钩端螺旋体膜表面蛋白LipL41基因的克隆、序列分析及表达

目的:进一步分析钩端螺旋体LipL41的免疫原性.方法:通过PCR的方法,以我国特有的钩端螺旋体流感伤寒群临海型lin6株(56609)的DNA 为模板,扩增目的基因LipL41,克隆至pcDNA3载体上,以自动测序仪测序后进行序列分析,然后克隆至原核表达载体pGEX-5T进行原核表达,Western印迹分析其免疫原性.结果:获得长1 068 bp的片段,DNA序列分析表明该菌株的LipL41基因与文献报道具有很高的同源性(95.0％～99.4％),在大肠杆菌中获得了表达,并与抗钩端螺旋体血清反应.结论:该抗原为致病性钩端螺旋体所具有的保守性抗原成分,可能在钩端螺旋体病的诊断和预防中发挥作用.     

钩端螺旋体外膜蛋白研究现状

<正>钩端螺旋体病(leptospirosis,简称钩体病),是由致病性钩端螺旋体(简称钩体)引起的钩端螺旋体病(钩体病),是一种全球性自然疫源性疾病,广泛分布在世界各地。我国是受钩体病危害十分严重的国家,目前已发现有18个血清群75个血清     

钩端螺旋体外膜抗原基因OMPL1在卡介苗中的克隆和初步表达

采用ＰＣＲ技术直接从致病性钩端螺旋体整形０１７菌株基因组中扩增钩体外膜蛋白基因ＯｍｐＬ１，并克隆到大肠杆菌－卡介苗穿梭质粒载体ＰＨ６００２中，重组质粒经电转化导入卡介苗。玉点杂交筛选重组卡介苗，再通过免疫印迹对其表达进行初步研究。     

赖型钩端螺旋体017株外膜蛋白LipL32基因重组质粒的构建及其细胞毒性的研究

目的构建赖型钩端螺旋体(钩体)017株外膜蛋白LipL32基因的重组质粒,并研究其细胞毒性。方法从钩体017株全基因组中用PCR方法扩增出目的基因,双酶切构建重组质粒,转化大肠杆菌,诱导表达LipL32蛋白,将表达的目的蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,Western Blotting鉴定其免疫原性。将目的蛋白纯化、复性后作用于ECV304细胞,通过检测细胞的乳酸脱氢酶(LDH)、NO释放量研究其细胞毒性。结果扩增出816bp的LipL32基因,重组质粒经双酶切、PCR鉴定、测序均表明重组载体构建成功。经IPTG诱导表达的融合蛋白相对分子质量约52×103,主要以包涵体的形式表达,经免疫动物制备得到多克隆抗体,ELISA检测效价达1:32000,Western Blotting显示在目的蛋白位置处有特异性阳性条带。经过LipL32蛋白作用的ECV304细胞LDH、NO释放量和对照组比较有明显升高。结论成功构建LipL32基因重组质粒,该质粒能在大肠杆菌中表达,表达的目的蛋白对细胞有一定的毒性效应。     

钩端螺旋体LipL21基因真核表达载体pcDNA3.1(+)/LipL21的构建与鉴定

目的构建钧端螺旋体外膜脂蛋白LipL21基因片段的真核表达载体，寻找新的预防钧端螺旋体感染的候选疫苗。方法应用PCR技术从钧端螺旋体黄疸出血群赖型56601株基因组模板中扩增LipL21基因，纯化回收后克隆入pUCm-T载体，再亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋）。结果双酶切及测序鉴定证明成功构建了LipL21真核表达载体pcDNA3．1（＋）／LipL21，DNA测序显示重组质粒含有561bp的目的基因片段，读码框架正确，无碱基错配及移码突变。测序后结果经与GenBank登录的序列做blast比较，载体上所连目的基因片段序列与GenBank登录的LipL21基因序列完全一致。结论成功构建了钧端螺旋体LipL21基因真核表达载体pcDNA3．1（＋）／LipL21。     

钩端螺旋体外膜抗原基因OMPL1在卡介苗中的克隆和初步表达

采用ＰＣＲ技术直接从致病性钩端螺旋体（简称钩体）赖型０１７菌株基因组中扩增钩体外膜蛋白基因ＯｍｐＬ１,并克隆到大肠杆菌—卡介苗穿梭质粒载体ｐＹ６００２中,重组质粒经电转化导入卡介苗。斑点杂交筛选重组卡介苗,再通过免疫印迹对其表达进行初步研究。在所得６个重组卡介苗中,有３个表达了ＯｍｐＬ１基因产物,其中一个表达较强。该研究为发展新一代高效广谱的钩体基因工程疫苗打下了基础。     

问号状钩端螺旋体外膜单克隆抗体凝集反应特性的研究

Three McAb were produced against an outer envelope preparation from Leptospira, interrogans, serovar Lai by fusion of SP2/0 myeloma cells with immune BALB/c mice spleen cells. The fusion rate was 96% and the antibody positive rate was 50%. One of the hybridomas, E4B11C9, reacted with 13 of the 13 serovars of the Icterohaemorrhagiae serogroup in microscopic agglutination test (MAT) but did not react with the 18 representative serovars of L. interrogans and L. biflexa serovar patoc and Leptonema illini. For all non-reactive serovars the MAT titres were greater than 1:25. The McAb, E4B7G5, reacted similarly with all serovars except smithi and tonkini. E4B7D4 reacted also similarly with all serovars except serovars birkini, ndambari, bogvere, smithi and tonkini. Therefore, 3 McAb showed serogroup specificity and partial serogroup specificity by agglutination. The agglutination titres were high and hybridomas were stable, so it might be useful in providing a simple, rapid method for the classification and identification of clinical isolates such as pathogenic L. interrogans in place of the complicated and time-consuming conventional methods.     

钩端螺旋体赖型017株外膜脂蛋白LipL41基因的克隆及原核表达

目的 构建钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL41基因的重组原核表达质粒,为进一步制备以LipL41为目的基因的亚单位免疫苗提供实验依据。方法 根据钩端螺旋体L.kirscneri RM52株外膜脂蛋白LipL41基因序列设计引物,以赖型钩端螺旋体017株基因组DNA为模板,进行PCR扩增并DNA测序,以质粒pGEX1λT为载体,插入LipL41基因片段构建重组原核表达质粒,并检测LipL41的表达。结果 测序结果示所得片段为LipL41的编码序列,酶切及PCR分析证实重组质质构建成功,SDS－PAGE和Western blotting分析重组质粒可高效表达蛋白质LipL41。结论 LipL41基因的重组原核表达质粒构建成功,并可在大肠杆菌中高效表达。     

钩端螺旋体赖型017株外膜脂蛋白LipL41基因的克隆及原核表达

目的　构建钩端螺旋体外膜脂蛋白 L ip L41基因的重组原核表达质粒 ,为进一步制备以 L ip L41为目的基因的亚单位疫苗提供实验依据。方法　根据钩端螺旋体 L.kirscneri RM5 2株外膜脂蛋白 L ip L41基因序列设计引物 ,以赖型钩端螺旋体 0 17株基因组 DNA为模板 ,进行 PCR扩增并 DNA测序 ,以质粒 p GEX1λT为载体 ,插入 L ip L41基因片段构建重组原核表达质粒 ,并检测 L ip L41的表达。结果　测序结果示所得片段为 L ip L41的编码序列 ,酶切及 PCR分析证实重组质粒构建成功 ,SDS- PAGE和 Western blotting分析重组质粒可高效表达蛋白质 L ip L41。结论　 L ip L41基因的重组原核表达质粒构建成功 ,并可在大肠杆菌中高效表达     

黄疸出血群赖型017株钩端螺旋体外膜单克隆抗体免疫...

BALB/c mice were immunized intraperitoneally with outer envelopes of serogroup icterohaemorrhagiae lai serovar strain 017 leptospires. Monoclonal antibodies against outer envelopes (IgG, agglutinating titre 1:25,600) were produced by hybridoma technique. The monoclonal antibodies ascites (diluted 1:100) 1 ml administered intraperitoneally 1 hour before the intraperitoneal injection of 2 x 10(8) leptospires of strain 017 and the subsequent daily administration of McAb in similar doses for five days protected 80% of guinea pigs. Survival rates of three control groups which received physiological saline, ascites of BALB/c mouse myeloma cell lines SP2/0, and monoclonal antibodies against Pseudomonas aeruginosa in place of monoclonal antibodies against outer envelopes of strain 017 leptospires were 10%, 20% and 10% respectively. When killed 20 days after challenge, guinea pigs of experiment group were normal at autopsy. Old pulmonary haemorrhage were present in the animals of three control groups. Passive immunoprotection experiments have demonstrated immunoprotection of monoclonal antibodies against outer envelopes of strain 017 leptospires. It will be valuable for separating protective antigen fraction of outer envelopes and studying new vaccine of leptospira.     

重组钩端螺旋体外膜蛋白酶联免疫吸附(ELISA)检测方法的建立

目的建立以重组外膜蛋白为基础的钩端螺旋体抗体间接ELISA检测方法。方法以基因重组技术获取重组钩端螺旋体外膜蛋白LipL32,以该蛋白为抗原,特异的钩体抗血清进行ELISA方阵滴定、交叉性试验、阻断试验,并对北京地区的70份犬血清使用建立的ELISA方法以及德国Virion公司的全菌体钩端螺旋体ELISA试剂盒进行相互验证。结果方阵滴定试验确立以100ng/孔为抗原包被浓度,1∶160为血清稀释度。交叉性试验具有广泛性、阻断试验标明该方法特异性强、灵敏度高。两种方法数据经χ2检验,两者检出率之间差异不显著。结论重组LipL32蛋白具有结合活性。初步建立了以重组LipL32蛋白为抗原的钩端螺旋体抗体间接ELISA检测方法。     

问号赖型钩端螺旋体内鞭毛蛋白与外膜蛋白基因融合DNA疫苗载体的构建

目的　为增强问号赖型钩端螺旋体 (钩体 0 17株 ) DNA疫苗内鞭毛蛋白基因 (fla B2 )与外膜抗原基因 (omp L1 )的免疫保护作用 ,构建一种能表达 fla B2 与 om p L1 蛋白融合蛋白的 DNA疫苗载体。方法　通过聚合酶链反应分别扩增 0 17钩体 fla B2 与 omp L1 片段并进行融合 ,获得的嵌合基因 om p L1 - fla B2 中含有 10个氨其酸的中间接头序列 ,以维持其空间构象。结果　经酶切鉴定 ,证实有一 1.8kb片段插入载体 ,其 fla B2 及 om p L1 DNA测序结果与文献报道的一致。结论　表达 0 17株钩体 fla B2 与 om p L1 抗原融合蛋白的 DNA疫苗载体构建成功     

淋球菌外膜蛋白PI基因重组子的构建和表达

目的 扩增四株淋球菌外膜蛋白PI基因，构建pET30b-PI-NG重组子，在大肠杆菌中诱导表达外膜蛋白PI．方法 采集临床淋球菌四株，提取细菌基因组DNA，PCR扩增外膜蛋白PI基因，与克隆载体pBS-T连接，构建pBS-T-PI-NG重组子，测序，目的基因插入表达质粒载体pET30h中，构建pET30h-PING重组子，转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导蛋白质表达，SDS-PAGE初步分析．结果 成功构建了四株淋球菌的pET30b-PI大肠杆菌表达重组子，经IPTG诱导表达后，其中三株获得表达的目的蛋白PI。结论 本研究为PI蛋白免疫学特性的研究、抗体制备、以及预防淋病疫苗的研制莫定了基础。     

钩端螺旋体外膜蛋白Loa22免疫血清与不同血清型钩端螺旋体的交叉免疫反应

目的探讨钩端螺旋体(钩体)外膜蛋白Loa22免疫血清与不同血清型钩体间的交叉免疫反应作用,为筛选钩体候选疫苗分子提供依据。方法制备钩体重组Loa22蛋白、LipL32蛋白豚鼠免疫血清,以LipL32免疫血清为阳性对照,未免疫豚鼠为阴性对照,ELISA测定与我国常见的各血清型钩体株的交叉反应的Loa22蛋白免疫血清效价。结果与钩体犬群犬型56603株、致热群致热型56605株、澳洲群澳洲型56607株、波摩那群波摩那型56608株、流感伤寒群临海型56609株、七日群七日热型56610株及明尼群明尼型56655株反应的钩体Loa22蛋白免疫血清效价分别为1∶81 920、1∶20 480、1∶40 960、1∶40 960、1∶40 960、1∶10 240和1∶10 240。结论Loa22蛋白免疫血清与不同血清型钩体有良好的交叉免疫反应性。     

赖型钩端螺旋体Loa22重组质粒的蛋白表达和对巨噬细胞的毒性作用

目的对赖型钩端螺旋体Loa22基因进行表达和功能研究。方法构建赖型钩端螺旋体Loa22成熟肽重组质粒,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS-PAGE和Western Blotting检测目标蛋白表达情况。经亲和层析获得目标蛋白并作用于小鼠巨噬细胞ANA-1,检测细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活力、四氮唑复合物(XTT)吸光度值和细胞凋亡率以评价其细胞毒性。结果成功构建Loa22成熟肽原核表达质粒,通过鉴定并纯化得到Loa22成熟肽,该蛋白使培养ANA-1细胞上清液中LDH活力升高,XTT吸光度值下降,细胞凋亡率增加。结论Loa22对ANA-1具有明显的毒性效性,该基因可能是致病钩体的一个重要毒力相关基因。     

赖型钩端螺旋体OmpA外膜基因Loa22重组卡介苗的构建及其免疫蛋白表达

目的 以赖型钩端螺旋体外膜蛋白A(OmpA)膜蛋白基因Loa22去信号肽基因片段构建重组卡介苗并对其免疫蛋白进行表达分析.方法 以赖型钩端螺旋体56601株全基因组DNA为模板,PCR扩增出Loa22成熟肽基因片段,与大肠杆菌-结核分枝杆菌穿梭整合质粒pMV361一起分别经过双酶切,连接,转化.筛选鉴定出阳性重组质粒rpMV361-loa22,电转化入BCG,经筛选鉴定后,热诱导表达,通过SDS-PAGE及Western Blotting鉴定其表达产物.分别用BCG、rBCG-pMV361、rBCG-loa22、Loa22蛋白、灭活全钩体免疫小鼠两次后,脱臼处死小鼠分离脾淋巴细胞,XTT比色法检测体外脾淋巴细胞增殖活性.结果 PCR扩增获得516 bp的片段,成功构建重组穿梭质粒rpMV361-loa22,经电转化构建重组卡介苗成功,热诱导表达出相对分子质量约19×10~3特异条带.体外脾淋巴细胞增殖实验证实rBCG-loa22可引起细胞反应,其增殖活性与BCG组和rBCG-pMV361组相比差异具有统计学意义(P<0.05).结论 成功构建了赖型钩端螺旋体重组卡介苗rBCG-loa22并高效表达具有免疫学活性的外膜蛋白Loa22,为新一代钩端螺旋体疫苗研究打下了基础.     

前列腺特异性膜抗原启动子调控的重组质粒的构建及表达

目的 探讨前列腺特异性膜抗原(PSMA)启动子调控目的基因表达的前列腺细胞特异性,为前列腺癌靶向性基因治疗作前期铺垫。方法 采用PCR方法从前列腺癌细胞DNA中扩增PSMA启动子序列,将其克隆到含有报告基因——增强绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒载体,脂质体介导基因转染不同癌细胞并观察EGFP在不同细胞的表达情况。结果 成功构建质粒pEGFP-PSMAm,质粒转染结果显示PSMA表达阳性的LNeap细胞中存在GFP的有效表达。结论 PSMA启动子调控EGFP表达的重组质粒的构建证明了PSMA启动子的基因转录启动与细胞PSMA的表达相关,即具有前列腺细胞特异性。     

布鲁氏菌外膜蛋白OMP31基因的克隆、表达和免疫学特性的初步研究

目的研究布鲁氏菌外膜蛋白OMP31的克隆、测序和表达,并对其进行初步的血清学鉴定。方法从布鲁氏菌基因组中获得OMP31基因连接入PMD-18T克隆质粒并测序,克隆入融合表达载体PGEX-4T-1,构建重组质粒PGEX-4T-1/OMP31,在大肠杆菌中将该蛋白表达。用Western-blot分析重组表达的GST-OMP31的免疫学特性。结果成功构建了PGEX-4T-1/OMP31原核表达载体并在大肠杆菌中表达了OMP31基因,布鲁氏菌免疫动物血清能特异性识别所表达的蛋白。结论成功表达了布鲁氏菌外膜蛋白OMP31基因,它可以与布鲁氏菌免疫血清产生特异性结合反应,为之后的抗原性以及免疫原性研究打下良好的基础。