反义寡核苷酸阻断乳腺癌细胞中葡萄糖神经酰胺合成酶的表达和意义

目的探讨靶向葡萄糖神经酰胺合成酶（glucosylceramide synthase,GCS）的基因试剂MBO－asGCS逆转乳腺癌多药耐药的作用机制及其意义。方法MBO-asGCS处理体外培养的人乳腺癌细胞MCF-7及其耐药型MCF-7／AdrR,采用细胞毒性分析测定MBO—asGCS对MCF-7-AdrR存活率的影响,RT—PCR和Western印迹分析对耐药型细胞GCS的表达变化,检测对caspase3／7的活性影响及流式细胞仪测定MBO-asGCS对耐药型细胞的凋亡情况。结果MBO-asGCS转染人耐药型乳腺癌细胞MCF-7／AdrR后,与未转染组细胞的Ic50分别是0．18μmol／L和12．50μmol／L,药物敏感性提高了69倍;MBO—asGCS抑制GCS的mRNA表达70％,减少GCS蛋白表达39％（P〈0．01）;转染MBO．asGCS后耐药型细胞的caspase3／7活性上升53％（P〈0．05）,细胞凋亡率上升5．6倍（P〈0．01）。结论GCS过表达是耐药型乳腺癌细胞的特征,靶向人GCS的反义寡核苷酸可直接抑制GCS的过表达,诱导耐药细胞凋亡,有效逆转其耐药性,GCS可能是治疗耐药型乳腺癌的一个潜在靶点。     

新型荧光薄层层析-分光光度计测定细胞内GCS酶活性

目的:通过建立一种新型的荧光薄层层析-分光光度法,精确而直接测定细胞内葡萄糖神经酰胺合酶GCS的活性,以评价其对耐药性肿瘤细胞的作用?方法:加入不同剂量的含荧光的NBD-C6-Ceramide,运用荧光薄层层析-分光光度法测定不同反应时间下人乳腺癌细胞MCF-7-AdrR中,葡萄糖神经酰胺(glucosylxeramide,GlcCer)和神经酰胺(ceramide,Cer)含量,计算两者的比值大小反映GCS酶活性情况,放射性酶学测定作为对照?Western-blot及免疫荧光分析MCF-7-AdrR及其转化细胞(MCF-7-adrR/GCS及MCF-7-adrR/asGCS)中GCS与P-糖蛋白(P-gp)的蛋白表达关系?结果:研究表明5 μmol/L NBD-Cer是细胞内神经酰胺糖基化作用的最佳浓度,糖基化作用随时间延长而增强,此方法精确测定MCF-7-AdrR各细胞及其它耐药型细胞中的GCS酶活性,MCF-7-adrR与 MCF-7-adrR/GCS较药物敏感组MCF-7的糖基化作用(GC/Cer)明显增强(P均<0.01),而在 MCF-7-adrR/asGCS中糖基化作用急剧下降(P < 0.01)?放射性酶学测定结果与之相符?Western-blot及免疫荧光显示GCS表达与耐药标志物P-gp表达在MCF-7-AdrR各细胞中呈明显相关?结论:不同于传统的同位素酶学测定,这种新型荧光薄层层析-分光光度法,是测定细胞内神经酰胺糖基化作用的一种简单易行?重复性好的实验方法,为进一步应用于耐药性肿瘤的体内实验奠定基础?     

靶向葡萄糖神经酰胺合成酶逆转乳腺癌多药耐药的研究

目的:探讨靶向葡萄糖神经酰胺合成酶(glucosylceramide synthase,GCS)对乳腺癌多药耐药的逆转作用及机制。方法:GCS反义寡核苷酸(GCSASODN)转染人耐药乳腺癌细胞MCF-7/AdrR,RT-PCR检测细胞GCS和多药耐药基因1(MDR1)mRNA的表达,免疫细胞化学染色检测细胞GCS蛋白和P-糖蛋白(P-gp)的表达,流式细胞仪分析细胞周期和凋亡。Caspase-3活性测定法检测Caspase-3活性改变。结果:GCSASODN转染人耐药乳腺癌细胞MCF-7/AdrR后,GCS和MDR1mRNA的表达水平分别为0.3、0.7,GCS蛋白和P-gp表达阳性率分别为23%、33%,GCS和MDR1的mRNA和蛋白水平较对照组有显著性差异(P<0.05)。转染后细胞周期改变不明显,但细胞凋亡增加为13.7±4.1,Caspase-3活性升高为0.0725±0.0003,与对照组差异有显著性(P<0.01)。结论:靶向GCS通过直接抑制GCS活性,并间接下调MDR1mRNA和蛋白表达,激活Caspase-3活性,诱导耐药细胞凋亡增加,有效逆转乳腺癌多药耐药。     

逆转胶囊对人乳腺癌MCF-7/ADR细胞中P-gp和MRP表达的影响

目的:检测逆转胶囊对乳腺癌耐药相关蛋白表达的影响,探讨其逆转乳腺癌多药耐药的作用机制。方法:流式细胞术、免疫印迹技术(Western-blot)检测逆转胶囊作用前后MCF-7/ADR细胞表面P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白(MRP)的表达。结果:逆转胶囊能显著抑制MCF-7/ADR细胞表面P-gp的表达,并可诱导MRP表达下降,其作用随血药浓度增加和作用时间的延长而增强。结论:逆转胶囊逆转乳腺癌多药耐药的机制与下调P-gp和MRP的表达有关。     

Alopecurone B逆转人乳腺癌细胞MCF-7阿霉素耐药株活性研究

目的 研究黄酮化合物Alopecurone B（APB）对人乳腺癌细胞阿霉素耐药株MCF-7/ADR多药耐药的逆转活性及逆转机制。方法 人乳腺癌细胞阿霉素耐药株MCF-7/ADR维持在含有250 ng/mL阿霉素的培养基中,使用MTT法、qPCR、Western blot和流式细胞术研究APB对耐药株P-糖蛋白(P-gp)功能和表达的影响。结果 APB能逆转MCF-7/ADR细胞多药耐药,抑制P-gp的功能,下调P-gp基因和蛋白的表达。结论 APB具有强效逆转人乳腺癌细胞MCF-7/ADR多药耐药的效果,其机制涉及对P-gp的调控。      

miR-145对人乳腺癌MCF-7/ADR细胞耐药逆转的作用机制研究

目的:探讨miR-145对人乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/ADR阿霉素耐药的影响及可能的作用机制。方法:采用实时定量PCR方法检测miR-145在乳腺癌细胞株MCF-7及MCF-7/ADR中的表达差异;脂质体转染法将构建好的miR-145 mimics,miR-145inhibitor成功转染进MCF-7/ADR细胞中,MTT法检测转染后MCF-7/ADR细胞对阿霉素的敏感性,流式细胞仪检测耐药细胞对阿霉素诱导凋亡的影响,Western blot检测转染前后抗凋亡蛋白Bcl-2、多药耐药基因MDR1表达蛋白P-gp的表达差异。结果:miR-145在人乳腺癌细胞株MCF-7/ADR中表达下降;上调miR-145可以增强MCF-7/ADR细胞对阿霉素的敏感性,显著抑制MCF-7/ADR细胞增殖,并促进阿霉素诱导的细胞凋亡,同时显著抑制了耐药细胞中Bcl-2和P-gp的表达。结论:miR-145通过抑制Bcl-2和P-gp蛋白的表达来增加MCF-7/ADR细胞对阿霉素的敏感性和凋亡。     

三羟异黄酮对人乳腺癌耐药细胞mdr-1、HER2/neu表达的影响

目的研究三羟异黄酮(Genistein,GEN)对体外培养人乳腺癌MCF-7/ADM耐药细胞中mdr-1、HER2/neu基因及蛋白表达的影响,探讨其逆转多药耐药机制。方法采用MTT法检测GEN作用MCF-7/ADM细胞后的细胞增殖抑制率(IR)和半数抑制浓度(IC50);RT-PCR法检测MCF-7/ADM细胞经不同浓度阿霉素(ADM)、GEN及GEN联合ADM处理后,其mdr-1、HER2/neu mRNA表达的变化;Western blot检测其对c-erbB2蛋白及P-糖蛋白(P-gp)的影响。结果 GEN对MCF-7/ADM细胞生长抑制作用明显,其抑制效应呈时间-剂量依赖性,特别是GEN浓度增加到60μg/mL时,对细胞抑制作用急剧升高(P<0.01)。MCF-7/ADM细胞中有mdr-1、HER2/neu过量表达,经GEN单独及联合ADM作用后,HER2/neu mRNA表达明显下调,c-erbB2蛋白出现一致性的表达下调,但对mdr-1mRNA及P-gp无影响。结论人乳腺癌MCF-7/ADM细胞耐药性与耐药基因及原癌基因的高表达相关,GEN能下调MCF-7/ADM细胞HER-2/neu基因及蛋白表达,可能是其逆转MCF-7/ADM细胞多药耐药性的机制之一,但对由P-gp介导的多药耐药无效。     

微波热疗对人乳腺癌阿霉素细胞MCF-7多药耐药蛋白及耐药性的影响

目的探讨微波热疗对人乳腺癌阿霉素细胞MCF-7和阿霉素耐药细胞MCF-7/ADM的多药耐药蛋白表达和耐药性的影响。方法应用Real-TimePCR法检测微波热疗对P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白(MRP)表达的影响和高效液相色谱法(HPLC)检测微波热疗对细胞内阿霉素浓度的影响。结果MCF-7/ADM细胞在微波热疗后4h和24h,P-gp、MRP表达量明显下降(P<0.01)。微波热疗以后肿瘤细胞内阿霉素(ADM)浓度有明显上升(P<0.01)。结论微波热疗抑制了耐药蛋白的表达,增加了细胞内的药物浓度,热疗可能是逆转化疗耐药从而提高化疗效果的一种有效手段。     

靶向survivin反义寡核苷酸对MCF-7乳腺癌细胞系Survivin mRNA及紫杉醇药物敏感性的影响

目的探讨靶向survivin基因的反义寡核苷酸（ASODN）对MCF-7细胞的增殖、凋亡及药物敏感性等生物学行为的影响。 方法采用脂质体介导survivin-ASODN转染MCF-7乳腺癌细胞系，RT-PCR检测survivin mRNA的表达，MTT法检测细胞增殖能力及对药物的敏感性，流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡。 结果survivin-ASODN可有效下调survivin表达水平，抑制细胞的生长，并呈时间剂量依赖关系；流式细胞术示，24h反义转染组细胞周期被阻滞于G2/M期，细胞凋亡率增加到15.23%。 紫杉醇作用早期（6h），survivin mRNA 表达增高，利于肿瘤细胞逃避紫杉醇诱导的细胞凋亡，增加肿瘤耐药的机会；反义转染组中细胞早期survivin mRNA表达上调受到抑制，对药物的敏感性增加。 结论survivin基因ASODN转染细胞后，下调survivin的表达，细胞凋亡增加，提高了对药物的敏感性。     

流式细胞术检测肿瘤耐药细胞中P-糖蛋白细胞前处理方法的优化

目的:优化流式细胞术(FCM)检测肿瘤耐药细胞中P-糖蛋白(P-gp)的细胞前处理方法,提高细胞中P-gp的检出率。方法:采用抗原决定簇在细胞膜内的单抗JSB-1,以阳性百分比为优化指标,耐阿霉素人乳腺癌细胞系MCF-7/A为模型细胞,对FACSTM透化溶液的有无、FACSTM透化溶液的浓度、FACSTM透化溶液处理细胞的时间、鼠抗JSB-1抗体的孵育时间、羊抗鼠IgG-FITC(GAMIF)抗体的孵育时间、JSB-1抗体工作液的保存条件、以及细胞数量进行优化。结果:上述细胞处理方法对MCF-7/A的阳性百分比均有不同程度的影响;相对最佳的细胞处理方法为:5×105-20×105个细胞用FACSTM透化溶液的6倍稀释液处理10min,37℃下与JSB-1抗体孵育75min、与GAMIF抗体孵育30min,JSB-1抗体工作液于4℃保存或新鲜配制。结论:对FCM检测前的细胞处理方法进行优化,能显著提高肿瘤耐药细胞中P-gp的检出率,因而更能真实、客观地反映肿瘤耐药细胞的P-gp表达水平及耐药程度。     

葡萄糖糖基神经酰胺合成酶特异性小干扰RNA表达载体的构建及其逆转乳腺癌细胞耐药的研究

目的　构建葡萄糖糖基神经酰胺合成酶(GCS)小干扰RNA表达载体,观察其对乳腺癌耐药细胞(MCF- 7 /ADR)GCS基因表达和耐药性的影响。方法　设计合成2对GCS基因的特异性siRNA,分别定向克隆入真核表达载体pSUPER,构建pSUPER -GCS1和pSUPER -GCS2重组质粒,脂质体LipofectAMINE2000介导转染MCF -7 /ADR细胞,空载体pSUPER转染作为对照,逆转录聚合酶链反应(RT- PCR)分析GCSmRNA的表达,流式细胞仪观察GCS蛋白的表达,四氮唑盐法检测阿霉素对MCF -7 /ADR细胞的半数抑制浓度(IC50 ),流式细胞技术检测细胞凋亡率的改变。结果　酶切分析和测序证实成功构建了针对GCS的siRNA表达载体pSUPER -GCS1和pSUPER GCS2。两对重组质粒均可特异性抑制GCS基因表达,转染后48hGCSmRNA抑制率分别为89 .4%、88. 5%,GCS蛋白含量分别下降为8 .3%±1 .0%, 9. 2%±0 .8%,四氮唑盐法显示重组质粒对阿霉素耐药性相对逆转率分别为93. 7%、91. 6%,明显提高了乳腺癌细胞对于阿霉素的药物敏感性,流式细胞仪结果表明细胞凋亡率增加为15. 38±1 .16, 13. 92±1 .73,而空载体对照组无以上作用。结论　GCS特异性siRNA表达载体构建成功,且有效抑制了GCS基因表达,并通过诱导耐药细胞凋亡率增加,逆转乳腺癌细胞多药耐药。     

Overexpression of glucosylceramide synthase and its significance in the clinical outcome of non-small cell lung cancer

Background Glucosylceramide synthase （GCS）,an enzyme responsible for ceramide glycosylation,plays an important role in multidrug resistance （MDR） in some tumors in vitro; however,its expression and clinicopathological significance in non-small cell lung cancer （NSCLC） remains unclear.Methods We evaluated GCS expression in 116 paired tumor and adjacent non-cancerous tissues and 50 frozen tissues from patients with NSCLC using immunohistochemistry and western blotting,and explored the correlation between GCS and NSCLC clinicopathological characteristics and prognosis.We observed the association between GCS and the MDR proteins P-glycoprotein （P-gp） and lung resistance-related protein （LRP） to determine the link between GCS and MDR at the histological level.Results GCS expression was significantly upregulated in NSCLC tumors compared with non-cancerous tissue.There was high GCS expression in 75/116 tumor specimens （64.7％） and 16/116 non-cancerous specimens （13.8％）.High GCS expression was significantly associated with poor differentiation （P=0.01）,lymph node metastasis （P=0.004）,recurrence/ distant metastasis （P=0.006）,and chemotherapy resistance （P=0.025）.Multivariate analysis demonstrated that GCS immunopositivity was an independent risk factor for survival （P=0.018）.P-gp was expressed in 80/116 tumors （69.0％） and in 12/116 non-cancerous tissue specimens （10.3％; P=0.001）; LRP was expressed in 85/116 tumors （73.3％） and 19/116 non-cancerous tissue specimens （16.4％; P=0.001）.Importantly,the results demonstrated that increased GCS expression in NSCLC cancer specimens correlated with increased expression of P-gp and LRP,molecules known to stimulate cancer cell MDR （r=0.612 and 0.503,P=0.01 and 0.035,respectively）.Conclusion GCS upregulation might contribute to the development of NSCLC and could be a useful prognostic indicator and chemoresistance predictor for NSCLC patients.     

绞股蓝总皂甙对P-糖蛋白高表达急性粒系白血病细胞化疗药物敏感性的影响

目的　观察GP对P -糖蛋白 (Pgp)高表达急性粒系白血病 (AML)细胞药物敏感性的影响。方法　采用S -P免疫组化法检测Pgp表达。应用MTT比色分析法测定药物敏感性。结果　 16.67% ( 2 / 12 )初治患者和 58.33% ( 7/ 12 )难治或复发AML患者Pgp表达增高 (P <0 .0 5) ;Pgp高表达的AML细胞对阿糖胞苷(AraC)和柔红霉素 (DNR)药物敏感性低于低水平表达者 (P <0 .0 1)。无细胞毒剂量GP显著增强AraC和DNR对Pgp高表达AML细胞增殖的抑制作用 (P <0 .0 1)。结论　AML细胞Pgp高表达和其多药抗性相关 ,GP能增加高水平Pgp表达AML细胞对化疗药物的敏感性     

人结肠癌细胞HCT-8/V及HCT-8中葡萄糖神经酰胺合成酶的表达

目的:观察人结肠癌HCT-8细胞和其耐药细胞株HCT-8/V中葡萄糖神经酰胺合成酶(CCS)的表达及意义.方法:体外培养HCT-8细胞和HCT-8/V,采用CCK8法检测2种细胞对长春新碱(VCR)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)及顺铂(DDP)的耐药性,计算IC50.采用免疫细胞化学法和RT-PCR法检测2种细胞中GCS蛋...     

P-糖蛋白1对宫颈癌化疗耐药的影响及机制

目的探讨P-糖蛋白1（P—gP）在宫颈癌细胞对依托泊苷耐药中的作用机制。方法观察不同分期宫颈癌组织和慢性宫颈炎组织中P—gP的表达差异。取Hela细胞分别用azithromycin和cyclosporine A处理6h后,再与依托泊苷孵育不同时间,高效液相色谱（HPLC）检测细胞内依托泊苷含量。将Hela细胞培养于培养皿或transwell小室中,用依托泊苷处理30min,再分别与azithromycin和cyclosporine共孵育,检测transwell下室培养液中依托泊苷含量,同时检测各组细胞凋亡情况及凋亡相关因子Bcl-2和Bax的表达水平。结果P．gP在宫颈癌组织中表达显著高于宫颈炎组织。azithromycin可增强依托泊苷对Hela细胞的损伤作用,并呈浓度依赖性地上调Bax表达,降低Bcl-2水平,而cyclosporine A则对Hela细胞有保护作用。Transwell培养实验发现,azithromycin增加Hela细胞层对依托泊苷的通透性,而cyclosporineA则降低其通透性。结论P—gP促使Hela细胞泵出依托泊苷,减轻细胞损伤,因此介导了宫颈癌对依托泊苷的耐药性。     

Modulating multidrug resistance gene in leukaemia cells by short interfering RNA

INTRODUCTION: The multidrug resistance gene, MDR1, is one of the genes responsible for resistance to chemotherapy in the treatment of leukaemia and other cancers. The discovery of RNA interference in mammalian cells has provided a powerful tool to inhibit the expression of this gene. However, very little is known about the transfection of leukaemia cells with short interfering RNA (siRNA) targeted at MDR1. This study aims to evaluate the effectiveness of two chemically-synthesised siRNA in modulating MDR1 gene and inhibiting P-glycoprotein expression in leukaemic cells. We also evaluated two siRNA delivery methods in this study. METHODS: K562/Adr was transfected with two MDR1-targeted siRNA or negative control siRNA, by using cationic lipid-based transfection reagents or electroporator. Gene expression of MDR1 was quantified by real-time polymerase chain reaction and calculated as a percentage relative to the negative control siRNA. P-glycoprotein expression was evaluated via flow cytometry and drug sensitivity after treatment was assessed by cytotoxicity assays. RESULTS: The percentage of MDR1 gene knockdown from cells transfected with an electroporator was significantly higher (84.4 percent, p-value is 0.094) compared to cells transfected with cationic lipid-based transfection reagents (52.8 percent). Both siRNA significantly reduced the expression of MDR1 by 84.9 percent (p-value is 0.001) and 86.0 percent (p-value is 0.011), respectively. P-glycoprotein expression was down-regulated and drug sensitivity was increased after treatment with the siRNA. CONCLUSION: This study shows that the two siRNA sequences are capable of modulating MDR1 and P-glycoprotein expressions and increased drug sensitivity. Transfection with an electroporator was superior to chemical transfection for leukaemia cells.     

米非司酮调控卵巢癌细胞表达葡萄糖神经酰氨合成酶并逆转其多药耐药性

目的 观察米非司酮体外逆转COC1/DDP细胞对顺铂的多药耐药性(MDR)以及对细胞葡萄糖神经酰氨合成酶(GCS)表达的影响,初步探讨其增敏机制.方法 以米非司酮为MDR修饰剂,MTT法检测米非司酮对COC1/DDP的增敏效应.RT-PCR技术分析耐药株COC1/DDP的MDR逆转前后以及亲本株COC1细胞的GCS在mRNA水平的表达.结果 米非司酮增强COC1/DDP细胞对DDP敏感性;与COC1相比,COC1/DDP细胞的GCS在mRNA水平的表达增强;米非司酮使GCS表达降低,效应呈剂量依赖关系.结论 无毒性剂量米非司酮可以在体外增加卵巢癌COC1/DDP细胞对DDP的敏感性.作用机制与抑制GCSmRNA表达有关.     

植物多酚类化合物逆转肿瘤多药耐药的筛选

目的：研究槲皮素，小檗碱，黄芩甙，芦丁，牛蒡子甙逆转肿瘤多药耐药（MDR）的作用及机制。方法：MTT法检测槲皮素，小檗碱，黄芩甙，芦丁，牛蒡子甙的细胞毒性作用及耐药逆转效果。流式细胞术检测槲皮素作用前后MCF-7/ADR细胞P-糖蛋白（Pgp)表达的变化。结果：小檗碱能显著抑制MCF-7/ADR及MCF-7细胞的增殖，槲皮素，黄岑甙，芦丁能显著抑制MCF-7细胞增殖，槲皮素能提高MCF-7/ADR细胞对阿霉素的敏感性，逆转倍数为3.19，并能降低MCF-7/ADR细胞Pgp的表达。结论：槲皮素能够部分逆转多药耐药，其逆转机制与下调Pgp表达有关。