骨髓间质干细胞体外诱导为心肌细胞的实验研究

目的:探讨骨髓间质干细胞(MSCs)体外诱导分化为心肌细胞的可行性,为心肌梗死治疗提供理想的细胞材料。方法:分离大鼠下肢骨获取MSCs进行培养;5-氮胞苷(5-aza)诱导24h后继续培养;免疫细胞化学检测细胞对连接蛋白-43和α横纹肌肌动蛋白的表达;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)进一步了解心肌细胞特异性蛋白的表达。结果:MSCs经5-aza诱导后,细胞形态不规则;诱导后3周10μmol/L 5-aza组细胞连接蛋白-43、α横纹肌肌动蛋白表达阳性。RT-PCR显示10μmol/L 5-aza诱导后3周的细胞可表达心肌肌钙蛋白I、α心肌肌动蛋白。结论:MSCs体外经5-aza诱导后可分化为心肌细胞。     

骨髓干细胞诱导转化成心肌细胞的实验研究

目的探讨骨髓基质干细胞(BMCs)在5-氮杂胞苷(5-aza)的作用下是否能向心肌细胞转化。方法用梯度离心法分离大鼠BMCs;用不同浓度的5-氮胞苷对BMCs进行体外诱导转化,并使用心肌特异性抗体(肌钙蛋白I和肌凝蛋白重链)对诱导后的BMCs进行免疫组织化学染色,光镜和电镜观察。结果分离培养后的BMCs生长密集,形态呈纺锤状,在5μmol/L和10μmol/L 5-aza的诱导下分化成类心肌细胞,前者诱导后生长更好。HE染色细胞质嗜酸性,免疫组织化学染色心肌特异性抗体阳性。电镜发现胞核居细胞中央,肌丝和幼稚肌结形成。结论在5-aza的诱导下,BMCs能转化成心肌细胞,5μmol/L 5-aza的诱导效果更好。     

5-氮胞苷诱导间质干细胞为心肌细胞的实验研究

分离SD大鼠下肢骨,培养获得骨髓间质干细胞（MSCs）,经5-氮胞苷（5-aza）定向诱导24h后t用免疫细胞化学法检测诱导细胞对连接蛋白43和α横纹肌肌动蛋白的表达,用逆转录-聚合酶链反应鉴定心肌细胞特异性蛋白的表达情况。结果显示,MSCs经5-aza诱导后,细胞形态不规则;3周后5-aza 10μm组细胞连接蛋白43、α横纹肌肌动蛋白阳性表达;RT-PCR显示细胞表达心肌肌钙蛋白Ⅰ、α心肌肌动蛋白。提示5-aza可体外诱导MSCs分化为心肌细胞,用于心肌梗死的治疗。     

心肌细胞裂解液对骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化诱导作用的研究

目的通过向骨髓间充质干细胞(MSCs)培养体系中添加心肌细胞裂解液的方法,体外模拟心肌微环境,观察MSCs向心肌细胞分化的诱导作用,并与诱导分化剂5-氮杂胞苷(5-aza)比较。方法分离新生乳鼠的心肌细胞并制成心肌细胞裂解液,自成年大鼠骨髓中分离MSCs,用含有心肌细胞裂解液的培养基(A组)、含有5-aza的培养基(B组)、含有5-aza和心肌细胞裂解液的培养基(c组)以及普通培养基(对照组)培养。观察细胞形态的改变,并通过免疫组化分析分化后细胞表达α-肌动蛋白、心脏特异性肌钙蛋白T(cTnT)、连接蛋白43及CD31的情况。结果A、B组的MSCs在培养1周后均形成肌细胞形态,并且均表达α-肌动蛋白和cTnT;A组MSCs分化的肌样细胞所含的肌纤维较B组更丰实,细胞生长趋势也优于B组,并且可以表达CD31;B组MSCs分化的肌样细胞不表达CD31;对照组细胞仅表达α-肌动蛋白。结论心肌细胞裂解液是体外诱导MSCs分化为心肌样细胞的理想条件,优于传统的5-aza,在心肌细胞移植技术中可以用于体外模拟心肌细胞微环境。     

骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌细胞

目的观察5-氮杂胞苷(5-aza)体外诱导分化骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)成为心肌细胞的作用,并为进一步体内研究而进行细胞标记.方法提取小型猪骨髓20ml,体外分离培养骨髓间充质干细胞,分为对照组和诱导组,其中诱导组在培养第3天加入5-aza(10 μmol/L),分别在培养2周和4周时观察两组细胞光镜、电镜下形态,4周时进行磷钨酸-苏木素染色(PTAH)和肌动蛋白(actin)免疫组化染色.诱导组MSCs加入5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU,5μg/ml),分别在作用后第2周和第4周,利用BrdU单克隆抗体免疫组化检测BrdU标记方法.此外,用含有LacZ基因的复制缺陷腺病毒转染诱导组MSCs,利用X-gal染色检测LacZ基因表达的半乳糖苷酶,观察诱导分化后MSCs的体外标记情况.结果体外能够成功地分离骨髓MSCs,5-aza诱导分化2周和4周后的MSCs在光镜下明显成为梭形,形态类似肌细胞.电镜下诱导分化后的MSCs在2周时出现肌丝结构,4周时肌丝明显增多.PTAH染色显示超过70%的细胞具有横纹肌的染色性质,actin免疫组化染色显示超过80%的诱导后MSCs肌动蛋白呈阳性表达.体外BrdU单克隆抗体检测BrdU掺入到MSCs细胞核中,X-gal染色证明LacZ基因能够进入MSCs并表达,两种体外标记方法在标记2周和4周时都为阳性.结论5-aza能够诱导骨髓MSCs成为心肌细胞,BrdU掺入和含有LacZ基因的复制缺陷腺病毒转染能够成功对诱导分化后MSCs进行标记,并且标记持续至少4周.     

体外培养和诱导人脐带源间充质干细胞定向分化为心肌细胞的实验研究

目的探讨体外培养并应用5-氮胞苷（5-aza）诱导人脐带源间充质干细胞（hUC MSCs）是否能分化为心肌细胞。方法足月顺产或剖宫产患者的脐带在无菌条件下剪碎后采用贴壁培养法分离、纯化hUC MSCs,采用5-aza对P3代hUC MSCs进行诱导24 h后继续培养4周,采用倒置显微镜观察细胞形态学的变化,同时采用免疫组织化学方法测定肌钙蛋白I（cTnI）的表达。结果采用贴壁培养法可从脐带组织获得大量hUC MSCs。5-aza诱导4周后免疫组织化学鉴定cTnI表达阳性。结论人脐带贴壁培养可获得大量的hUC MSCs,hUC MSCs体外经5-aza诱导可定向分化为心肌细胞。     

心肌细胞裂解成分诱导骨髓间充质干细胞分化的超微结构观察

目的:观察骨髓间充质干细胞(MSCs)在心肌细胞裂解成分作用下超微结构改变,了解心肌细胞裂解成分对MSCs分化的诱导作用。 方法:分离并裂解新生大鼠的心肌细胞;自成年大鼠骨髓中分离MSCs;将分离的MSCs分3组培养:仅用普通培养基培养(对照组);5-氮杂胞苷(5-aza)诱导后用普通培养基培养(5-aza诱导组);含有心肌细胞裂解成分的培养基培养(心肌细胞裂解成分培养组)。培养1周,观察细胞形态及超微结构的改变,对培养的细胞进行抗心脏特异性肌钙蛋白T(cTnT)及抗分化决定簇31(CD31)细胞免疫化学染色,并分析各组细胞的增殖情况。 结果:对照组MSCs无明显的肌样细胞或内皮样细胞形成,抗cTnT和抗CD31染色阴性。5-aza诱导组部分MSCs分化为肌样细胞,电镜下可见大量细胞器空化,抗cTnT染色阳性,但细胞增殖缓慢。心肌细胞裂解成分培养组的MSCs分化为肌样细胞,电镜下可见肌丝样结构,抗cTnT染色阳性,细胞增殖旺盛,另见部分MSCs分化为内皮样细胞,形成内皮细胞特有的胞质突起和质膜小泡等超微结构,且抗CD31染色阳性。 结论:含有心肌细胞裂解成分的培养基可以诱导MSCs向心肌样细胞和内皮样细胞方向分化。     

犬骨髓间充质干细胞体外分离培养、诱导分化为心肌细胞实验研究

目的 观察犬骨髓间充质干细胞(BMSCs)分离体外培养的生长特性及诱导分化为心肌细胞.方法 利用骨髓穿刺,Percoll分离液密度梯度离心法分离穿刺骨髓细胞继而通过贴壁筛选纯化骨髓间充质干细胞进行接种培养、体外扩增经5-氮胞苷(5-azacytidine)诱导分化为心肌样细胞.倒置显微镜观察诱导前后细胞形态变化,流式细胞分析及免疫化学进行相关免疫抗原检测.结果 分离细胞流式细胞分析细胞表面分子抗原CD105(间充质干细胞抗原)阳性,CD34(造血干细胞表面抗原)阴性,CD31(内皮主细胞表面抗原)阴性.利用5-溴-2-尿嘧啶脱氧核苷(Brdu)进行细胞增殖标记,结果增殖细胞核标记率为(77.2±6.1)%.传4代后,经5-aza诱导,细胞形态发生改变,由梭形变为"心肌样",同时有自发性细胞搏动和"肌管"样结构.免疫化学检测分化细胞肌球蛋白重链(MHC)、心肌特异性肌钙蛋白I(cTnI)、连接蛋白-43(Cx-43)等心肌细胞特异蛋白表达阳性.结论 BMSCs分离纯化在体外培养条件下可以实现大量扩增,同时维持其未分化状态.与5-氮杂苷(5-azacytidine)共培养,可以诱导其分化为心肌样细胞.BMSCs是细胞移植"心肌再生"治疗缺血性心脏病的理想种子细胞来源.     

犬骨髓间叶干细胞体外定向诱导分化心肌细胞的实验研究

目的:旨在建立骨髓间叶干细胞(MSCs)体外定向诱导分化心肌细胞的方法,为心肌疾患的移值修复治疗提供成体干细胞来源.方法:利用Percoll密度梯度法及MSCs黏附贴壁生长特性进行分离培养与扩增骨髓MSCs,并予以鉴定证实.应用5-氮胞苷对培养早期的骨髓MSCs进行定向诱导分化心肌细胞.通过细胞形态学、细胞免疫组化、透射电镜等技术观察分化细胞的肌管,心肌细胞特异性蛋白与细胞特异性超微结构以鉴定诱导分化的效果.结果:利用Percoll密度梯度法与细胞黏附贴壁生长特性,可分离培养与扩增足量骨髓MSCs.应用化学诱导剂5-氮胞苷10～20 μmol/L孵育早期培养的骨髓MSCs4～5周,可见细胞形成肌管;肌细胞特异性蛋白α-肌动蛋白,肌球蛋白以及心肌细胞特异性分子标志肌钙蛋白I免疫组化染色阳性;透射电镜可见肌丝与房性颗粒.结论:骨髓MSCs可在体外5-氮胞苷的诱导下定向转化为具有典型结构的心肌细胞.     

5-氮胞苷体外诱导成人脂肪间充质干细胞分化为心肌样细胞的初步研究

目的:探索不同浓度5-氮胞苷(5-aza)在不同诱导时间下对成人脂肪间充质干细胞(ADMSCs)分化为心肌细胞的诱导作用,确定最佳诱导条件。方法:体外分离成人脂肪组织来源的间充质干细胞并进行传代培养,流式细胞仪鉴定细胞CD44、CD34的表达,用含不同浓度5-aza(3、5、10、15、20μmol／L)培养基分别诱导12小时、24小时、48小时、72小时,倒置相差显微镜下逐日观察细胞形态变化;于诱导后14、28天时免疫细胞化学染色鉴定心肌特异性肌钙蛋白I(cTn-I)的表达,分析细胞转化率。结果:分离培养的ADMSCs表达CD44,不表达CD34;5-aza诱导后14天时免疫细胞化学未见有心肌细胞特异性cTn- I表达,诱导28天细胞免疫细胞化学显示cTn-I表达阳性,以10μmol/L 5-aza诱导24小时为最佳体外诱导条件。结论:成人脂肪组织间充质干细胞可在体外5-aza诱导下向心肌细胞分化。     

Sensitivity to 5-azacytidine of blast progenitors in acute myeloblastic leukemia

In a previous study, we showed that the blast stem cells of acute myeloblastic leukemia (AML) were more sensitive to cytosine arabinoside (ara-C) when growing in suspension culture than during colony formation in methylcellulose. We suggested that the difference might be explained by considering the cellular mechanisms responsible for growth in suspension and colony formation. In the former, the clonogenic cells increase in number (self-renewal); in the latter, most of the divisions are terminal. The increased sensitivity to ara-C in suspension might then be attributed to its ability to inhibit self-renewal to a greater degree than cell division generally. A test of this hypothesis would be to compare the survival curves in suspension and in methylcellulose using a drug that spared or stimulated self-renewal. Such an agent is 5- azacytidine (5-aza) and has the additional advantage that its analogue, 6-azacytidine (6-aza) has no effect on self renewal. The data supported the hypothesis, since clonogenic AML blasts were much less sensitive to 5-aza in suspension than in methylcellulose. The effect of 6-aza, while qualitatively similar, was much less marked. Controls showed that the difference in survival curves could not be explained on a kinetic basis or by the secretion of growth factors by 5-aza-treated cells. We suggest that a comparison of the effects of drugs in suspension and in methylcellulose may be useful in preclinical screening of putative anti- AML compounds.     

5-氮胞苷对培养兔骨髓基质细胞心房利钠肽表达的影响

目的研究5-氮胞苷(5-azacytidine,5-aza)对体外培养兔骨髓基质细胞中心肌特异性心房利钠肽(atrialnatriureticpolypeptide,ANP)表达的影响,探讨骨髓基质细胞向心肌样细胞分化的条件。方法体外分离培养兔骨髓基质细胞用不同浓度5-aza诱导培养,以RT-PCR方法测定诱导前后ANP的表达。结果正常培养兔骨髓基质细胞不表达ANP。经5-aza诱导并继续培养24h后,骨髓基质细胞表达ANP,在一定时间、浓度范围内ANP含量逐渐增加。结论5-aza诱导体外培养兔骨髓基质细胞表达心肌特异性ANP,与诱导时间及浓度呈正相关,提示可诱导兔骨髓基质细胞向心肌样细胞分化。     

Wnt/β-catenin通路在大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞过程中的作用

目的 探讨Wnt/β-catenin信号通路在大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs)分化为心肌细胞过程中的作用。 方法 选BMMSCs为种子细胞培养到第3代,分为血管紧张素(Ang) Ⅱ+ 5-氮杂胞苷(5-aza)组及对照组,共诱导24 h,再用完全培养液共培养4周。用倒置显微镜、MTT法检测、流式细胞、免疫荧光染色、透射电镜依次检测细胞的形态变化、生长能力、诱导分化率、α肌动蛋白（α-actin）的表达以及超微结构,用Western blot法检测诱导后Wnt及其下游分子β-catenin的表达水平。 结果 BMMSCs原代培养时呈现多种形态,经过传代体积增大,诱导后呈长梭形且均匀一致生长。MTT结果表明AngⅡ + 5-aza组细胞的生长速度比对照组快。流式细胞检测示:AngⅡ + 5-aza组的心肌细胞诱导率是（31.2 ± 1.7）%,而对照组是（1.1± 0.2）%。免疫荧光染色结果示AngⅡ + 5-aza组诱导后的BMMSCs阳性表达α-actin。透射电镜观察可见肌丝和缝隙连接。Western blot提示AngⅡ + 5-aza组的Wnt以及β-catenin的表达明显高于对照组（P < 0.05）。 结论 AngⅡ+ 5-aza在诱导BMMSCs向心肌细胞的分化中有促进作用,其可能与Wnt/β-catenin信号通路的激活有关。     

体外诱导人脐血间充质干细胞未能向心肌细胞转分化

目的选择从人脐带血中分离出的间充质干细胞(UCB1-MSCs),通过5-氮胞苷(5-aza)进行诱导,对其体外向心肌细胞转分化的能力做初步探讨。方法培养第11代 hMSCs,加入6、9、12 μmol/L 的5-aza 分别作用24h 和48h,相差显微镜观察细胞形态直到3周后实验结束。以未经处理的细胞为对照组。采用 RT-PCR 检测心肌转录因子 MEF2C、GATA4、Nkx2.5和心肌特异性基因 MLC-2v、MLC-2a、Connexin 43及α-actinin 的表达;免疫荧光染色检测 Connexin 43和α-actinin 的表达,以共聚焦显微镜成像。结果经5-aza 诱导后观察3周未见细胞的自发搏动。诱导前后的 hMSC 均可不同程度的表达 MEF2C、Connexin 43及α-actinin。在12 μmol/L 水平诱导24h 和6、9、12 μmol/L 水平诱导48h 共4个组中可见 MLC-2a 的表达。GATA4、Nkx 2.5和 MLC-2v 在诱导前后均未见表达。免疫荧光染色显示诱导前后 hMSCs 的胞浆内存在散在排列无序的α-actinin 和 Connexin 43荧光,而始终未见肌小节结构。结论经5-aza 诱导 UCB 来源 hMSCs 在基因水平可以表达部分心肌特异性基因,但是在诱导后的一个月时间内未见相应的心肌特异性结构出现,此类细胞向心肌细胞转分化的能力需再证实。     

间充质干细胞分化为心肌样细胞与P120连环蛋白mRNA表达

目的：研究5-氮杂胞苷（5-azacytidine，5-aza）诱导体外骨髓间充质干细胞（marrow measenchymal stem cells，MSCs）向心肌细胞发展的作用及其机制。方法：从Wistar大鼠骨髓中获得MSCs，培养传代后用不同浓度的5-aza诱导，倒置光显微镜和透射电镜观察诱导前后细胞形态变化；流式细胞术检测细胞周期改变；MTT法检测5-aza对MSCs生长的影响；免疫细胞化学法检测肌红蛋白、结蛋白和肌动蛋白的表达；RT-PCR检测P120连环蛋白1A mRNA的表达。结果：5-aza对MSCs有抑制增殖的作用（P〈0．05）；在光镜和透射电镜下可见有心肌样细胞的形态变化；免疫细胞化学检测结果表明，MSCs的经5-aza诱导14d，肌红蛋白、结蛋白和肌动蛋白的表达均较对照组显著增高（P〈0．01）；PT—PCR结果表明P120连环蛋白mRNA表达明显，而对照组未见表达。结论：MSCs可在体外被5-aza诱导分化成心肌样细胞，这可能与P120连环蛋白1A mRNA表达有关。     

丁酸钠和5-aza诱导间充质干细胞向心肌细胞分化的研究

目的探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠（sodiumbutyrate）和DNA甲基化抑制剂5-aza对骨髓间充质干细胞（BMSCs）向心肌细胞分化的影响。方法常规培养大鼠BMSCs,细胞分为4组：依次加入丁酸钠0mM,0.5mM,1.0raM,2.0mM。MTT和流式细胞仪检测不同浓度丁酸钠对细胞增殖和凋亡的影响。4周后利用western blot和免疫荧光检测4组细胞的心肌细胞特异性蛋白的表达。从上述4组中选出诱导能力最强的丁酸钠组与5-aza组成4个实验组：阴性对照组,5-aza组,丁酸钠组,5-aza.L丁酸钠组。作用4周后检测心肌细胞特异性蛋白的表达。结果丁酸钠抑制细胞增殖,具有浓度依赖性,而对细胞凋亡没有明显影响。检测发现丁酸钠和5-a．za均能有效诱导BMSCs分化为心肌细胞,丁酸钠诱导分化最适浓度为1.0mM。同时1．0mM丁酸钠诱导分化效率高于5-aza。除此,5-aza和丁酸钠共同作用于BMSCs,其诱导分化能力明显高于其它组。结论丁酸钠能够有效诱导BMSCs向心肌细胞分化,丁酸钠浓度为1．0mM时诱导能力最强,同时诱导分化率高于5-aza。5-aza和丁酸钠一起作用诱导BMSCs向心肌细胞分化的能力明显高于其它组,间接证明DNA去甲基化和组蛋白乙酰化具有协同作用。丁酸钠在有效作用浓度范围内,虽然抑制BMSCs增殖,但是不影响细胞凋亡,表明丁酸钠具有低毒的特性,为以后丁酸钠应用于临床打下实验基础。     

The effect of 5-azacytidine and its analogues on blast cell renewal in acute myeloblastic leukemia

Blast cells from patients with acute myeloblastic leukemia were exposed to 5-azacytidine (5-aza) and its analogues 5-aza 2'-deoxycytidine (5-aza-dr) and 6-azacytidine (6-aza). Simple negative exponential survival curves were obtained for the three drugs, but the sensitivity varied; 5-aza-dr was most toxic, 6-aza was least toxic, and 5-aza was intermediate. Colonies surviving drug exposure were replated; 5-aza and 5-aza-dr were found to increase secondary plating efficiency, whereas 6-aza was inactive. The findings provide indirect evidence for a role for DNA methylation in the regulation of blast cell self-renewal.     

Impact of the hypomethylating agent 5-azacytidine on dendritic cells function

Recent evidence suggested that 5-azacytidine (5-aza) can impact important immune functions via epigenetic modifications, making it an attractive candidate for pharmacologic manipulation of the immune system. The aim of this work was to study the effects of 5-aza on human dendritic cells (DC) generated from peripheral blood monocytes, and to test the type of immune response induced in patients treated with 5-aza. On the phenotypic level, CD40 and CD86 expression was significantly increased on mature DC exposed to 5-aza (5-aza-DC), compared with control untreated DC. Mature control DC and mature 5-aza-DC secreted comparable amounts of interleukin (IL)-6, IL-12p70, IL-23, and tumor necrosis factor-α. However, mature 5-aza-DC secreted significantly lower levels of IL-10 and IL-27 compared to mature control DC (p = 0.04 and p = 0.005, respectively). In the peripheral blood of 14 patients (7 males and 7 females; age range, 53-81 years) with advanced myeloid malignancies (8 acute myeloid leukemia and 6 myelodysplastic syndrome) treated with 5-aza, there was a significant decrease of IL-4-secreting CD4(+) T cells (p = 0.001), and a significant increase of IL-17A- and IL-21-secreting CD4(+) T cells (p = 0.003 and p = 0.01, respectively, compared to 5 healthy donors) suggesting a Th17 response pattern in the blood of patients receiving 5-aza. In all, these data suggest potentially novel mechanisms of action of epigenetic therapies, such as 5-aza, which may have broader implications for immunotherapeutic strategies.