松香酸通过诱导自噬减轻AGEs诱导的心肌H9c2细胞凋亡和内质网应激反应

目的:本文旨在探索松香酸(abietic acid,AA)对晚期糖基化终末产物(advanced glycosylation end products,AGEs)诱导的心肌H9c2细胞凋亡和内质网应激的影响及其相关机制。方法:H9c2细胞分为5组:对照组加入生理盐水处理24 h;AGEs处理组加入AGEs(100 mg/L)处理24 h;AGEs+AA(10、25和50μmol/L)组同时加入AGEs(100 mg/L)和AA(10、25和50μmol/L)处理24 h。MTT法检测H9c2细胞活力。Western blot分析肌红蛋白(myoglobin,Mb)、肌酸激酶MB同工酶(creatine kinase MB isoenzyme,CK-MB)、心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,c Tn I)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)、cleaved caspase-12、GADD34、Bi P、LC3、P62和beclin 1的蛋白水平。ELISA检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性。流式细胞术分析细胞凋亡。结果:低浓度(低于50μmol/L)的松香酸对H9c2细胞活力无明显影响,高浓度(高于50μmol/L)的松香酸会降低H9c2细胞活力。AGEs组Mb、CK-MB和c Tn I蛋白表达及LDH的水平明显高于对照组(P0.05);与AGEs组相比,AGEs+AA(10、25和50μmol/L)组Mb、CK-MB和c Tn I的蛋白表达及LDH的表达水平明显降低(P0.05)。松香酸(10、25和50μmol/L)可抑制AGEs诱导的心肌细胞凋亡、CHOP和cleaved caspase-12蛋白水平的升高及GADD34和Bi P表达的降低(P0.05)。而且,松香酸(10、25和50μmol/L)可抑制AGEs诱导的心肌细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和beclin 1表达的降低及P62表达的升高(P0.05)。自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤可逆转松香酸对心肌细胞LC3、Mb、cleaved caspase-12和Bi P蛋白水平的影响(P0.05)。结论:松香酸通过诱导自噬减轻AGEs诱导的心肌H9c2细胞凋亡和内质网应激反应。     

AGEs诱导培养人肾小球系膜细胞中NOX4及O_2~-水平

目的:观察晚期糖基化终末产物(AGEs)培养下人肾小球系膜细胞(HMCs)中还原型尼克安腺嘌吟二核苷酸氧化酶4(NOX4)蛋白及超氧阴离子(O-2)水平变化。方法:将正常浓度葡萄糖(5.6mmol/L)培养的HMCs经过无血清培养液同步化24h后分为两组:正常对照组[5.6mmol/L葡萄糖+200mg/L牛血清白蛋白(BSA)]及AGEs组(5.6mmol/L葡萄糖+200mg/LAGEs),分别干预48h后用Western blotting检测NOX4蛋白表达,用Dihydroethidium(DHE)法检测O-2的荧光水平。结果:与正常对照组比较,AGEs组NOX4蛋白表达明显上调(P<0.01),O-2水平亦明显增加(P<0.01),两者呈显著正相关。结论:AGEs能激活HMCs中NOX4,引起氧化应激,可能与糖尿病肾病(DN)的发生有关。     

自噬对晚期糖基化终末产物致成纤维细胞损伤的早期保护

文题释义：细胞自噬：自噬是普遍存在于真核细胞中的一种高度保护的、维持细胞内环境自身稳定的细胞内降解机制。胞浆中的细胞器和蛋白质等首先被双层膜包裹，形成自噬体，随后自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，自噬可降解清除细胞内受损线粒体等细胞器及毒性蛋白质聚集体。细胞自噬可影响糖尿病等慢性创面成纤维细胞的活力，被认为是疾病修复的关键调节因素。晚期糖基化终末产物：是在持续高糖条件下，蛋白质、脂质甚至核酸的氨基与糖的醛基在非酶催化反应下生成的最终末产物。在糖尿病患者体内，病理性高血糖可加速糖基化反应，形成大量的晚期糖基化终末产物。局部晚期糖基化终末产物蓄积作为糖尿病代谢重构的直接产物，是皮肤组织细胞、细胞外基质和细胞因子改变的重要环境介质，使得糖尿病患者的皮肤易损伤并形成溃疡创面。背景：晚期糖基化终末产物与糖尿病创面难愈合密不可分，晚期糖基化终末产物可影响成纤维细胞增殖及迁移，但自噬在晚期糖基化终末产物致成纤维细胞损伤中的早期保护作用尚未见相关研究。 目的：研究晚期糖基化终末产物对成纤维细胞活力及自噬的影响，探讨自噬在成纤维细胞损伤中的早期保护作用。 方法：以体外传代培养的人成纤维细胞为研究对象，设立正常对照组(DMEM培养液)、晚期糖基化终末产物组(DMEM培养液+100 mg/L晚期糖基化终末产物)、晚期糖基化终末产物抑制剂N-苯乙酰噻唑组(DMEM培养   液+100 mg/L晚期糖基化终末产物+100 mg/L N-苯乙酰噻唑)、自噬抑制剂氯喹组(DMEM培养液+100 mg/L晚期糖基化终末产物+10 μmol/L氯喹)。培养48 h后，锥虫蓝染色检测各组细胞活力，Western blot法检测LC3及P62蛋白的表达，细胞免疫荧光实验检测自噬体形成，透射电镜观察自噬泡超微结构。结果与结论：①细胞死亡率：与正常对照组比较，晚期糖基化终末产物组细胞死亡率显著增加(P < 0.01)；与晚期糖基化终末产物组比较，N-苯乙酰噻唑组细胞死亡率显著降低(P < 0.05)，而氯喹组细胞死亡率显著增加(P < 0.05)；②LC3及P62蛋白的表达：与正常对照组相比，晚期糖基化终末产物组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著增加，P62表达显著降低(P < 0.01)；与晚期糖基化终末产物组相比，N-苯乙酰噻唑组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显下降，P62表达明显上升(P < 0.05)，而氯喹组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白含量变化不明显(P > 0.05)，P62表达明显上升(P < 0.05)；③自噬体形成：晚期糖基化终末产物组和氯喹组均可见细胞中LC3绿色荧光点状聚集物增加；晚期糖基化终末产物组可见数目较多的自噬小体和自噬泡结构，而氯喹组细胞中自噬体结构数量和空泡状结构少于晚期糖基化终末产物组；④结果证实，晚期糖基化终末产物可损伤成纤维细胞，降低细胞生存率，早期可激活细胞自噬；诱导的自噬对成纤维细胞损伤起到一定的保护作用。 ORCID: 0000-0003-3966-8684(韩焱福) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程     

晚期糖基化终末产物对肠道L细胞凋亡及增殖活性的影响

目的探讨晚期糖基化终末产物(AGEs)对肠道L细胞株GLUTag细胞凋亡及细胞增殖活性的影响。方法肠道L细胞株GLUTag细胞由加拿大多伦多大学Druker实验室惠赠。将GLUTag细胞株分5组:空白对照组,牛血清白蛋白(BSA)对照组,AGEs 100μg/m L组,AGEs 200μg/m L组,AGEs 300μg/m L组。培养方法:空白对照组,将GLUTag细胞株培养于低糖DMEM中;BSA对照组,将GLUTag细胞株细胞培养于加入BSA的低糖DMEM中;AGEs 100μg/m L组,将GLUTag细胞株培养于终质量浓度100μg/m L AGEs的低糖DMEM中;AGEs 200μg/m L组,将GLUTag细胞株培养于终质量浓度200μg/m L AGEs的低糖DMEM中;AGEs 300μg/m L组,将GLUTag细胞株培养于终质量浓度300μg/m L AGEs的低糖DMEM中;每组细胞均培养24 h。将培养在终质量浓度200μg/m L AGEs中GLUTag细胞株分别培养0、12、24、48 h(即4组)。各组细胞干预结束后采用双染细胞凋亡检测方法检测细胞凋亡率;Hoechst33258荧光染色观察细胞形态;细胞计数试剂盒检测细胞增殖活性。结果各组细胞经药物干预24 h后,AGEs 100μg/m L组、AGEs 200μg/m L组、AGEs 300μg/m L组凋亡细胞百分率明显升高,均显著高于空白对照组和BSA对照组,且AGEs 300μg/m L组凋亡细胞百分率最高(P=0.000)。AGEs 200μg/m L作用12、24、48 h后凋亡细胞百分率显著高于阴性对照组(作用0 h),且作用48 h凋亡率最高(P=0.000)。100、200、300μg/m L AGEs作用GLUTag细胞24 h后,细胞活性光密度(OD)值显著低于空白对照组和BSA对照组,且AGEs 300μg/m L组OD值最低(P0.05)。AGEs 200μg/m L作用12、24、48 h后细胞OD值显著低于阴性对照组(作用0 h),其中48 h组OD值最低(P0.05)。结论 AGEs对肠道L细胞株GLUTag细胞的凋亡及增殖活性均产生影响,其细胞凋亡率在相同作用时间下随着AGEs的浓度增高而增多,且在相同剂量下随着AGEs的作用时间延长而增多。AGEs可诱导肠道L细胞凋亡,抑制细胞增殖活性,从而损伤肠道L细胞。     

KIM-1对AGEs诱导的肾小管上皮细胞EMT和凋亡的影响及其机制

目的：探讨肾损伤分子1(KIM-1)对晚期糖基化终末产物（AGEs）诱导的人近端肾小管上皮HK-2细胞上皮-间充质转化（EMT）和凋亡的影响及其可能的机制。方法：将HK-2细胞分为对照组、AGEs组、AGEs+阴性对照小干扰RNA(NC siRNA)组和AGEs+KIM-1 siRNA组。免疫荧光检测KIM-1蛋白的表达;Western blot检测KIM-1、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、E-cadherin、Bcl-2、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、caspase-3、细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)和磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白水平;RT-qPCR检测KIM-1 mRNA的表达;MTS检测细胞活力;TUNEL染色和annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡;流式细胞术检测细胞活性氧（ROS）水平。结果：与对照组比较,AGEs处理后的HK-2细胞中KIM-1蛋白、KIM-1 mRNA和α-SMA蛋白表达呈时间依赖性升高,E-cadherin蛋白表达和细胞活力呈时间依赖性降低,凋亡率呈时间依赖性升高,Bcl-2蛋白表达降低,Bax和cas...     

香菇多糖在体外对白血病HL-60细胞凋亡及PI3K/AKT信号通路的影响

目的:研究香菇多糖在体外对人白血病HL-60细胞凋亡的调节作用及其对PI3K/AKT信号通路的影响。方法:分别用浓度为0 mg/L、15 mg/L、30 mg/L和45 mg/L的香菇多糖作用于体外培养至对数期的HL-60细胞,24 h、48 h和72 h后用MTT法检测香菇多糖对HL-60细胞活力的抑制作用。用流式细胞术检测香菇多糖对HL-60细胞凋亡的影响,Western blot检测cleaved PARP、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和cleaved caspase-8、cytochrome C、PI3K、AKT和p-AKT的蛋白水平。用浓度为5 mg/L的PI3K抑制剂LY294002处理HL-60细胞72 h后,检测细胞的凋亡情况。结果:香菇多糖(15 mg/L、30 mg/L和45 mg/L)作用24 h、48 h和72 h后,HL-60细胞的活力受到抑制(P0.05),且具有浓度依赖性和时间依赖性。香菇多糖(15 mg/L、30 mg/L和45 mg/L)作用72 h后,以浓度依赖性的方式促进HL-60细胞的凋亡(P0.05)。30 mg/L香菇多糖诱导HL-60细胞凋亡过程中,cleaved PARP、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3及胞浆cytochrome C的蛋白水平随着处理时间的延长而明显升高,而caspase-8没有变化(P0.05);PI3K、AKT和p-AKT的蛋白水平随着香菇多糖浓度的增加而明显降低(P0.05)。PI3K通路抑制剂LY294002处理HL-60细胞与香菇多糖处理产生类似的凋亡效果(P0.05)。结论:香菇多糖可通过抑制PI3K/AKT信号通路诱导白血病HL-60细胞凋亡。     

AGEs对人主动脉内皮细胞线粒体融合蛋白表达的影响

目的:明确晚期糖基化终产物(AGEs)是否可引起内皮细胞线粒体融合蛋白Mfn1和Mfn2表达水平的变化。方法:AGEs用糖基化牛血清白蛋白(AGE-BSA)代替。将购买的原代人主动脉内皮细胞株进行体外扩增、传代、分组,进行AGEs干预,分为对照组,不同浓度梯度的AGEs干预组(50 mg/L、100 mg/L和200 mg/L)和干预不同时间组(分别是100 mg/L的AGEs干预人主动脉内皮细胞6 h、12 h、24 h和48 h)。采用实时荧光定量PCR方法对AGEs干预后的人主动脉内皮细胞Mfn1和Mfn2的mRNA表达水平进行检测;采用Western blot法对AGEs干预后的人主动脉内皮细胞Mfn1和Mfn2的蛋白表达水平进行检测。结果:不同浓度AGEs干预人主动脉内皮细胞24 h可引起Mfn1和Mfn2的mRNA和蛋白表达水平显著降低;100 mg/L AGEs干预人主动脉内皮细胞6 h,Mfn1和Mfn2的mRNA和蛋白表达水平与对照组相比无显著变化,而干预12 h、24 h和48 h均引起人主动脉内皮细胞Mfn1和Mfn2的mRNA和蛋白表达水平显著降低。结论:AGEs干预体外培养的人主动脉内皮细胞12 h后其线粒体融合蛋白Mfn1和Mfn2的表达水平降低,提示AGEs可能引起内皮细胞线粒体动力学的改变,并可能通过这一途径引起内皮细胞线粒体功能异常,而导致内皮细胞的功能异常。     

LC3蛋白在小鼠卵泡颗粒细胞中的表达及定位研究

目的:探讨自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3)在小鼠卵泡颗粒细胞中的表达及定位。方法:昆明小鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin,PMSG)前及注射后的第1、2、3、4、5天,采用免疫组织化学染色方法检测自噬相关蛋白LC3和凋亡相关蛋白cleaved caspase-3在卵泡中表达及共定位情况;促卵泡激素(follicle stimulating hormone,FSH)处理颗粒细胞后,Western blot检测LC3和cleaved caspase-3在颗粒细胞中的水平,免疫荧光方法对LC3在颗粒细胞中的亚细胞定位进行研究。结果:在小鼠卵泡发育的各个阶段,LC3蛋白主要在颗粒细胞中表达;免疫荧光显示在闭锁卵泡的颗粒细胞中cleaved caspase-3和LC3的蛋白水平较高;在PMSG腹腔注射后第1、2天,颗粒细胞cleaved caspase-3和LC3-II的蛋白水平减少(P0.05);在PMSG腹腔注射后第3、4、5天,颗粒细胞的cleaved caspase-3和LC3-II蛋白水平依次增加;LC3-II和cleaved caspase-3的蛋白水平具有相关性(r~2=0.8299,P0.05)。FSH处理后,LC3-II定位于颗粒细胞胞浆并呈点状分布。结论:LC3主要在卵泡颗粒细胞中表达,其表达具有细胞特异性和区域特异性,提示自噬在卵泡发育过程中主要在颗粒细胞中发生。卵巢颗粒细胞自噬和凋亡具有相关性,均呈促性腺激素依赖性。     

晚期糖基化终末产物通过氧化应激诱导大鼠软骨细胞损伤

目的:探讨晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)能否通过氧化应激引起大鼠软骨细胞损伤。方法:原代培养SD大鼠软骨细胞,对细胞表型进行鉴定;应用CCK-8法检测软骨细胞生存率;DCFH-DA染色荧光显微镜下检测胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的水平;Hoechst 33342核染色法及Annexin V-FITC/PI流式细胞法测定软骨细胞的凋亡率;RT-PCR法检测软骨细胞中Bax、Bcl-2、caspase-3、MMP3、MMP13和COL2的mRNA水平;Western blotting法检测软骨细胞中cleaved caspase-3、MMP3、MMP13和COL2的蛋白水平。结果:与对照组相比,AGEs可显著上调胞内ROS水平(P0.05),但经抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)抑制后ROS的生成明显减少(P0.05);另外,NAC可抑制AGEs引起的软骨细胞凋亡相关分子Bax/Bcl-2和caspase-3水平的上调,并减少MMP3和MMP13表达及COL2的丢失(P0.05)。结论:AGEs可通过氧化应激诱导大鼠软骨细胞损伤。     

miR-25对缺氧/复氧诱导的H9c2细胞凋亡的作用

目的:探讨微小RNA-25(miR-25)在缺氧/复氧诱导的H9c2细胞凋亡过程中的作用及机制。方法:构建miR-25高表达H9c2细胞系,行缺氧/复氧损伤处理,real-time PCR检测miR-25及高迁移率族蛋白B1(HMGB1)mRNA的表达,Western blot检测HMGB1及细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和cleaved caspase-3的蛋白表达水平,流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期的变化,明确miR-25的高表达对缺氧/复氧所诱导的H9c2细胞凋亡及HMGB1表达的影响。然后通过双萤光素酶报告基因验证miR-25与HMGB1的靶向关系,并构建转染HMGB1 shRNA的H9c2稳定细胞系,行缺氧/复氧损伤处理,验证HMGB1是否参与缺氧/复氧诱导的H9c2细胞凋亡的调控。结果:与对照组相比,高表达miR-25组的H9c2细胞在缺氧/复氧诱导后HMGB1表达下调,Bcl-2表达上调,cleaved caspase-3蛋白水平下调,流式细胞术提示处于S期的细胞增多,G1期减少(P0.01)。双萤光素报告基因显示,转染miR-25 mimic+野生型HMGB1-3’UTR报告基因载体组萤光素酶活性明显下降;转染miR-25 inhibitor+野生型HMGB1-3’UTR和转染miR-25 mimic+突变型HMGB1-3’UTR报告基因载体组萤光素酶活性没有变化。转染HMGB1-shRNA的H9c2细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表达上调,凋亡蛋白cleaved caspase-3蛋白水平下调,流式细胞术分析提示细胞凋亡减少,处于S期的细胞增多,G1期减少(P0.05)。结论:miR-25减少缺氧/复氧诱导的H9c2细胞凋亡,期作用机制可能与靶向调控HMGB1表达有关。     

糖尿病足伤口皮肤细胞凋亡情况及AGEs对人皮肤成纤维细胞凋亡的影响

 目的：检测糖尿病足伤口皮肤细胞凋亡情况,探讨晚期糖基化终产物（AGEs）对人皮肤成纤维细胞凋亡的影响。方法：选择36例足部伤口患者,糖尿病组18例,非糖尿病组18例。对2组临床和生化数据进行统计分析。采用免疫组化和TUNEL法检测伤口皮肤细胞凋亡情况。体外培养人原代皮肤成纤维细胞,分别给予正常浓度糖、持续高糖、波动高糖和AGEs干预72 h,采用蛋白质印迹法和流式细胞术测定细胞凋亡情况。结果：与非糖尿病组相比,糖尿病组血糖水平明显增高,伤口持续时间长（P<0.05）。Cleaved caspase-3在非糖尿病组和糖尿病组的免疫反应评分分别为1.04±0.23和3.04±0.31（P<0.05）;TUNEL检测非糖尿病组和糖尿病组的细胞凋亡指数分别为（3.8±0.8）%和（8.4±1.5）%（P<0.05）。人原代皮肤成纤维细胞在正常浓度糖、持续高糖、高糖波动、AGEs干预下,cleaved caspase-3蛋白表达水平分别为0.80±0.13、1.22±0.18、1.46±0.32和1.83±025,凋亡率分别为（2.43±0.19）%、（2.89±0.51）%、（3.99±0.24）%和（6.83±0.36）%。 AGEs组cleaved caspase-3蛋白表达水平和凋亡率均明显高于正常浓度糖组和持续高糖组（P<0.05）。结论：糖尿病皮肤创面细胞凋亡增加,可能是糖尿病皮肤伤口难愈的重要原因之一。与持续高糖、高糖波动组相比,AGEs促进人皮肤成纤维细胞凋亡的作用更强。     

槲皮苷通过抑制PI3K/AKT信号通路诱导胃癌SGC7901细胞凋亡

目的:探讨槲皮苷是否通过抑制PI3K/AKT信号通路诱导人胃癌SGC7901细胞凋亡。方法:选取SGC7901细胞作为研究对象,采用MTT法检测槲皮苷对SGC7901细胞的毒性作用并测定IC50值。实验分为对照组(不加药处理)、槲皮苷组(采用200μmol/L槲皮苷处理)、PI3K/AKT通路激动剂胰岛素样生长因子1(IGF-1)组(采用100μg/L IGF-1处理)和槲皮苷+IGF-1组(采用200μmol/L槲皮苷+100μg/L IGF-1共处理)。处理48 h后,采用流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot法检测cleaved caspase-3、p-AKT(Ser473)、AKT、p-PI3K(Tyr508)和PI3K的蛋白水平。结果:从100μmol/L开始,随着槲皮苷处理浓度的逐渐升高,SGC7901细胞活力显著降低(P 0. 05),槲皮苷作用48 h的IC50值为275. 40μmol/L。200μmol/L槲皮苷作用SGC7901细胞48 h后,与对照组比较,细胞凋亡率和cleaved caspase-3蛋白水平显著上升(P 0. 05),p-AKT和p-PI3K蛋白水平显著降低(P 0. 05),然而IGF-1与槲皮苷共同作用时,IGF-1可逆转槲皮苷对SGC7901细胞的作用效果。结论:槲皮苷能够诱导胃癌SGC7901细胞凋亡,其作用机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路的激活有关。     

丙泊酚对结直肠癌细胞生物学行为的影响

目的:研究丙泊酚对结直肠癌细胞活力、侵袭和凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法:10、25、50和100μmol/L的丙泊酚处理Lo Vo细胞72 h,或以100μmol/L的丙泊酚处理细胞12、24、48和72 h,CCK-8实验检测细胞活力;Transwell小室检测经100μmol/L丙泊酚处理72 h的细胞的侵袭能力;流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡率;Western blot检测基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、活化的胱天蛋白酶3(cleaved caspase-3)、Notch1和发状分裂相关增强子1(Hes1)的蛋白表达。结果:丙泊酚可抑制结直肠癌细胞活力;丙泊酚组细胞侵袭能力、S期细胞及MMP-2、MMP-9、Notch1和Hes1蛋白表达均显著低于对照组,而细胞凋亡率、G0/G1期细胞及cleaved caspase-3的蛋白水平均显著高于对照组(P0.01)。结论:丙泊酚可抑制结直肠癌Lo Vo细胞生长及侵袭能力,阻滞细胞周期,并诱导细胞凋亡,其机制与下调Notch1信号通路有关。     

肽基脯氨酰顺反异构酶抑制剂胡桃醌对宫颈鳞癌SiHa细胞凋亡的作用

目的:探讨肽基脯氨酰顺反异构酶抑制剂胡桃醌对宫颈鳞癌Si Ha细胞增殖和凋亡的影响及其促凋亡的机制。方法:选取处于对数生长期的Si Ha细胞,将其分为空白对照组和不同剂量(10、20、50、80及100μmol/L)胡桃醌给药组,共6组。采用MTT法观察胡桃醌对Si Ha细胞的抑制作用,并计算出半数抑制浓度(IC50=20.4μmol/L),依据IC50确定胡桃醌的有效浓度;选取与IC50接近的浓度(20μmol/L)通过Hoechst 33258及流式细胞术测定胡桃醌对Si Ha细胞凋亡的影响,Western blot检测凋亡相关蛋白caspase-3、8、9以及抑癌基因PTEN的蛋白水平。结果:MTT实验结果显示,与对照组比较,各给药组对细胞活力的抑制作用明显,差异有统计学意义(P0.05);Hoechst 33258检测表明,20μmol/L胡桃醌处理细胞12 h后可出现明显的细胞核典型凋亡细胞形态,流式细胞术检测结果说明胡桃醌可诱导Si Ha细胞出现早期凋亡;Western blot检测显示与正常对照组相比,20μmol/L胡桃醌处理细胞12 h后,cleaved caspase-3、8、9及PTEN的蛋白水平明显增加。结论:胡桃醌可以抑制Si Ha细胞的活力,并诱导细胞凋亡,其机制主要是通过抑制caspase途径并增加抑癌基因的表达。     

钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ通过介导凋亡加重H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤

目的:探讨钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(Ca~(2+)/calmodulin-dependent protein kinase II,Ca MKII)在H9c2心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤中的作用。方法:H9c2心肌细胞随机分为4组:正常对照(control)组、Ca MKII特异性抑制剂KN-93(1μmol/L)对照(KN-93)组、H/R组和KN-93+H/R组,其中KN-93组及KN-93+H/R组先用1μmol/L KN-93预处理2 h后,再进行其它处理。倒置显微镜观察各组H9c2心肌细胞的形态变化,CCK-8法检测各组H9c2心肌细胞的活力,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒检测各组培养基中LDH的活性,Western blot法检测Ca MKII及其底物受磷蛋白(phospholamban,PLN)的磷酸化水平以及凋亡相关蛋白cleaved caspase-3的表达,TUNEL染色和流式细胞术观察细胞凋亡。结果:与control组相比,KN-93组各项指标均无显著性差异;H/R组细胞皱缩,大量死亡,细胞活力明显降低,培养基中LDH活性明显升高(P0.01),Ca MKII及PLN的磷酸化水平和cleaved caspase-3的蛋白水平显著增加(P0.01),TUNEL染色阳性细胞数和流式细胞凋亡率显著增加(P0.01);1μmol/L KN-93干预H/R可明显改善细胞形态,增加细胞活力,降低培养基中LDH活性(P0.01),减少Ca MKII和PLN的磷酸化水平以及cleaved caspase-3的蛋白水平(P0.05),降低TUNEL染色阳性细胞数和流式细胞凋亡率(P0.01)。结论:Ca MKII通过介导细胞凋亡参与H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤。     

枸杞多糖减轻过氧化氢诱导的人内皮样细胞EA.hy926氧化损伤

目的:研究枸杞多糖(LBP)对过氧化氢(H_2O_2)诱导人内皮样细胞EA.hy926氧化损伤的作用及机制。方法:用H_2O_2建立EA.hy926细胞氧化损伤模型,细胞共分为5个组:正常对照(control)组、模型(damage)组(H_2O_2,50 mmol/L)、LBP(100 mg/L)组、抗损伤(anti-damage)组(50 mg/L、100 mg/L和200 mg/L LBP+50 mmol/L H_2O_2)和LY294002(20μmol/L)组。采用CCK-8法检测细胞的活力;用Annexin V/PI双染法流式细胞术检测不同处理后EA.hy926细胞的凋亡;吖啶橙(AO)/溴乙啶(EB)染色法观察细胞凋亡的形态特征;划痕法测定细胞的迁移能力;一氧化氮(NO)试剂盒检测细胞培养上清中NO的水平;用ELISA法测定血管内皮生长因子(VEGF)的水平;Western blot检测cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、内皮型NO合酶(eNOS)、p-eNOS和p-Akt的蛋白水平。结果:量效结果显示浓度为100 mg/L的LBP预处理EA.hy926细胞1 h,然后加入H_2O_2(50 mmol/L)处理24 h对减轻H_2O_2诱导的EA.hy926细胞损伤的作用最显著。与damage组比较,LBP预处理可提高EA.hy926细胞的活力(P0.05),减少细胞凋亡(P0.05),并促进细胞迁移;上清液中VEGF和NO水平升高;Bcl-2/Bax比率明显升高,下调cleaved caspase-3蛋白水平,并上调eNOS和p-eNOS蛋白水平。此外,加入PI3K抑制剂LY294002后,LBP对H_2O_2损伤的EA.hy926细胞的保护作用减弱,表现为NO水平和p-Akt蛋白水平降低。结论:LBP能减轻H_2O_2对EA.hy926细胞的损伤作用,缓解H_2O_2诱导的凋亡,其机制与激活PI3K/Akt/eNOS信号通路密切相关。     

Nodosin通过Apaf-1和caspase-3诱导HepG2细胞凋亡

目的:研究传统中药提取物nodosin对人肝细胞癌Hep G2细胞凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法:将nodosin设置为1. 25μmol/L、2. 5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L和20μmol/L不同浓度组,作用于Hep G2细胞24 h后,用Hoechst 33258染色和电镜观察不同浓度的药物对细胞形态学的影响,用流式细胞术检测细胞凋亡率,用RT-qPCR检测凋亡蛋白酶激活因子1 (Apaf-1) mRNA的表达,用Western blot检测caspase-3及其前体和活化体的蛋白水平。结果:形态学结果显示,随着用药剂量的增加,细胞皱缩和细胞核偏移越明显,凋亡小体在5μmol/L、10μmol/L和20μmol/L剂量组明显增多。Apaf-1 mRNA的表达增加,caspase-3及其前体的表达和cleaved caspase-3的蛋白水平随着用药剂量的增加逐渐增加(P 0. 01)。结论:Nodosin能够诱导Hep G2细胞凋亡。该作用可能是通过增加Apaf-1 mRNA的表达继之激活caspase-3实现的。