdCMV-p53导入对CD36表达的影响。 结果： AdCMV-p53可以高效导入U937细胞，野生型p53基因导入促进U937细胞向巨噬细胞分化，台盼蓝染色发现实验组阳性细胞数（64.6±9.2）%较对照组（14.2±5.5）%明显增多，吞噬能力增强；NBT还原反应实验组（49.7±12.6）%较对照组（6.3±1.8）%升高。RT-PCR和流式细胞分析检测，野生型p53基因导入使得CD36 mRNA转录增强，CD36蛋白表达增加。 结论： 野生型p53基因能影响细胞分化和凋亡，并上调清道夫受体CD36的表达，对于动脉粥样硬化的预防和基因治疗具有潜在意义。     

替米沙坦抑制U937细胞增殖及诱导凋亡

目的:探讨替米沙坦对U937细胞株的生长抑制及凋亡诱导作用。方法:分别以不同浓度的替米沙坦处理人类急性髓系白血病细胞U937;以CCK-8法检测不同浓度替米沙坦对U937细胞的生长抑制作用;以集落形成实验观察不同浓度替米沙坦对U937细胞集落形成能力的影响;以Annexin V-PI双染法及Hoechst 33342染色法检测不同浓度替米沙坦作用前后U937细胞凋亡程度的变化;以流式细胞术检测U937细胞表面抗原CD11b的阳性表达率,瑞氏染色后倒置显微镜进行细胞形态学观察,了解U937细胞的分化情况;以Western blot法检测不同浓度替米沙坦作用U937细胞后凋亡相关蛋白表达量的改变。结果:CCK-8实验结果证实替米沙坦呈时间和剂量依赖性抑制U937细胞的生长;集落形成实验显示低剂量替米沙坦可以完全抑制U937细胞的集落形成能力;Annexin V-PI双染法及Hoechst 33342法结果证实替米沙坦可以诱导U937细胞凋亡;细胞表面抗原流式检测术及瑞氏染色结果证实替米沙坦可以促进部分U937细胞分化;Western blot实验结果证实替米沙坦作用于U937细胞72 h后,促凋亡相关蛋白cleaved PARP及cleaved caspase-3蛋白的水平明显增高。结论:替米沙坦可以抑制细胞增殖以及诱导U937细胞部分分化,并通过caspase依赖的凋亡途径触发U937细胞凋亡。     

Poliovirus infection interferes with the phorbol ester-induced differentiation of the monocytic U937 cell line

Monocytic U937 cells can differentiate in vitro into macrophage-like cells by treatment with phorbol esters such as phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). We have analyzed the effect of poliovirus infection in this pathway of differentiation. Poliovirus RNA replication took place in both untreated and PMA-treated U937 cells infected before or after PMA addition, although a slight reduction in poliovirus RNA levels was observed in PMA-treated cells at late times postinfection. Total protein synthesis remained unchanged during the first 5 h of infection both in normal and PMA-treated cells. However, an inhibition on total RNA synthesis was observed early in infection. PMA-induced c-myc mRNA expression was abolished when infection took place 1 h before PMA addition but was just partially inhibited when poliovirus was added 1 h after PMA stimulation. Fluorescence flow cytometry analysis revealed that poliovirus infection induced an increase in the number of 4F2 molecules per cell in normal U937 cells and a slight decrease in the number of positive cells for the antigens CD14, CD4 and CD11c in both untreated or PMA-treated U937 cells. These findings suggest that poliovirus infection of U937 cells interferes at various levels with monocyte maturation yielding cells which are unable to undergo the complete pathway of differentiation to macrophages.     

Zeste基因增强子同源物2通过调控Wnt/β-catenin信号通路影响脑胶质瘤细胞凋亡

目的:探讨zeste基因增强子同源物2(EZH2)通过调控Wnt/β-catenin信号通路对脑胶质瘤细胞凋亡的影响。方法:以RT-q PCR和Western blot检测胶质瘤U87、H4和U251细胞及正常人脑星形细胞(NHA)中EZH2的表达水平。在H4细胞中转染EZH2 siRNA和siRNA control,MTT测定细胞活力,流式细胞术测定细胞凋亡,分光光度计法检测caspase-3的活性,Western blot检测Wnt/β-catenin信号通路中关键蛋白β-连环蛋白(β-catenin)和下游靶分子c-Myc的蛋白表达。用Wnt/β-catenin信号通路激活剂处理转染EZH2 siRNA的H4细胞,流式细胞术测定细胞凋亡,Western blot测定β-catenin和c-Myc的表达。结果:胶质瘤U87、H4和U251细胞中EZH2的mRNA和蛋白水平均明显高于NHA(P0.05),并且H4细胞中EZH2 mRNA和蛋白水平高于U87和U251细胞(P0.05)。EZH2 siRNA可以明显下调H4细胞中EZH2的mRNA和蛋白水平。EZH2表达下调后的H4细胞从48 h开始细胞活力降低,并且细胞凋亡率也明显升高,细胞中caspase-3活性也明显升高(P0.05),同时EZH2表达下调还可以抑制β-catenin和c-Myc的表达。Wnt/β-catenin信号通路的激活剂可以减少EZH2诱导的H4细胞凋亡,降低细胞中caspase-3的活性。结论:EZH2在脑胶质瘤细胞中过度表达,下调其表达可以通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活而诱导胶质瘤细胞凋亡。     

Interferon and (2'-5')oligoadenylate enhance the expression of low affinity receptors for IgE (Fc epsilon R2/CD23) on the human monoblast cell line U937

The regulation of low affinity IgE receptor (Fc epsilon R2/CD23) expression on the human monoblast cell line U937 was examined by an anti-Fc epsilon R2/CD23 monoclonal antibody (H107) and the cDNA probe for Fc epsilon R2/CD23. Alpha interferon (IFN-alpha) and its intracellular mediator, (2'-5')oligoadenylate (2, 5-A), induced Fc epsilon R2/CD23 expression on U937 with no significant increase of the Fc epsilon R2/CD23 mRNA. PMA and IFN-gamma increased both surface Fc epsilon R2/CD23 expression and the Fc epsilon R2/CD23 mRNA levels. IFN-alpha effectively induced 2, 5-A synthetase activity in U937 cells, whereas IFN-gamma induced little. The results suggest that the mechanisms of enhancement of Fc epsilon R2/CD23 expression on U937 cells by IFN-alpha and IFN-gamma are different and that 2, 5-A may play an important role in the Fc epsilon R2/CD23 expression on U937 cells induced by IFN-alpha.