PCR在猴艾滋病模型中检测SIV基因的应用

我们设计了两对特异的聚合酶链式反应(PCR)扩增SIV基因的引物，建设了SIV感染的PCR基因扩增检测法，实验结果表明，PCR方法可检出0．01Pg水平的SIV基因．PCR法、检测与病毒分离相比较，PCR检查敏感性高，特异性强，特别是恒河猴实验感染后期，病毒分离多为阴性，而PCR检查均获阳性结果。PCR基因扩增检测法应用于猴艾滋病模型的研究．将有助乎艾滋病药物的体内实验治疗和艾滋病疫苗的效果评价。     

猴免疫缺陷病毒(SIV)实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立快速、敏感、特异的猴免疫缺陷病毒(SIV)TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,对SIV病毒核酸进行定量检测。方法 RT-PCR扩增SIVmac251保守gag基因序列796 bp片段,进行TA克隆,构建标准品质粒pMD-SIVgag。通过对SIV定量外标准品的定量分析,优化反应体系,检测TaqMan探针实时荧光定量PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。结果所建立的SIV QPCR检测方法,质粒DNA模板在107～102拷贝之间表现较好线性和相关性,标准曲线所得斜率为-3.26,相关系数为0.999。检测灵敏度达到200拷贝,方法重复性测试,检测25份临床样品CV%均小于1%。结论建立的SIV QPCR检测方法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)核酸拷贝量。     

SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法测定猴免疫缺陷病毒(SIV)前病毒DNA拷贝数方法的建立

目的建立SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量PCR方法，测定猴免疫缺陷病毒（SIV）前病毒DNA。方法巢式RT-PCR扩增SIVmac251病毒RNA gag基因上1360-1837之间的长度为477bp的片段，将该片段克隆到pGEMT载体上，构建pGEM-SIV gag477质粒。该质粒经大量扩增纯化后定量，10倍系列稀释后，做出标准曲线，作为SIV前病毒DNA荧光定量检测的外标准品。结果应用Roche公司FastStart DNA Master SYBR Green Ⅰ Kit，该标准品可精确定量到10copies／μL。结论制备的pGEM-SIV gag477质粒外标准品纯度高，SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量PCR法特异性、敏感性高，稳定性好，可用于定量测定猴免疫缺陷病毒（SIV）前病毒DNA载量。     

猴免疫缺陷病毒(SIV)在艾滋病模型恒河猴组织中的分布和载量测定

目的研究当艾滋病恒河猴模型的血浆病毒载量处于低水平或阴性时,猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency viruses,SIV）在宿主组织中的分布情况。方法SIVmac251感染恒河猴10只,定期检测其血浆载量,感染病毒平均高峰时间第14天时,活检取淋巴结。选取感染18个月后病毒载量最低水平和阴性的2只艾滋病猴（SAIDS）,经安死术后取淋巴结、脾、肝、肺、肾、脑等组织,用原位杂交和实时荧光定量PCR的方法检测病毒在组织中的分布和组织中的病毒载量。结果感染后14d,10只猴血浆病毒载量达到10^7copies/mL,淋巴结组织病毒载量为10^5-10^8copies/g,原位杂交方法在腹股沟淋巴结中检测到强阳性斑点。感染后第18个月的2只猴,血浆病毒载量下降并维持不高于10^2copies/mL水平或阴性,但组织分布不尽相同,在肠系膜淋巴结、肾上腺、海马回、空肠、脾脏等组织中检测到10^5-10^6copies/g的病毒载量,于一只猴的脑积液中检测到10^3copies/mL的病毒载量。用原位杂交的方法在肠系膜淋巴结和空肠中检测到强阳性斑点,其它组织中未检测到阳性斑点。结论实验证实SAIDS猴在血浆病毒载量低甚至阴性时,病毒在不同组织中仍有分布,有些组织中甚至出现高病毒载量,提示在制备SIV/SAIDS模型中,尤其在药物筛选和疫苗评价时,应考虑组织病毒载量指标的测定和药物、疫苗对组织病毒的治疗清除作用的评价。     

嗜人T细胞白血病病毒Ⅰ型的PCR检测方法研究

目的 建立嗜人T细胞白血病病毒I型(HTLV-I) PCR检测方法.方法采集成人T淋巴细胞白血病(ALT)病人全血,分离外周血单核细胞(PBMCs),并与健康人PBMCs共培养分离HTLV-I;针对HTLV-I的gag和tax基因设计引物,进行PCR扩增,对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测HTLV-I.结果 凝胶电泳检测到HTLV-I前病毒DNA的gag和tax片断.结论 PCR法可快速、准确检测嗜人T细胞白血病病毒.     

Nested-PCR检测恒河猴泡沫病毒

目的 用nested-PCR检测恒河猴泡沫病毒SFV的前病毒形式.方法 从SFV-1的pol区域选择两对引物分别对原代猴肾细胞 (rhesus monkey kidney,RMK) 及猴外周血淋巴细胞 (peripheral blood lymphocytes,PBLs) 进行体外扩增,扩增产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳,证实其特异性.阳性对照使用具有典型泡沫样病变的RMK 377细胞株的前病毒DNA, 阳性对照的PCR扩增产物经测序证实,阴性对照为恒河猴的SRV-1 cDNA.结果 nested-PCR能快速灵敏的直接从猴外周血淋巴细胞检出SFV的前病毒形式,与RMK细胞培养结果基本相一致.结论 本实验所建立的检测SFV的nested-PCR法能快速准确的检测猴群中的SFV的带毒情况,对于提高实验猴的质量具有重要意义.     

全血及血浆病毒分离方法在SHIV-KB9感染猴模型中的应用

目的使用全血和血浆病毒分离方法分离SHIV-KB9感染标本,验证方法的可行性和敏感性。方法将SHIV-KB9感染恒河猴的血浆和全血标本与CEMx174细胞共培养,观察细胞病变,测定感染猴血浆病毒载量。结果全血病毒分离的滴度与血浆病毒载量测定结果趋势相符,高峰相同,但血浆病毒分离阳性分离率较低。结论全血病毒分离敏感性高于血浆病毒分离,可用于SHIV-KB9感染猴模型。     

SIVmac239毒株经静脉及直肠感染中国恒河猴的比较

目的研究猴免疫缺陷病毒SIVmac239毒株经静脉及直肠途径感染中国恒河猴后的生物学特性和症状表现,并比较由感染途径不同导致的差异,为该模型系统的应用提供依据。方法以SIVmac239毒株经静脉感染19只中国恒河猴,经直肠感染6只中国恒河猴,观察至感染后232或168d,比较其抗猴免疫缺陷病毒(SIV)特异性抗体滴度、CD4 T细胞数量、血浆病毒载量、淋巴结病理改变以及临床表现的变化。结果所有猴均出现SIV抗体阳转。在静脉感染猴,感染后10d检测到SIV特异的IgM,而直肠感染猴始终未能检测到。在感染后168d,静脉感染猴的SIV特异性IgG的平均水平较直肠感染猴高10倍。在观察期内,直肠感染组的CD4 T细胞数下降不如静脉感染组显著。所有猴的血浆SIV载量均在感染后10~14d达到高峰(107拷贝/ml左右),约2个月后降至平台期(103~106拷贝/ml)。2只静脉感染猴及1只直肠感染猴在感染后150~210d死于猴免疫缺陷综合征,呈快速进展型改变。结论SIVmac239毒株静脉及直肠感染接种中国恒河猴,均可建立慢性的SIV感染,其特征与人感染人类免疫缺陷病毒后的改变相似,均可以作为良好的研究获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的动物模型,尤其有助于预防性或治疗性AIDS疫苗的研究。     

SHIV病毒在猴体内的复制与传代

目的为建立SHIV艾滋病动物模型提供毒力较强的病毒株,将新合成的SHIV XJ02170病毒适应猴体,并增强其毒力。方法实验前采集猴血清并进行血清学检查和PCR检测。选出13只无SIV,STLV1,SRV D和B病毒感染的猴。第一批实验,将SHIV前病毒DNA质粒经肌肉注射到猴体内,每只500μg;SHIV病毒液,经静脉注射到猴体内,每只2ml。病毒质粒和病毒液各接种2只猴。当第一批猴体检出病毒后,10ml感染猴的全血,抗凝后静脉注射到第二批猴体内,当第二批猴检出病毒后再将10ml感染猴的全血静脉注射到第三批猴体内,连续传代4次。每批实验均定期采集血液标本,分别用肝素和EDTA抗凝,进行病毒分离;病毒基因PCR检测;CD4,CD8测定;病毒抗体检测。结果SHIV XJ02170病毒和SHIV XJ02170前病毒DNA质粒在猴体内的传代中均能分离出病毒;从传代猴的血浆和外周血单核细胞(PBMC)中检出了病毒DNA和RNA基因;CD4,CD8测定结果显示有暂时性倒置现象,后变为正常倒置与正常交替出现;在传代的猴血清中检测出特异性HIV病毒抗体。结论SHIV XJ02170病毒与SHIV XJ02170前病毒DNA质粒,均能在恒河猴体内复制。     

EMA-PCR技术快速鉴别死活腺病毒的初探

目的 探讨采用叠氮溴化乙锭（EMA）联合聚合酶链反应（PCR）快速鉴别死活腺病毒的方法。方法将不同稀释度的病毒接种至生长良好的单层细胞上,通过细胞病变效应（CPE）的发生情况计算病毒滴度;将3种腺病毒和新城疫鸡瘟病毒分别制备成106 PFU/mL的母液并梯度稀释备用,提取DNA后用PCR扩增后进行凝胶电泳,观察目的片段的扩增结果;分别用0 μg/mL、70 μg/mL、120 μg/mL和150 μg/mL的EMA处理灭活后的腺病毒,提取DNA进行PCR,观察目的片段的电泳结果;用120 μg/mL的EMA处理107 PFU/mL、106 PFU/mL、105 PFU/mL、104 PFU/mL、103 PFU/mL的腺病毒,观察PCR和凝胶电泳结果。结果 104 PFU/mL及以上滴度的病毒DNA PCR后得到阳性条带,其他滴度的病毒DNA PCR后未检测到阳性条带;3个型别的腺病毒（共8个分离株）的DNA均扩增出目的条带,新城疫鸡瘟病毒的DNA未扩增出目的条带;120 μg/mL及150 μg/mL的EMA抑制灭活腺病毒DNA 扩增,未得到阳性条带;120 μg/mL EMA不影响107 PFU/mL、106 PFU/mL、105 PFU/mL的腺病毒活病毒DNA扩增,得到阳性条带。结论 本研究证实EMA-PCR方法可快速鉴别死活腺病毒,能有效避免单纯PCR检测腺病毒产生的假阳性结果。     

SIV模型猴石蜡包埋淋巴结组织DNA的提取及病毒基因检查

从取材于３只ＳＩＶ感染治疗猴和４只ＳＩＶ艾滋病模型猴治疗前后的１１份石蜡包埋淋巴结活检组织中提成基因组ＤＮＡ，分别用ＰＣＲ和巢式ＰＣＲ方法检测ＳＩＶ病毒基因，ＰＣＲ共检出１０份阳性，巢式ＰＣＲ检测１１价样品均阳性，而同期采样的猴外周血标本病毒分离仅３份阳性，ＰＣＲ扩增产物的特异性用限制性内切酶酶切反应得到证实。实验说明，从淋巴结组织中检测ＳＩＶ的病毒基因较外周血病毒分离更能真实地反映病毒感染状况，本研究将对全面和正确评价艾滋病药吻和疫苗治疗效果提供帮助。     

恒河猴感染SARS-CoV的病毒学、血清学检测

目的对感染SARS-CoV的8只恒河猴进行病毒学、血清学指标检测。方法SARS-CoV经鼻腔接种8只恒河猴,在感染的第1天开始到5、7、10、15、20、30和60天分别安乐处死时,不同时间取咽拭子、血液和脏器,进行病毒分离,RT-PCR检测和抗体测定。结果RT-PCR证实感染病毒检出时间为5~16d,8只猴中的5只分离到了病毒,感染15d后可检测到抗体。结论感染SARS-CoV的恒河猴不仅出现与SARS患者类似的临床和病理学改变,也在一定时期内排毒,出现特异免疫反应,这些指标均可作为药物筛选、疫苗评价等方面的重要参数。     

聚合酶链反应检测汉坦病毒感染的实验研究

目的 早期诊断汉坦病毒感染。方法 根据国际标准株（７６－１１８,３９）Ｍ基因Ｇ１区设计两对公有引物和一条探针,按异硫酸氰胍－酚一步法提取汉坦病毒ＲＮＡ,采用ＲＴ－ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ检测病毒细胞培养上清原液及稀释液、１６份对照组血清、４０份ＨＦＲＳ急性期（１～５天）血清标本中的汉坦病毒ＲＡＮ,所有扩增产物采用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ或Ｄｏｔ ｂｌｏｔ证实其特异性。结果 汉坦病毒细胞培养液和４０份     

猴副流感病毒SV5的PCR检测方法建立及初步应用

[目的]建立检测SV5的PCR方法并加以初步应用。[方法]根据Genbank中报道的SV5序列,针对其中的SH基因设计引物进行PCR反应,扩增产物进行测序并用BLAST软件进行同源性比对,同时利用限制性内切酶的酶切反应以证实此PCR反应的特异性。在此基础上设计巢式PCR提高此方法的灵敏度。利用此方法对20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本进行检测。[结果]利用设计的引物扩增出的序列测序结果证实与报道的SV5SH基因相对位置的序列一致。AccIII限制性内切酶可对PCR产物进行特异性酶切。巢式PCR比一次PCR的敏感度有所提高。用此方法检测的20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本结果为阴性。[结论]本文首次初步建立了检测SV5病毒的PCR方法,排除实验室用20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本SV5的污染。     

α－干扰素对外周血单个核细胞中HBVDNA的清除作用

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法动态观来了α－干扰素治疗的６例慢性乙型病毒性肝炎患者外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）与血清中乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）ＤＮＡ的清除情况。血清ＨＢＶＤＮＡ在治疗５周后（３－１０周）６例转阴，其中２例在结束治疗时复转阳性，ＰＢＭＣ中ＨＢＶＤＮＡ在治疗１５周（１２－２０周）时５例转阴，１例始终阳性，并出现ＡＬＴ复升高。结果显示α－干扰素能清除ＰＢＭＣ中ＨＢＶＤＮＡ，但滞后于血清病毒的清除，ＰＢＭＣ中ＨＢＶＤＮＡ持续阳性，可能使治疗中期效果较差。     

HIV-1感染者外周血单个核细胞缺损病毒基因的研究

目的:研究HIV-1感染者缺损HIV-1 DNA的特性.方法:用长片段PCR法(LD-PCR)研究分析HIV-1感染者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear, PBMCs)和体外培养感染淋巴细胞中HIV-1基因特征,使用位于HIV-1 DNA链两端的LTR(U5)、LTR(R)为引物,插入有全长HIV-1基因片段的大肠杆菌质粒PNL4-3等为标准对照,并对部分标本克隆测序.结果:经扩增9.1 kb是LD-PCR的主要产物,但在10例HIV-1感染者中有9例PBMCs检测出大小不一、范围较广的缺失HIV-1基因片段,经用基因探针杂交,发现近HIV-1基因中心部位缺失频率增加,缺失结合点常存在3～4个核苷酸短片段直接重复,体外培养中HIV-1基因缺损量减少,完整和缺失基因的存在与培养中病毒分离的时间密切相关.结论:HIV-1感染者PBMCs中存在大量HIV-1基因重组和缺损片段.     

套式聚合酶链反应加限制酶谱分析检测母婴垂直传播巨细胞病毒

目的：克服一次性ＰＣＲ假阳性及非特异性条带干扰。方法：建立套式ＰＣＲ技术，对１０５份母－脐配对血进行套式ＰＣＲ、病毒分离、特异性ＩｇＭ以及特异性ＩｇＡ测定。结果：母血ＨＣＭＶＤＮＡ阳性６份，脐血３份，母－脐传播率为３／６。３对被证实为母婴垂直传播ＨＣＭＶ的标本中，２对套式ＰＣＲ、病毒分离、特异性ＩｇＭ及ＩｇＡ均阳性，１对套式ＰＣＲ病毒分离，特异性ＩｇＡ阳性，但特异性ＩｇＭ阴性。结论：套式ＰＣＲ是一种敏感特异、简便快速、能早期诊断ＨＣＭＶ的检测手段，适用于孕妇及胎儿ＨＣＭＶ感染的监测。     

扩增潜伏HIV-1 DNA序列实验方法的优化

目的对PCR扩增潜伏HIV-1DNA序列的实验方法进行优化。方法收集30例经高效抗逆转录病毒治疗（HAART）6~12个月的HIV-1感染者抗凝血标本,分别从外周血单个核细胞（PBMC）和高度纯化的CD4＋T细胞提取基因组DNA,巢式PCR扩增HIV-1env的C2-V5区,电泳检测扩增产物并进行DNA序列测定。结果同一患者PBMC纯化CD4＋T细胞标本扩增HIV-1env基因C2-V5区的效率（93.3%）明显高于直接从PBMC标本扩增该目的片段的效率（10.0%）。结论 PBMC纯化CD4＋T细胞后,再提取基因组DNA进行巢式PCR扩增,可提高扩增潜伏HIV-1DNA序列的效率。     

HBV逆转录酶mRNA在乙型病毒性肝炎病人 PBMCs中的表达

①目的 探讨乙型肝炎病毒（HBV）逆转录酶mRNA在乙型病毒性肝炎病人外周血单个核细胞（PMBCs）中的表达及临床意义。②方法 选择30例乙型病毒性肝炎病人，分别提取其PMCs中的总RNA，逆转录合成cDNA，设计引物进行PCR扩增以检测HBV逆转录酶mRNA的表达情况。③结果 30例乙型病毒性肝炎病人PBMCs中HBV逆转录酶mRNA的表达阳性率为13.3%（4 /30),慢性乙型病毒性肝炎病人表达阳性率为16.0%（4/25），其中慢性轻度，中度和重度乙型病毒性肝炎病人表达的阳性率分别为11.1%（1/9）、16.7%(1/6)、20.0%(2/10)，5例急性乙型病毒性肝炎病人表达均阴性。④结论 HBV逆转录酶mRNA在PBMCs中的表达与乙型病毒性肝炎的慢性及重症化有关。     

登革2型病毒E抗原基因的RT—PCR扩增及表达载体的构建

扩增并克隆登革２型病毒Ｅ抗原基因，构建Ｅ抗原基因表达载体。方法应用ＲＴ－ＯＰＣＲ法，基因克隆和限制性内切除酶酶切分析。结果增殖病毒标准株并提取病毒总ＲＮＡ。在登革２型病毒Ｅ抗原基因两侧疏水区设计一对ＰＣＲ引物。