HDAC1调控Wnt/β-catenin信号通路对乳腺癌细胞凋亡的影响

目的:研究组蛋白脱乙酰酶1(HDAC1)对乳腺癌细胞凋亡的影响及机制。方法:RT-qPCR和Western blot法分别测定正常乳腺上皮细胞系MCF-10A和乳腺癌细胞系BT549、MCF-7和MDA-MB-231中HDAC1的m RNA和蛋白水平。在MDA-MB-231细胞中转染HDAC1 si RNA,RT-qPCR和Western blot测定HDAC1的表达水平,MTT法测定细胞活力,流式细胞术测定凋亡,Western blot测定细胞中β-连环蛋白(β-catenin)、c-Myc、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和cleaved caspase-3的蛋白水平。用Wnt/β-catenin信号通路激活剂处理下调HDAC1表达后的乳腺癌细胞,测定细胞活力和凋亡。结果:乳腺癌细胞系BT549、MCF-7和MDA-MB-231中HDAC1的m RNA和蛋白水平均明显高于正常乳腺上皮细胞系MCF-10A(P 0. 01),并且MDA-MB-231细胞中的HDAC1水平最高。HDAC1 si RNA可以降低乳腺癌细胞中HDAC1的m RNA和蛋白水平。敲减HDAC1表达后的MDA-MB-231细胞活力降低,细胞凋亡率升高,细胞中cleaved caspase-3水平升高,β-catenin、c-Myc和cyclin D1的蛋白水平降低(P 0. 05)。Wnt/β-catenin信号通路激活剂可以逆转HDAC1下调诱导的MDA-MB-231细胞凋亡和细胞活力降低,减少cleaved caspase-3的水平(P 0. 05)。结论:敲减HDAC1的表达可以通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活诱导乳腺癌细胞凋亡。     

转录因子Runx2对人乳腺癌MDA-MB-231细胞上皮-间充质转化能力的影响

目的:建立稳定敲减Runt相关转录因子2(Runx2)表达的人乳腺癌MDA-MB-231细胞系,探讨Runx2对MDA-MB-231细胞上皮-间充质转化(EMT)、转移和侵袭能力的影响。方法:利用LV-Runx2-RNAi慢病毒载体感染MDA-MB-231细胞,构建稳定低表达Runx2的MDA-MB-231细胞株,检测比较Runx2表达水平对MDA-MB-231细胞的形态及E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和基质金属蛋白酶9(MMP-9)蛋白表达的影响。侵袭实验和软琼脂集落形成实验分析比较抑制Runx2表达对乳腺癌细胞侵袭和非锚定生长能力的效应。结果:E-cadherin蛋白表达在敲减Runx2表达的MDA-MB-231细胞中明显高于常规MDA-MB-231细胞(P0.05),而N-cadherin、β-catenin和MMP-9蛋白表达在敲减Runx2表达的MDA-MB-231细胞中明显低于常规MDA-MB-231细胞(P0.05)。敲减Runx2表达的MDA-MB-231细胞侵袭和非锚定生长能力明显低于常规MDA-MB-231细胞(P0.05)。结论:在人乳腺癌MDA-MB-231细胞中抑制Runx2表达可以通过调控EMT相关蛋白的表达进而抑制乳腺癌细胞的EMT过程,从而对细胞的侵袭和转移起负调控作用。     

敲减HMGB1表达对TNF-α诱导的乳腺癌细胞侵袭能力的影响

 目的：探讨敲减高迁移率族蛋白B1（HMGB1）表达对肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导的乳腺癌细胞侵袭能力的影响及机制。方法：采用HMGB1小干扰RNA（siRNA）转染乳腺癌MDA-MB-231细胞,实时荧光定量PCR和Western blot分别测定细胞中HMGB1的mRNA和蛋白表达情况。用TNF-α处理敲减HMGB1表达的MDA-MB-231细胞,流式细胞术测定各组细胞凋亡,Transwell小室法测定各组细胞侵袭能力,细胞划痕实验测定各组细胞的迁移能力,Western blot法测定细胞中上皮钙黏素（E-cadherin）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）、神经钙黏素（N-cadherin）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）和Bax的表达情况。结果：HMGB1 siRNA转染后MDA-MB-231细胞中HMGB1的mRNA和蛋白表达水平明显低于没有转染的细胞（P<0.05）。与对照组相比,TNF-α处理后的乳腺癌细胞的凋亡水平升高,细胞侵袭和迁移能力也升高,细胞中E-cadherin蛋白水平降低,N-cadherin蛋白水平升高,MMP-2、MMP-9和Bax蛋白水平也升高（P<0.05）。敲减HMGB1表达的MDA-MB-231细胞经TNF-α诱导以后,细胞凋亡率增加,侵袭及迁移能力下调,细胞中E-cadherin蛋白水平升高,N-cadherin蛋白水平下降,MMP-2和MMP-9蛋白水平也下降,Bax蛋白水平升高（P<0.05）。结论：敲减HMGB1表达可以增强TNF-α诱导的乳腺癌细胞凋亡,抑制TNF-α诱导的乳腺癌细胞侵袭、迁移和上皮-间充质转化,其作用机制与MMP-2、MMP-9和Bax蛋白表达有关。     

Raptor通过Wnt3a/β-catenin信号通路对乳腺癌侵袭与转移的作用

目的探讨Raptor是否可以通过Wnt3a/β-catenin信号通路促进乳腺癌细胞的侵袭与转移。方法采用免疫印迹法(Western blotting)检测乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231(MDA231)中Raptor蛋白的表达情况;采用小RNA(RNAi)干扰技术将质粒转染MDA231,将过表达质粒转染MCF-7;趋化运动实验检测乳腺癌细胞的运动能力;Transwell侵袭实验检测乳腺癌细胞的侵袭能力;Western blotting检测上皮细胞-间充质转化(EMT)标志物的表达情况;核质分离实验检测β-联蛋白(β-catenin)的转核情况。结果 Western blotting法检测结果显示,Raptor在低转移细胞系MCF-7中低表达,而在高转移细胞系MDA231中高表达。转染后,SiRaptor/MDA231细胞组中Raptor蛋白的表达明显下降,MCF-7/Raptor细胞组中Raptor蛋白的表达明显升高,表明转染成功。用Wnt3a刺激处理后,趋化运动和Transwell侵袭实验结果显示,SiRaptor/MDA231细胞组运动和侵袭能力明显降低,MCF-7/Raptor细胞组运动和侵袭能力明显增强。Western blotting法检测结果显示,用Wnt3a和抑制剂Dkk1不同处理后,SiRaptor/MDA231细胞组中上皮-钙黏蛋白(E-cadherin)上调,波形蛋白(vimentin)下调,细胞核中β-catenin的表达降低,而MCF-7/Raptor细胞组中E-cadherin蛋白下调,vimentin蛋白上调,β-catenin蛋白的表达升高。结论 Raptor能通过Wnt3a/β-catenin信号通路促进EMT的发生,进而促进乳腺癌细胞的侵袭与转移。     

miR-125a-5p通过GSK-3β/Snail信号通路抑制乳腺癌细胞的上皮-间充质转化

目的:探讨微小RNA-125a-5p(miR-125a-5p)通过GSK-3β/Snail信号通路对乳腺癌细胞上皮-间充质转化(EMT)的影响。方法:RT-qPCR检测人正常乳腺上皮细胞与乳腺癌细胞中miR-125a-5p的表达量,同时检测miR-125a-5p质粒在人乳腺癌MDA-MB-231细胞中的转染效率;趋化运动实验与Transwell侵袭实验检测趋化运动能力和侵袭能力;Western blot检测EMT相关标志物的变化,同时检测磷酸化糖原合成酶激酶3β(p-GSK-3β)的蛋白水平及Snail的转核情况。结果:乳腺癌细胞中miR-125a-5p的表达量明显低于人正常乳腺上皮细胞(P0.05);miR-125a-5p在转染miR-125a-5p质粒的MDA-MB-231细胞中表达水平明显增高;MDA-MB-231细胞的趋化运动能力在表皮生长因子(EGF)浓度为10μg/L时最强;在EGF刺激下,与MDA-MB-231/NC细胞组相比,MDAMB-231/miR-125a-5p细胞组的侵袭能力明显降低,上皮钙黏着蛋白(E-cadherin)表达量升高,波形蛋白(vimentin)和p-GSK-3β的蛋白水平明显降低,同时Snail转核受到明显抑制;与MDA-MB-231/miR-125a-5p+Con细胞组相比,MDA-MB-231/miR-125a-5p+GAB2细胞组的侵袭能力明显增强,E-cadherin表达量降低,vimentin和p-GSK-3β的蛋白水平明显升高,同时促进Snail转核。结论:miR-125a-5p可通过GSK-3β/Snail信号通路抑制乳腺癌细胞的EMT,进而抑制乳腺癌细胞的侵袭能力。     

hsa-miR-4483促进人乳腺癌细胞系的增殖和迁移

目的探讨hsa-miR-4483在乳腺癌细胞系中表达及作用。方法利用TargetScan找出hsa-miR-4483可作用c-Myc基因;利用RT-qPCR对hsa-miR-4483的表达量进行验证。转染MCF-7和MDA-MB-231,并设置NC阴性对照,Western blot检测hsa-miR-4483作用c-myc基因的表达量,利用MTT法和Transwell小室法验证乳腺癌细胞的增殖及迁移的能力。结果 hsa-miR-4483在MCF-7和MDA-MB-231中显著低表达(P0.001,P0.01);MCF-7和MDA-MB-231的c-myc蛋白表达量上调(P0.05);hsa-miR-4483促进了MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖和迁移(P0.001)。结论 hsa-miR-4483可促进了乳腺癌细胞系的增殖以及迁移,其在乳腺癌的发展及其预后中起到调控的作用。     

敲减Rab1A表达通过抑制AKT的磷酸化抑制乳腺癌细胞的恶性生物学行为

目的:探究Rab1A基因表达的改变对乳腺癌细胞MDA-MB-231恶性生物学行为的影响。方法:Western blot检测Rab1A在乳腺癌组织及癌旁正常组织的表达和Rab1A在乳腺正常上皮及不同乳腺癌细胞系中的基础表达。设计并构建靶向Rab1A的小干扰RNA(siRNA),Western blot法验证敲减效果;分别采用CCK-8实验、划痕实验、Transwell实验、流式细胞术和Western blot观察Rab1A基因表达改变对乳腺癌MDA-MB-231细胞恶性生物学行为的影响和相关蛋白表达的改变。结果:Rab1A在乳腺正常组织和细胞中低表达,在癌组织及癌细胞中高表达(P0.05);与对照组相比,干扰Rab1A的表达可以显著抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的活力(P0.05),诱导凋亡增加(P0.05),G_2/M期细胞比例增加(P0.05),迁移与侵袭能力减弱(P0.05),p53、Bax、cleaved caspase-3和PTEN的蛋白水平升高(P0.05),Bcl-2、cyclin D1、cyclin B1、基质金属蛋白酶2(MMP2)、p-AKT和mTOR的蛋白水平降低(P0.05)。结论:Rab1A具有调控乳腺癌细胞生长、迁移、侵袭、细胞周期和凋亡的能力,并调控增殖、周期和凋亡相关蛋白的表达。干扰Rab1A可通过抑制AKT通路的磷酸化从而抑制乳腺癌的演进与发展;Rab1A可能是基因治疗乳腺癌的一个潜在靶点。     

XAV-939对三阴性乳腺癌抑制的作用

目的:探索XAV-939对三阴性乳腺癌的生长产生抑制作用及其机制.方法:体外检测XAV-939对MDA-MB-231细胞的增殖抑制作用,并检测Axin 1、Axin 2、β-catenin和p-β-catenin蛋白的表达以及VEGF-A的分泌水平.在体观察XAV-939对裸鼠移植瘤的体积和瘤重变化情况,并检测肿瘤组织中Axin 1、Axin 2、β-catenin和p-β-catenin蛋白的表达,以及VEGF表达、微血管密度、增殖指数及凋亡指数.结果:XAV-939可以抑制MDA-MB-231细胞的生长,其抑制作用呈浓度依赖型;同时XAV-939抑制了MDA-MB-231细胞分泌VEGF-A的能力.体内实验中,XAV-939可以明显抑制肿瘤组织生长;肿瘤组织的VEGF表达量下降,微血管密度下降;肿瘤组织的凋亡指数显著上升;增殖指数没有明显变化.体外体内实验均显示XAV-939处理组的Axin 1、Axin 2和p-β-catenin表达量明显上升而β-catenin显著下降.结论:XAV-939可以通过抑制Wnt/β-catenin通路在体内外抑制三阴性乳腺癌细胞/组织的增殖.     

IL-24对乳腺癌细胞CXCR4表达及肿瘤细胞侵袭、迁移及凋亡能力的影响北大核心CSCD

目的:探究过表达IL-24对乳腺癌细胞CXCR4表达及肿瘤细胞侵袭、迁移及凋亡的影响与机制。方法:免疫组织化学染色(IHC)检测乳腺癌与癌旁正常乳腺组织CXCR4与其配体CXCL12表达,并分析其相关性;Western blot检测CXCR4在人正常乳腺上皮细胞MCF-10A及乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-453和MDA-MB-231中的表达;采用慢病毒稳转技术在乳腺癌细胞系MDA-MB-231中过表达IL-24,免疫荧光显微镜、RT-PCR和ELISA检测感染效率;将细胞分为5组:LV-IL-24组(感染过表达IL-24慢病毒)、LV-NC组(感染阴性对照慢病毒)、AMD3100组(采用CXCR4/CXCL12轴阻滞剂AMD3100进行培养)、LV-IL-24+AMD3100组(采用AMD3100进行培养的感染过表达IL-24慢病毒的细胞)、阴性对照组(正常培养的MDAMB-231细胞);Transwell、划痕实验和Annexin V-FITC细胞凋亡实验检测上述各组细胞侵袭、迁移及凋亡;Western blot检测各组细胞CXCR4、AKT与mTOR蛋白磷酸化水平及凋亡相关蛋白Bax与cleaved-Caspase-3表达。结果:CXCR4与CXCL12在乳腺癌组织中的表达均显著高于正常乳腺组织,且二者表达呈正相关;与MCF-10A细胞相比,CXCR4在乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-453及MDA-MB-231中表达明显增加(P<0.05),以MDA-MB-231最为显著(P<0.01)。转染过表达IL-24的慢病毒后,MDA-MB-231细胞IL-24 mRNA与蛋白表达均显著增加(P<0.05);与阴性对照组相比,LV-IL-24组、AMD3100组和LV-IL-24+AMD3100组细胞侵袭、迁移能力均显著降低(P<0.05),而凋亡率明显提高(P<0.05),LV-IL-24+AMD3100组变化最为显著(P<0.01);Western blot结果显示,与阴性对照组相比,LV-IL-24组、AMD3100组和LV-IL-24+AMD3100组细胞CXCR4、AKT与mTOR蛋白磷酸化水平显著降低(P<0.05),而凋亡相关蛋白Bax与cleaved-Caspase-3表达明显增加(P<0.05),LV-IL-24+AMD3100组变化最为显著(P<0.01)。结论:乳腺癌细胞中过表达IL-24可抑制CXCR4表达,通过下调PI3K/AKT/mTOR信号通路降低肿瘤细胞侵袭、迁移能力,促进其凋亡,联合使用CXCR4/CXCL12阻滞剂AMD3100可显著提高IL-24的上述抑癌效应。     

Slc7a11通过E-cadherin/β-catenin信号通路诱导自噬促进乳腺癌细胞侵袭转移的作用机制研究

目的:探讨溶质载体家族7成员11(Solute carrier family7 member11,Slc7a11)对乳腺癌细胞侵袭转移的作用机制.方法:采用细胞划痕实验与Transwell实验检测Slc7a11对MDA-MB-231细胞迁移的影响,采用免疫印记(Western blotting,WB)检测Slc7a11对MDA-MB-231细胞黏附相关分子E-钙黏蛋白(E-cadherin)与β-连环蛋白(β-catenin)表达及自噬相关蛋白Beclin-1、LC3II和p62表达的影响.结果:与对照组比较,Slc7a11过表达组E-cadherin和β-catenin蛋白表达明显降低(P<0.05),细胞体外与迁移侵袭实验检测到,穿过Transwell小室的细胞数量明显升高(P<0.05).与对照组比较,干扰Slc7a11表达组E-cadherin和β-catenin蛋白表达明显升高,细胞体外与迁移侵袭实验检测到,穿过Transwell小室的细胞数量明显降低(P<0.05).过表达Slc7a11后,自噬相关基因包括Beclin-1和LC3II的表达明显上调,而p62表达明显降低(P<0.05).结论:Slc7a11能够调控细胞自噬促进乳腺癌细胞侵袭和转移,其主要机制可能与其下调细胞黏附分子E-cadherin/β-catenin复合体表达有关.     

VDUP1对乳腺癌细胞MCF-7增殖及迁移的影响

目的:探讨过表达/沉默维生素D3上调蛋白1(vitamin D3 up-regulated protein 1,VDUP1)基因对人乳腺癌细胞系MCF-7增殖和迁移能力的影响及相关作用机制。方法:通过基因过表达/干扰技术上调/下调乳腺癌细胞系MCF-7中VDUP1基因的表达;实时荧光定量PCR检测细胞中VDUP1的mRNA表达水平;CCK-8法、Brd U实验和Transwell细胞迁移实验分别用于检测细胞增殖和迁移能力;Western blot检测细胞中Akt、p-Akt、GSK3β和p-GSK3β的蛋白水平。结果:基因过表达/干扰技术可上调/下调乳腺癌细胞系MCF-7中VDUP1基因的表达;过表达VDUP1基因后,MCF-7的细胞活力、DNA合成和细胞迁移能力显著降低(P0.05),而沉默VDUP1基因后,MCF-7的细胞活力、DNA合成和细胞迁移能力则显著升高(P0.05)。此外,过表达VDUP1基因可下调p-Akt和p-GSK3β的蛋白水平(P0.05),而沉默VDUP1基因的结果则相反。结论:改变VDUP1基因表达水平可影响MCF-7细胞的增殖和迁移能力,其作用机制可能与Akt/GSK3β信号通路有关。     

siRNA下调RRM2抑制人乳腺癌细胞增殖与迁移及其裸鼠皮下移植瘤的生长

目的: 探讨siRNA下调核糖核苷酸还原酶M2(ribonucleotide reductase M2,RRM2) 基因对人乳腺癌细胞MCF-7体外增殖、迁移和体内成瘤的影响。方法: 实时定量荧光PCR (real-time PCR) 及Western blotting技术检测人乳腺癌细胞MCF-7和人正常乳腺上皮细胞MCF-10A中RRM2 mRNA及蛋白的表达;用合成的siRNA-RRM2不同时点和不同剂量转染MCF-7细胞,用real-time PCR检测对RRM2基因的沉默效率;用CCK-8方法检测细胞增殖;用Transwell细胞迁移系统检测siRNA-RRM2对MCF-7细胞迁移能力的影响;裸鼠移植瘤实验检测siRNA-RRM2沉默MCF-7细胞的RRM2基因后对肿瘤生长的影响。结果: MCF-7细胞RRM2 mRNA和蛋白比MCF-10A细胞高表达;用siRNA-RRM2转染MCF-7乳腺癌细胞能时间及剂量依赖性下调RRM2基因表达;CCK-8方法结果显示下调RRM2基因会时间及剂量依赖性抑制MCF-7细胞增殖,而人正常乳腺上皮细胞增殖没有显著变化;Transwell细胞迁移系统检测显示下调RRM2基因显著抑制了MCF-7细胞的迁移能力;转染siRNA-RRM2下调RRM2基因能显著抑制裸鼠移植瘤的生长。结论: RRM2的过表达与人乳腺癌细胞的高增殖和迁移能力有关,抑制RRM2的功能是治疗乳腺癌的一个潜在的治疗策略。     

p21 蛋白激活激酶4 在乳腺癌上皮间质转化中的作用研究

目的:探讨p21 蛋白激活激酶4(PAK4)在乳腺癌细胞上皮间质转化中的作用。方法:在乳腺癌MCF7 细胞中超表达PAK4,而在乳腺癌MDA-MB-231 细胞中干扰PAK4 表达,通过迁移和侵袭实验检测其对乳腺癌细胞迁移侵袭的影响,荧光定量法和免疫印迹分析检测PAK4、E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin mRNA 和蛋白质表达量变化,免疫印迹法检测EMT 相关转录激活因子Snail、Slug 表达量变化。结果:MCF7 细胞超表达PAK4 后,细胞的迁移侵袭能力显著增加,并且上皮标志分子E-Cadherin 蛋白表达下调,而间质标志分子N-Cadherin 和Vimentin 蛋白则表达上调,EMT 相关转录激活因子Slug 表达量增加;MDA鄄MB鄄231 细胞中,抑制内源PAK4 表达能显著降低细胞的迁移侵袭能力,上调E-Cadherin 蛋白表达,下调N-Cadherin、Vimentin 和Slug 蛋白的表达。结论:PAK4 通过上调Slug 促进乳腺癌发生上皮间质转化,可作为抑制乳腺癌转移的分子靶点。     

c-Met对三阴性乳腺癌细胞增殖及阿霉素耐药性的影响

目的:研究c-Met对三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231活力及对阿霉素耐药性的影响。方法:构建阿霉素耐药的MDA-MB-231/ADR细胞系,实时荧光定量PCR及Western blotting技术检测不同细胞系中c-Met mRNA及蛋白的表达。脂质体转染c-Met-siRNA及表达质粒或AKT-siRNA,Western blotting检测转染效率;四甲基偶氮唑法(MTT法)检测细胞的活力及对阿霉素的敏感性。结果:对阿霉素耐药的MDA-MB-231/ADR细胞中cMet的mRNA及蛋白表达均显著高于对照的MDA-MB-231细胞,转染高表达c-Met的质粒可增加MDA-MB-231细胞的活力并降低其对阿霉素的敏感性,而利用siRNA抑制耐药细胞株中c-Met的表达后,可以逆转MDA-MB-231/ADR细胞对阿霉素的耐药。此外,c-Met可以磷酸化激活细胞中的AKT,并通过该信号分子增加MDA-MB-231细胞活力并诱导耐药。结论:c-Met可作为一个重要的靶点应用于三阴性乳腺癌的治疗。     

芪三酚与人乳腺癌MDC1基因关系的研究

目的探讨芪三酚（Res）对人乳腺癌MDA—MB-231细胞增殖抑制的相关效应及其与MDCl基因的关系。方法以人乳腺癌MDA—MB-231细胞株为研究对象,采用MTS方法测定细胞增殖,应用吖啶橙荧光染色观察Res对乳腺癌MDA—MB-231细胞的影响,用RT-PCR与免疫印迹方法测定MDCl基因与蛋白表达水平,用小RNA干扰MDCl基因后,用流式细胞仪检测细胞的凋亡并观察其对Res的敏感性影响。结果40μmol／L以上的Res可显著抑制乳腺癌MDA—MB-231细胞的增殖（P〈0．05）,给予0、60、120μmol／LRes能明显降低MDCl基因和蛋白的表达（P〈0．05）。用小RNA干扰MDC1基因后,流式细胞术分析显示,实验组（MDCl．siRNA）的细胞凋亡率[（45．13±6．2）％]较阴性对照组[（24．34±2．6）％]和未处理组[（17．69±4．9）％]明显上升（P〈0．05）,MTS结果显示MDCl基因干扰后细胞对Res的敏感性增加。结论40μmol／L以上的Res可以抑制MDA-MB-231细胞的增殖,Res可以有效降低MDC基因和蛋白的表达并促进细胞的凋亡。用小RNA干扰MDCl基因（MDCl-siRNA）后,MDA-MB-231细胞对Res的敏感性增加。