小鼠窦前卵泡体外培养的研究

目的探讨不同直径的窦前卵泡的培养对获得成熟卵母细胞的影响。方法出生10天的小鼠窦前卵泡体外培养12 天。直径小于80μm的卵泡258个为A组;直径80-110μm的卵泡306个为B组。观察卵泡形态的变化,测量卵泡直径的变化。结果 A组卵泡成活率56．2％,窦腔形成率13．1％,卵母细胞成熟率11．7%;B组卵泡成活率89．5％,窦腔形成率51．8％,卵母细胞成熟率56．6％。B组卵泡成活率、窦腔形成率和卵母细胞成熟率显著高于A组(P<0．05,P<0．01,P<0．01)。A组卵泡直径(72．5±15．7)μm,培养后卵泡直径(246．3±22．2)μm(P<0．01);B组卵泡直径(101．7±20．1)μm,培养后卵泡直径(370．3 ±33．9)μm(P<0．05)。A组卵母细胞直径(52．3±4．4)μm,培养后卵母细胞直径(68．5±9．3)μm(P<0．01);B组卵母细胞直径(55．6±5．8)μm,培养后卵母细胞直径(71．9±5．7)μm(P<0．01)。结论出生10天小鼠窦前卵泡培养后可以得到第二次减数分裂中期(MⅡ期)卵母细胞;直径80μm以上的卵泡成活率,窦腔形成率,卵母细胞成熟率较高,培养效果较好。     

小鼠窦前卵泡的体外培养

目的 观察性成熟前小鼠的窦前卵泡体外培养的形态学改变,同时评价激素及生长因子等添加物对窦前卵泡体外发育的影响。方法 机械法分离性成熟前小鼠卵巢中的窦前卵泡,分2组培养于20μL培养液滴内。(1)Gn组:α-MEM 10％FCS 100 mU/mL rFSH±ITS(5 μg/mL insulin,5 μg/mL transferrine,5 ng/mLselenium)±10 mU/mL rLH,第12天移入 α-MEM 1.5 U/mL rHCG 5 ng/mL rEGF 10％ FCS。(2)nGn组:α-MEM 10％ FCS。每天换液观察,记录GC增生、窦形成等形态学改变和卵母细胞成熟情况。结果 激素组窦前卵泡增长明显,92.92％存活,28.65％形成窦,培养14d后40.35％排出成熟卵;而无激素组窦前卵泡生长缓慢,生存6d后开始萎缩、变黑,存活率仅10.91％,无窦卵泡形成,仅11.11％排出成熟卵,差异有显著意义(P<0.01)。激素组在添加ITS、LH后,窦前卵泡的窦形成率和排出成熟卵母细胞率均显著上升(P<0.05)。结论 α-MEM可作为窦前卵泡体外培养液,但必须添加rLH/rFSH、ITS、rHCG/rEGF以促进膜细胞黏附、颗粒细胞增生和卵母细胞成熟。     

培养环境的温度变化与人MII期卵母细胞纺锤体形态学变化的关系

目的：观察环境温度的改变对MII期人卵纺锤体结构的影响，方法：40例非男性因素的不孕妇女，将常规体外授精后未受精的MII期卵子置于室温（23-250c）直至纺锤体消失，于纺锤体消失后，将卵子分成3个实验组：1组纺锤体消失后立即复温（n=8）；2组纺锤体消失后室温下静置5min再复温（n=6）；3组纺锤体消失后室温下静置10min再复温（n=6），卵子复温后5min，10min，2h分别观察纺锤体的复现情况。结果：20个未受精的MII期卵子置于室温下5min内纺锤体均消失，1组中的8个卵子，2组中的6个卵子复温后再次观测到了MII期纺锤体，3组中的6个卵子只有3个卵子再次出现了MII期纺锤体，对照组的18个卵子放置于37℃恒温板上观察30min，纺锤体均未见消失。结论：MII期卵子纺锤体对环境温度的改变非常敏感．温度降低将导致纺锤体消失，随着时间的延长，纺锤体复现几率明显减少。     

昆明小鼠成熟卵母细胞体外受精及受精卵体外培养的研究

目的通过比较获能受精液成分及成熟卵母细胞的处理方法，观察对昆明小鼠体外受精(IVF)效果的影响和用于早期胚胎培养的三种发育培养液培养效果，探讨并建立起适合于昆明小鼠卵子体外受精与受精卵体外发育的实验体系。方法用T6或FM两种获能受精液对采自昆明雄鼠附睾尾的精子与成熟卵母细胞进行体外受精(IVF)，受精前对成熟卵母细胞选用透明质酸酶去除卵丘细胞和不去卵丘细胞(对照组)两种方法进行处理，受精卵分别用M16、改良的CZB液(mCZB)和改良的M16液(mM16)三种发育培养液对体外受精胚进行培养。结果选用FM获能受精液的受精率极显著高于T6液(92．3％对64．7％)，且体外受精前先用透明质酸酶处理的成熟卵母细胞比对照组成熟卵母细胞受精率要低(59．2％对64．7％)，但差异不显著；用mM16培养液进行培养时桑胚率及囊胚率(55．3％和35．6％)显著高于mCZB(13．3％和8．1％)和M16培养液(17．3％和14．7％)，后两者差异不显著。结论昆明小鼠卵子体外受精时宜选用FM受精获能液，不宜用透明质酸酶去除卵丘细胞，且宜选用mM16培养液对昆明小鼠体外受精卵进行早期培养，其中的亚硫磺酸钠可有效的克服2-细胞胚后的体外发育阻滞现象。     

培养环境的温度变化与人MⅡ期卵母细胞纺锤体形态学变化的关系

目的:观察环境温度的改变对MⅡ期人卵纺锤体结构的影响.方法:40例非男性因素的不孕妇女,将常规体外授精后未受精的MⅡ期卵子置于室温(23～25℃)直至纺锤体消失.于纺锤体消失后,将卵子分成3个实验组:1组纺锤体消失后立即复温(n=8);2组纺锤体消失后室温下静置5 min再复温(n=6);3组纺锤体消失后室温下静置10 min再复温(n=6).卵子复温后5 min,10 min,2 h分别观察纺锤体的复现情况.结果:20个未受精的MⅡ期卵子置于室温下5 min内纺锤体均消失.1组中的8个卵子,2组中的6个卵子复温后再次观测到了MⅡ期纺锤体.3组中的6个卵子只有3个卵子再次出现了MⅡ期纺锤体.对照组的18个卵子放置于37℃恒温板上观察30 min,纺锤体均未见消失.结论:MⅡ期卵子纺锤体对环境温度的改变非常敏感.温度降低将导致纺锤体消失,随着时间的延长,纺锤体复现几率明显减少.     

Synaptotagmin1影响小鼠卵母细胞纺锤体组装和稳定

目的:确定Synaptotagmin1(Syt1)对小鼠卵细胞纺锤体组装和稳定的影响。方法:免疫荧光法检测Syt1在小鼠卵母细胞发育不同时期的亚细胞定位。用紫杉醇处理小鼠MⅠ期卵母细胞,明确Syt1与微管动力的关系。注射Syt1特定的寡聚核苷酸降调卵母细胞中Syt1的表达,免疫荧光法检测Syt1降调后卵母细胞纺锤体的形态变化、染色体异常以及中心体蛋白γ-tubulin定位变化。结果:Syt1在卵母细胞减数分裂成熟的不同发育阶段都有表达,主要集中分布皮质区和MⅠ和MⅡ期纺锤体的两极。Syt1在MⅠ和MⅡ期与中心体相关蛋白γ-tubulin共定位。紫杉醇实验发现Syt1集中定位于星体和高度集中的微管两极。降调Syt1表达后,染色体排列紊乱,纺锤体组装异常比例升高,且大多数为无极、单极或者多级纺锤体,其次有拉长纺锤体和形态各异纺锤体。并影响微管组织中心相关蛋白γ-tubulin的正确定位。结论:Syt1可能作为一种微管组织中心相关蛋白调节纺锤体的组装稳定。     

第一极体不能精确定位人卵母细胞纺锤体

目的 观测人卵母细胞纺锤体的确切位置,从而指导今后的生殖医学临床工作。方法 应用纺锤体成像系统观测体外成熟及体内成熟组人卵母细胞纺锤体,测量卵子中心、纺锤体与第一极体之间形成的角度。比较两组结果的差异。结果 体外成熟组纺锤体与第一极体形成角度和体内成熟组存在显著差异(P=0.006)。结论 人卵母细胞的位置并不能准确定位卵母细胞纺锤体的位置。体外成熟组纺锤体与第一极体形成的角度要明显小于体内成熟组。应用纺锤体成像系统可以安全、有效地观察人卵母细胞纺锤体。     

蔗糖浓度对GV和MⅡ期冻融卵母细胞纺锤体结构的影响

目的 探讨蔗糖浓度对GV期和MⅡ期冻融卵母细胞纺锤体质量的影响.方法 运用纺锤丝观测仪(PolScope)、免疫荧光标记技术和激光共聚焦显微镜.对不同蔗糖浓度(0.1-0.6 mol/L)下GV期和MⅡ期冻融卵母细胞体外成熟后的纺锤体分别进行检测,以未冷冻处理的卵母细胞作为对照组.结果 与对照组比较,冻融组卵母细胞纺锤体的排列明显受到影响.蔗糖浓度为0.3 mol/L时,GV期冻融组卵母细胞纺锤体的正常率最高(P＜0.05);蔗糖浓度为0.5 moL/L时,MⅡ期冻融组卵母细胞纺锤体的正常率最高(P＜0.05);当蔗糖浓度继续升高时,冻融组GV期和MⅡ期卵母细胞纺锤体的正常率则显著下降(P＜0.05).冻融组卵母细胞纺锤体的正常率,MⅡ期显著高于GV期(P＜0.05).结论 一定浓度范围的蔗糖可提高冻融卵母细胞纺锤体正常率;MⅡ期冻融卵母细胞的渗透耐受性及其在渗透耐受范围内的冷冻效率均高于GV期卵母细胞.     

氯化锌对小鼠卵母细胞体外成熟的影响

目的探讨氧化锌对小鼠卵母细胞体外成熟的影响。方法采用细胞体外培养的方法,观察卵母细胞在分别含有低、中、高浓度(0μg/ml、1μg/ml、10μg/ml)氯化锌的M199培养液中体外成熟率和减数分裂的变化情况。结果1μg/mlZnCl2组GVBD发生率在4、8h明显高于对照组(P<0.01),16、24h高于对照组(P<0.05);而10μg/mlZnCl2组GVBD发生率在各时间点均明显低于对照组(P<0.01)。8h后,1μg/mlZnCl2组PB1排出率明显高于对照组(P<0.05),而10μg/mlZnCl2组PB1排出率明显低于对照组(P<0.05)。结论锌对体外小鼠卵母细胞成熟和减数分裂有重要的影响。     

硝酸铅,氯化镍对体外培养小鼠卵母细胞成熟的影响

采用卵母细胞体外的方法研究了硝酸铅、氯化镍对小鼠卵母细胞成熟的影响。结果表明,硝酸铅、氯化镍都能抑制小鼠卵母细胞第一极体的释放,降低卵母细胞的质量和体外存活率,但是对卵母细胞生发泡破裂没有影响,提示,硝酸铅、氯化镍有明显的生殖毒性。     

乳鼠成骨细胞体外培养

目的建立乳鼠成骨细胞体外培养方法,探讨该方法的可行性和应用价值。方法用出生1~3 d乳鼠颅骨,采用多次胶原酶消化法进行细胞体外培养。倒置显微镜观察细胞形态,对其碱性磷酸酶(ALP)活性及矿化能力进行鉴定,并测定细胞生长曲线。结果原代培养24 h后,大量细胞贴壁生长,细胞呈圆形,48 h后,贴壁细胞呈长梭形、三角形或不规则多边形,并且贴壁细胞伸出2~3个突起,胞质透亮、饱满,7 d后细胞铺满整个平皿底面。经鉴定,培养细胞具有体内成骨细胞的生物学特性。细胞接种后第1与第2个24 h为细胞的潜伏适应期,第3与第7个24 h生长曲线基本为线性曲线,是细胞的对数生长期。结论采用胶原酶消化法分离培养成骨细胞的方法切实可行。     

小鼠受精卵显微注射影响因素的体外研究

目的:利用体外培养探讨受精卵显微注射的影响因素的作用。方法:获取小鼠受精卵,在其他条件固定的情况下,分别比较不同的注射基因浓度,在CZB(加HEPES)操作液中显微操作时间以及注射前受精卵的质量对显微注射后的胚胎体外培养结果的影响。结果:基因浓度越高,受精卵发育越差,操作时间不同的卵发育无明显差异,质量好的受精卵发育较好,质量差的几乎不发育。结论:选用较低的基因浓度,良好的操作介质CZB(加HEPES),使用质量好的受精卵,会提高显微注射的效率。     

Experimental Study on Meiotic Spindles and Chromosomes of Mouse Mature (MⅡ) Stage Oocytes under Laser Scanning Confocal Microscopy

Taking the mouse as a model, the experimental method of observing the morphology of meiotic spindles and chromosomes in mature oocytes were investigated in order to evaluate the effects of various interventions on the quality of oocytes accurately and rapidly. Laser scanning confocal microscope (LSCM) was used to examine the meiotic spindles and chromosomes by the technologies of optical section and three-dimensional (3D) image reconstruction. The results showed that the configurations of meiotic spindles and chromosomes could be observed clearly by LSCM.The normal rate of meiotic spindles and chromosomes was 82% and 86% respectively. It was concluded that the LSCM was a valid instrument to observe the meiotic spindles and chromosomes of mature oocytes and could be used as a valid method to evaluate the quality of M Ⅱ oocytes.     

不同成熟状态小鼠树突状细胞的体外诱导

目的：体外诱导小鼠骨髓来源的不同成熟状态树突状细胞(dendritic cells，DCs)。方法：rmGM—CSF体外培养小鼠骨髓细胞，5～6d后，利用磁性细胞分离器(MACS)分离CD11C^ 细胞，部分细胞加入rmTNFα继续培养1～2d，通过流式细胞仪检测分别检测细胞表面标志，同种混合淋巴细胞反应检测细胞的体外刺激能力。结果：小鼠骨髓细胞经rmGM-CSF培养5～6d，再经过MACS分离可获得大量未成熟DCs，细胞表面出现少量短而粗的突起，低水平表达MHCI／分子和共刺激分子CD80、CD86及CI40，刺激同种CD4^ T细胞的混合淋巴细胞反应能力较弱：加入rmTNFα继续培养可获得成熟DCs，细胞表面出现大量细长突起，细胞表面高水平表达MHC Ⅱ分子和共刺激分子CD80、CD86及CI40，刺激同种CI4^ T细胞的混合淋巴细胞反应能力较强。结论：通过rmGM-CSF或rmGM-CSF rmTNFα体外培养体系可以获得大量未成熟DCs或成熟DCs，为进一步研究DCs的生物学功能提供实验基础。     

小鼠卵母细胞电激活的实验研究

目的寻找用电激活方法作小鼠体细胞克隆的适宜卵龄的卵母细胞及电激活参数。方法在0．6kV／cm、80us、2个电脉冲（2p）下，比较了注射人绒毛膜促性腺激素（HCG）后13、16、19、22h卵母细胞的激活率、碎裂＋死亡率。在上述相同电脉冲下，统计了经体外培养（IVC）和新鲜的卵龄为16、19、22h的卵母细胞的激活率，碎裂＋死亡率；比较了场强分别为0．6、0．9、1．2、1．5、1．8kV／cm，电压时程分别为10、20、40、80、100、150、200 us，2P对注射HCG后16h卵母细胞的电激活效果。结果注射HCG后16、19h卵母细胞电激活率较高，分别为63．6％和76．7％，经体外培养后激活率下降，碎裂＋死亡率明显增加。在0．9kV／cm、80／100us，2P时激活率达70％～80％。在1．2kV／cm、40／80／100us、2P时，激活率达到了80％左右，碎裂＋死亡率低于16％。结论注射HCG后16h的卵母细胞为适宜的小鼠核移植的受体细胞。0．9kV／cm、80／100us，2P及1．2kV／cm、40／80／100us、2P为适宜的电激活参数。     

RNAi在小鼠卵母细胞和胚胎发育研究中的应用

RNA干扰（HNAi）由双链RNA（daRNA）介导的、序列特异地引起转录后基因沉默的现象，是生物体内抵御转座子和病毒感染的重要保护机制之一，也是在生长发育过程中调节内源基因表达的重要途径。RNAI可作为一种简单有效的代替基因剔除的工具应用于功能基因组学和疾病的基因治疗研究。现综述RNAi机制、作用特征及RNAi相关技术在小鼠卵母细胞和胚胎发育研究中的应用。     

三种不同来源人未成熟卵母细胞的体外成熟

目的：探讨三种不同来源的人未成熟卵母细胞体外成熟（IVM）的差异。方法：共获得未成熟卵母细胞1055枚,包括卵丘复合物（OCC）613枚和裸卵（DO）442枚。其中OCC分为自然周期组、孕晚期组和IVM纽;DO分为自然周期组、孕晚期组和超促排卵纽。所有未成熟卵母细胞在IVM培养体系体外培养成熟后,卵母细胞胞浆内单精子注射（ICSI）受精序贯培养,除IVM组行第2或第3天胚胎移植外,其余均培养至囊胚阶段。分别比较OCC和DO各组未成熟卵母细胞的成熟率、成熟卵母细胞的受精率、卵裂率;自然周期组和孕晚期组的囊胚形成率。结果：OCC：自然周期组、孕晚期组及IVM组的未成熟卵母细胞体外成熟率分别为79．5％、74．3％和82．2％,孕晚期组与IVM周期组相比具有统计学差异;3组成熟卵母细胞受精率、卵裂率及自然周期组和孕晚期组的囊胚形成率相比无统计学差异,IVM组的移植周期妊娠率为20％。DO：自然周期组、孕晚期组及超促排卵组未成熟卵母细胞体外成熟率超促排卵组最高（86．0％）,明显高于自然周期组（74．5％）和孕晚期组（72．7％）,（P〈0．05和〈0．01）。3组未成熟卵母细胞的成熟率、成熟卵母细胞的受精率、卵裂率、囊胚形成率相比未见统计学差异。结论：孕晚期来源的未成熟卵母细胞在体外同样具有发育潜能;孕晚期的卵母细胞可作为一种供卵来源。     

改进的EBSS培养液与常用商品化试剂对鼠胚体外发育的影响

目的：利用改进后的EBSS(SIGMA)培养液和常用商品化培养液G1/G2（Vitrolife）,Quinn's1026/Quinn's1029（SAGE）对昆明系小白鼠胚胎进行体外培养,以对新建IVF实验室进行评估。方法对简单培养液EBSS进行改进,分别制得卵裂培养液和囊胚培养液以构成序贯培养系统。卵裂培养液：EBSS中加入适当浓度的丙酮酸钠,乳酸钠以及5种非必须氨基酸;囊胚培养液：EBSS中加入适当浓度的5种非必须氨基酸及6种必须氨基酸。将胚胎分成4组,A组使用EBSS（Earle's Bal-anced Salt Solution）培养液,B组使用改进后的EBSS培养液,C组使用G1和G2培养液,D组使用Quinn's1026和Quinn's1029培养液,四种培养液均添加10%人血清白蛋白。结果72 h后,鼠胚总体囊胚形成率为70.57%（614/870）,其中A组的囊胚形成率为26.21%（27/103）,B组为72.22%（143/198）,C组为73.81%（155/210）,D组为80.50%（289/359）B,C,D 3组的囊胚形成率显著高于A组（P<0.001)。结论通过鼠胚体外培养,对新建试管婴儿实验室进行了较好的质控检测,经改进后的EBSS培养液在鼠胚囊胚形成率上与商品化序贯培养液G1/G2,Quinn's1026/Quinn's1029相近,均远高于简单培养液EBSS,但前者成本较之常用商品化试剂有大幅度的降低,说明改进的EBSS培养液在鼠胚体外培养上具有较好的实用价值。     

蔗糖浓度对GV和MⅡ期冻融卵母细胞纺锤体结构的影响

目的 探讨蔗糖浓度对GV期和MⅡ期冻融卵母细胞纺锤体质量的影响.方法 运用纺锤丝观测仪(PolScope)、免疫荧光标记技术和激光共聚焦显微镜.对不同蔗糖浓度(0.1-0.6 mol/L)下GV期和MⅡ期冻融卵母细胞体外成熟后的纺锤体分别进行检测,以未冷冻处理的卵母细胞作为对照组.结果 与对照组比较,冻融组卵母细胞纺锤体的排列明显受到影响.蔗糖浓度为0.3 mol/L时,GV期冻融组卵母细胞纺锤体的正常率最高(P＜0.05);蔗糖浓度为0.5 moL/L时,MⅡ期冻融组卵母细胞纺锤体的正常率最高(P＜0.05);当蔗糖浓度继续升高时,冻融组GV期和MⅡ期卵母细胞纺锤体的正常率则显著下降(P＜0.05).冻融组卵母细胞纺锤体的正常率,MⅡ期显著高于GV期(P＜0.05).结论 一定浓度范围的蔗糖可提高冻融卵母细胞纺锤体正常率;MⅡ期冻融卵母细胞的渗透耐受性及其在渗透耐受范围内的冷冻效率均高于GV期卵母细胞.     

体外扩增大鼠肌源性干细胞的安全性研究

目的:研究经体外扩增的大鼠肌源性干细胞的安全性,为将来肌源性干细胞移植治疗压力性尿失禁的临床应用提供参考。方法:分离培养出大鼠肌源性干细胞,在体外传代培养,对传至第10代(PP6-10)的细胞进行刀豆球蛋白A(ConA)凝聚实验、双层软琼脂培养实验初步分析细胞表面结构和生长特性是否发生恶变;采用免疫细胞化学的方法检测PP6-10的端粒酶活性以及c-myc,p53,c-fos肿瘤相关基因的表达情况;采用裸鼠皮下致瘤实验观察其是否具备致瘤性。结果:体外培养至第10代以内的大鼠肌源性干细胞在培养瓶底分布均匀,贴壁后多为纺锤形或梭形,与原代培养的肌源性干细胞形态相比无明显改变;在不同浓度的ConA溶液中,PP6-10均未产生凝聚反应;将PP6-10置于双层软琼脂中培养12d,未见细胞克隆形成,培养至20d,细胞数量明显减少;通过免疫细胞化学方法检测PP6-10中的c-myc,p53和c-fos等肿瘤相关基因的表达结果均为阴性,PP6-10中的端粒酶逆转录酶(hTERT)的表达结果呈弱阳性;将不同浓度的PP6-10接种于裸鼠皮下,观察4个月后接种部位没有肿块形成,病检其接种部位以及肝脏、肺脏均无异常表现。结论:大鼠肌源性干细胞体外培养至第10代后没有发生突变,不具备体内致瘤性,初步证实了体外传至第10代的大鼠肌源性干细胞的安全性。