人胚胎干细胞培养及其cDNA文库的构建

目的 构建人胚胎干细胞cDNA文库,为筛查疾病抗原基因奠定基础.方法 培养和收集人胚胎干细胞克隆,提取胚胎干细胞总RNA,分离纯化mRNA,利用mRNA作模板反转录合成双链cDNA,双链DNA经pfu-DNA聚合酶将链末端补平,与EcoRⅠ接头连接,XhoⅠ酶切消化产生粘端.用Sepharose CL2B柱分离纯化及除去小分子cDNA片段,与Uni-ZAP XR噬菌体连接,体外转化XL1-blue MRF菌,建成cDNA文库并计算重组效率.对cDNA文库进行扩增,测定扩增文库的滴度.阳性重组子用EcoRⅠ+XhoⅠ双酶切鉴定插入片段的大小.结果 构建成含1.2×106重组子的人胚胎干细胞cDNA文库,重组子插入外源DNA片段长度不小于1000 kb.结论 已成功构建人胚胎干细胞cDNA文库,适合用于筛选目的基因克隆.     

铁皮石斛互补脱氧核糖核酸表达文库的构建及分析

构建铁皮石斛互补脱氧核糖核酸(cDNA)表达文库,为克隆石斛活性成分生物合成相关功能基因的全长奠定基础。【方法】以Trizol一步法从4年生的铁皮石斛中提取总RNA,分离纯化mRNA,LD-PCR(long distance polymerase chain reaction)法反转录合成双链cDNA,以λTripIEX2为载体,构建铁皮石斛cDNA文库,文库滴度以每mL含噬菌斑形成单位 (pfu)的数目来表示,PCR扩增鉴定插入片段。【结果】成功地构建了铁皮石斛cDNA表达文库,原始文库的噬菌斑滴度为 4．3×105pfu/mL,总克隆数为3．1×105,重组率为97．6％,扩增后文库总滴度为6．8×109 pfu／mL,对随机挑取的噬菌斑进行 PCR鉴定,结果插入片段多分布在0．5～2．0kb之间,绝大部分在1．2～1．7 kb左右。【结论】文库质量鉴定结果表明,所构建的铁皮石斛cDNA文库具有较好的库容量、较高的重组率以及较大的插入片段。     

屋尘螨cDNA表达文库的构建及初步鉴定

目的构建屋尘螨cDNA表达文库. 方法用RNAiso Reagent试剂盒提取屋尘螨Total RNA,用Poly AT tract mRNA分离试剂盒提取mRNA,用Clontech公司SMARTTM PCR cDNA library kit反转录合成第1链cDNA,用LD-PCR合成第2链cDNA并扩增,PCR产物与MaxPlax TM试剂盒体外连接包装,建成未扩增的cDNA文库,计算其滴度和重组效率后进行文库扩增并测定扩增文库的滴度. 结果cDNA文库未扩增时滴度为9.148×106,重组效率达93.88%以上,文库扩增后滴度为7.628×109,插入片段平均1.63 kb. 结论成功地构建了高质量的屋尘螨cDNA表达文库.     

恒河猴(Macaca mulatta)肝脏cDNA文库的构建

目的 构建正常恒河猴的肝脏组织cDNA表达文库,以筛选恒河猴的相关基因并提供其作为医学研究动物模型的遗传学依据.方法 提取正常恒河猴肝脏组织总RNA,纯化的mRNA反转录合成cDNA,连接EcoR Ⅰ接头,经XhoⅠ酶切并用CHROMA SPIN-400分离cDNA,将大于500 bp的cDNA片段连接于λ ZAP表达载体,体外包装后转染至XL1-Blue MRF'宿主菌中,再扩增文库.对cDNA文库的滴度、重组率和插入片段的大小进行检测.结果 初始文库的库容量为1.2×106 pfu,初始文库和扩增文库的滴度分别为1.1×106 pfu/mL、 7.7×109 pfu/mL,重组率分别为99.3%、98.2%,插入片段平均长度分别为2.0 kb、2.3 kb.结论 成功构建了恒河猴肝脏组织的cDNA表达文库,为同种和异种移植以及移植相关药物临床前研究奠定了良好的基础.     

原发型肝癌组织cDNA文库的构建及抗原基因的筛选

目的 构建人原发型肝癌组织cDNA文库,以SEREX方法从cDNA文库中筛选肝癌抗原基因.方法 采用确诊的原发型肝癌患者新鲜手术切除癌组织构建cDNA文库,测定原始文库滴度,进行蓝白筛选以确定文库的重组率.以肝癌患者的血清,采用血清学方法筛选所构建的cDNA文库,阳性克隆经PCR检测鉴定后进行序列分析.结果 成功构建了混合原发型肝癌cDNA文库经测定原始文库滴度为7.42X106pfu/mL,含3.96×106个重组子,重组率为93%,扩增文库滴度为3.92×109pfu/mL,cDNA插入片段大小在0.5～3.0 kb之间.文库经3轮血清学筛选共获得31个阳性克隆,分别代表了24个独立的cDNA插入片段(抗原基因).其中17个与已知基因高度同源,另外7个基因与GenBank中已知基因的部分同源,其中有3个是新基因.利用SMART技术构建了高质量的人原发型肝癌组织cDNA表达文库,有利于以cDNA文库为基础的进一步的实验研究.结论 应用SEREX技术初步筛选原发型肝癌组织cDNA文库,共得到17个原发型肝癌相关抗原基因,其中有3个是新基因,可能为原发型肝癌的免疫学研究提供新的研究分子.     

人乙型肝炎肝硬化组织cDNA文库的构建及鉴定

目的:构建人乙型肝炎肝硬化组织cDNA文库,为筛查与乙型肝炎肝硬化的发生特异相关的基因及探讨乙型肝炎肝硬化的发病机制奠定基础.方法:用Trizol方法提取人乙型肝炎肝硬化组织总RNA,并用mRNA纯化试剂盒进行mRNA纯化;反转录合成单链cDNA,长距离PCR方法合成双链cDNA;PCR产物经蛋白酶K水解、纯化后,用Sfi I酶切;将酶切产物进行分级分离,回收0.4 kb以上的cDNA组分,并与λTripl Ex2载体连接;连接产物经体外蛋白包装,产生未扩增文库;鉴定文库的滴度和重组效率后,进行文库扩增;鉴定扩增文库的滴度和重组效率;随机挑取11个噬菌斑,用载体克隆位点两端的通用引物进行PCR扩增,以检测所构建的cDNA文库的质量.结果:未扩增文库滴度为1.03×106 pfu/ml,重组效率为97.24%,扩增后文库滴度为1.36×109 pfu/ml,重组效率为99.02%;用载体两端的通用引物进行PCR鉴定,插入片段平均长度为1.02 kb,含1 kb以上的占36.36%,0.5～1 kb的占63.64%.结论:已成功构建一高质量的人乙型肝炎肝硬化组织cDNA文库,为筛查与乙型肝炎肝硬化的发生特异相关的基因及探讨乙型肝炎肝硬化的发病机制奠定了基础.     

大肠癌抗原cDNA噬菌体表达库的构建及鉴定

目的 :构建人源性大肠癌抗原cDNA噬菌体表达文库 .方法 :从人大肠癌组织中提取总RNA ,纯化mRNA ,用RT PCR反转录合成cDNA第一链 ,用LD PCR合成cDNA第二链 ,除去小于 5 0 0bp的小片段 ,与去磷酸化的λTriplEx2噬菌体连接 ,体外包装 .转染E .coliXL1 Blue大肠杆菌 ,滴定文库的滴度 ,确定文库容量大小 ,用ITPG和X gal测定重组率 .用SfiⅠ酶切鉴定插入的cDNA片段大小 .结果 :构建成含 2 .39× 10 6重组子的人大肠癌抗原cDNA噬菌体表达文库 ,重组率为 97.5 % ,插入外源cDNA片段大小范围从 1～ 4kb ,平均长约 2 .4kb .结论 :成功构建人大肠癌抗原cDNA噬菌体表达文库 ,适合于大批量筛选cDNA克隆的大肠癌相关抗原基因     

小鼠破骨细胞前体细胞酵母双杂交筛选文库的构建

目的为研究巨噬细胞（Macrophage,Mφ）细胞在形成破骨细胞时细胞膜膜蛋白的表达及相互作用机制。方法C57BL/6小鼠长骨骨髓单个核细胞加入M-CSF和RANKL诱导形成破骨细胞,在Mφ细胞开始融合至形成破骨细胞的不同阶段开始收集细胞,提取总RNA,用CloneMiner TM cDNA文库构建试剂盒,采用Gateway非放射标记方法构建小鼠破骨细胞前体细胞全长cDNA文库及酵母表达文库,并将其转化酵母,观察其在酵母中的表达情况。结果构建的小鼠骨髓破骨细胞前体细胞cDNA入门文库滴度为6×106cfu/ml,库容量为3.5×107cfu,重组率为100%,重组子插入cDNA平均片段大小约为1.76kb。利用此入门文库构建的酵母表达文库,重组率100%,插入片段平均长度为1.82kb,绝大多数（87.5%）插入片段在1kb以上,酵母转化实验证实其可在酵母中完整表达。结论 Gateway非放射标记法构建的小鼠骨髓破骨细胞前体细胞cDNA入门文库和酵母表达文库均符合高质量文库要求,且可避免放射性物质的接触。     

HMy2细胞cDNA表达文库的构建和鉴定

目的 :构建人骨髓瘤细胞株HMy2cDNA表达文库 .方法 :提取HMy2细胞总RNA ,分离mRNA ,反转录合成双链cDNA ,消平cDNA末端 ,连接EcoRⅠ适配子 ,磷酸化EcoRⅠ适配子 5′端 ,Sephacryl S4 0 0柱除去小于 4 0 0bpcDNA片段 ,与去磷酸化的噬菌体λgt11连接 ,体外包装后建成cDNA文库 .取出一部分倍比稀释感染E .coliY10 90 ,测定文库大小、重组率 ,并以PCR鉴定cDNA插入片段的大小 .结果 :构建成含 1.5× 10 6重组子的人骨髓瘤细胞cDNA文库 ,重组子平均插入外源片段长约 1.4kb .结论 :所建文库合格 ,适合用于筛选目的cDNA克隆 .